林德海，劉晨珊，董迎輝，何琳，林志華*

(1.浙江萬里學院 浙江省水產(chǎn)種質資源高效利用技術研究重點實驗室，浙江 寧波 315100)

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縊蟶天然抗性相關巨噬蛋白2(Sc-Nramp2)基因克隆及其在副溶血弧菌刺激下的表達分析

林德海1，劉晨珊1，董迎輝1，何琳1，林志華1*

(1.浙江萬里學院 浙江省水產(chǎn)種質資源高效利用技術研究重點實驗室，浙江 寧波 315100)

克隆得到縊蟶天然抗性相關巨噬蛋白2(Sc-Nramp2)基因的cDNA全長序列3 681 bp，該基因的開放閱讀框有1 776 bp，編碼591個氨基酸，預測分子量為65.86 kDa；其結構具有Slc11蛋白家族的典型特征，包括有10個典型的跨膜結構和2個糖基化位點。Sc-Nramp2基因3′-UTR有2個類似于脊椎動物Nramp2中鐵反應控制蛋白結合位點；同源性分析表明，Sc-Nramp2和太平洋牡蠣Nramp2-like的同源性最高為71.6%。實時熒光定量PCR結果表明，Sc-Nramp2基因在閉殼肌、外套膜、肝胰腺、斧足、水管和鰓6個組織中均有表達，其中肝胰腺中的表達量最高，其次是鰓，與其他組織均有極顯著性差異(P<0.01)；注射副溶血弧菌后，肝胰腺中Sc-Nramp2基因的表達量較對照組顯著上調(P<0.01)，且表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在12 h時達到最大表達量，推測Sc-Nramp2基因參與了縊蟶非特異性免疫應答反應。

縊蟶；Sc-Nramp2；基因克??；副溶血弧菌；基因表達

1 引言

天然抗性相關巨噬蛋白(natural resistance associated macrophage protein， Nramp)也稱溶質轉運蛋白家族11(solute carrier family 11，SLC11)，是一類古老的膜整合轉運蛋白，含有10～12個典型的跨膜區(qū)、1個胞質內轉運蛋白特征結構域和1～2個糖基化的胞質外環(huán)狀結構，在各物種間保持高度保守性[1]。該家族包括Nramp1和Nramp2[2]，Nramp1主要特異性表達于巨噬細胞和組織網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)[3]，Nramp2則廣泛表達于大多數(shù)組織和細胞[4]。Nramp蛋白對生物體內細胞的病原體可以起到抵抗的作用，主要是通過陽離子運輸功能減少巨噬細胞內金屬離子的濃度，抑制胞內病菌對金屬離子的利用，調節(jié)巨噬細胞的抗菌活性[5]。研究發(fā)現(xiàn)，人Nramp1基因多態(tài)性與多種自身免疫性疾病和由病毒、細菌、寄生蟲等引起的傳染性疾病相關[6]。小鼠Nramp1在抵抗牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)、沙門氏菌(Salmonella)的感染起著重要的調控作用[7—8]，單個密碼子突變(Gly169→Asp) 可導致基因功能的喪失[9]。迄今為止，已在人[10]、鼠[1]、豬[11]等哺乳動物中克隆得到Nramp基因cDNA全長。在魚類中，已得到了虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[12]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[13]、鱸魚(Lateolabraxjaponicus)[14]、真鯛(Pagrosomusmajor)[15]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[16]和斑馬魚(Daniorerio)[17]等Nramp基因全長，并分析了基因的序列特征。然而，關于Nramp基因的研究主要集中在哺乳動物和魚類，在貝類中僅見太平洋牡蠣(Crassostreagigas)Nramp2-like在NCBI上有序列信息。

縊蟶(Sinonovaculaconstricta)是我國重要海水養(yǎng)殖貝類之一，肉質鮮美，營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛，在浙江、福建、廣東沿海一帶有著悠久的養(yǎng)殖歷史。近年來，由細菌性疾病造成的縊蟶病害時有發(fā)生，其中又以弧菌為主要致病菌[18]。貝類對病原的防御與脊椎動物不同，體內不存在特異性免疫淋巴細胞和相應抗體，是通過巨噬細胞和多種非免疫球蛋白介導的非特異性免疫殺滅進入體內的病原[19]。目前在縊蟶中已有熱休克蛋白ScHsc70[20]、小分子熱休克蛋白Sc-sHSP[21]、肌動蛋白β-ACTIN1[22]、鐵蛋白[23]和組織蛋白酶B[24]等免疫相關基因的報道。本研究對Sc-Nramp2基因的序列特征、組織表達和副溶血弧菌感染后的表達進行分析，以期為深入研究其在縊蟶免疫過程中的作用機理奠定基礎。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

實驗用縊蟶材料于2015年10月取自寧波市海洋與漁業(yè)研究院科技創(chuàng)新基地。取健康的縊蟶成貝經(jīng)活體解剖，迅速取其閉殼肌、外套膜、肝胰腺、足、水管和鰓6個組織，用液氮速凍后分別放入凍存管中，并保存于-80℃冰箱中備用。

2.2 攻毒實驗

取200顆縊蟶暫養(yǎng)于海水中，水溫(18±1)℃，鹽度為25，定時投喂扁藻、金藻，持續(xù)充氣，每日換水一次，暫養(yǎng)一周后進行攻毒實驗。

將實驗室保存的副溶血弧菌(VibrioParahaemolyticus)活化后，擴大培養(yǎng)，用PBS將菌液濃度稀釋到OD600=0.4。將縊蟶隨機分組，每組100顆。在實驗組每顆縊蟶斧足注射50 μL 副溶血弧菌菌液，對照組每顆注射50 μL PBS，注射后放回海水中。分別于注射后0 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h取樣肝胰腺用液氮速凍，于-80℃冰箱中保存。

2.3Sc-Nramp2基因cDNA全長的克隆

采用Trizol法提取縊蟶肝胰腺樣品RNA，用1%瓊脂糖電泳檢測其完整性，NanoVue微量紫外分光光度計檢測濃度和純度。利用SMART RACE試劑盒(Clontech)以總RNA為模板合成cDNA。從縊蟶轉錄組文庫的注釋信息中，檢索到Sc-Nramp2基因的EST片段，以此分別設計3′RACE和5′RACE特異性引物N-1和N-2(表1)，用Advantage 2 Polymerase試劑盒(Clontech)根據(jù)試劑盒說明書要求擴增Sc-Nramp2的cDNA全長。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收試劑盒(TIANGEN)割膠純化。純化后的產(chǎn)物與T1 (TransGen)載體連接，轉化到大腸桿菌DH5α (TaKaRa)中進行克隆，挑取出陽性克隆送往Invitrogen公司測序。

表1 實驗所用的引物及序列

2.4Sc-Nramp2基因的序列及進化分析

用DNAMAN 7軟件對測序結果序列進行拼接，得到Sc-Nramp2基因的cDNA全長序列并搜索開放閱讀框，推測出其編碼的氨基酸序列；用NCBI blast(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)搜索同源序列和功能域；用序列處理在線工具包(http: //www.bio-soft.net/sms/index.html)預測翻譯蛋白質的理化性質；用NetNGlyc 1.0 Server(http: //www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預測糖基化位點；用ExPASy ProtScale(http: //web.Expasy.org/protscale/)軟件分析蛋白質疏水性；用SignalP 4.1 Serve(http: //www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)預測蛋白質的信號肽；用DAS(http: //www.sbc.su.se/～miklos/DAS/)軟件預測蛋白質的跨膜區(qū)；用Swiss Model(http: //swissmodel. Expasy. org/workspace/)軟件預測蛋白質三級結構。

2.5Sc-Nramp2基因在不同組織中的差異表達分析

利用Trizol(Invitrogen)法提取6個組織(閉殼肌、外套膜、肝胰腺、斧足、水管和鰓，n=3)的RNA，按照Promega反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄獲得cDNA第一鏈，用作熒光定量PCR的模板。根據(jù)已獲得的Sc-Nramp2基因cDNA全長序列設計Real-N-F和Real-N-R(表1)用為熒光定量引物，以18S rRNA(表1)基因為內參進行相對定量。熒光定量PCR的反應體系為20 μL，包含：SYBR Green Mix(Bio-rad)10 mL，cDNA模板0.8 mL，上下游特異性引物(10 mmol/L)各1 mL，以DEPC-H2O補足。用ABI 7500 fast熒光定量PCR儀進行擴增，具體反應程序：95℃預變性20 s；95℃變性3 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，60℃15 s，制成熔解曲線。每個組織樣品設3個平行，基因的相對mRNA水平采用2-ΔΔCt進行計算，結果用平均值±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS16.0進行ANOVA單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

3 結果

3.1Sc-Nramp2基因cDNA全長序列分析

經(jīng)RACE克隆得到Sc-Nramp2基因cDNA序列全長3 681 bp(GenBank登錄號：KX197930.1)，開放閱讀框(Open Reading Frame， ORF)有1 776 bp，編碼591個氨基酸，5′末端非翻譯區(qū)(Untranslated Regions， 5′-UTR)長91 bp，3′-UTR為1 817 bp，包含一個終止密碼子TAG、加尾信號和32 bp的polyA尾巴。另外，在3′-UTR發(fā)現(xiàn)了2個鐵反應控制蛋白結合位點(Iron-responsive regulatory-protein-binding site， IRE) (CNNNNNCAGTG)的特征序列(圖1)。

3.2Sc-Nramp2基因的功能域、結構域與高級結構預測

Sc-Nramp2基因共編碼591個氨基酸，推導出蛋白質分子量為65.86 kDa，理論等電點pI=4.93。ExPASy Protscale 軟件預測顯示，該蛋白質在氨基酸組成上，非極性氨基酸所占比例較高，表現(xiàn)為疏水性；SignalP軟件預測該蛋白沒有明顯的信號肽；DAS軟件預測該蛋白有10個明顯的跨膜區(qū)域。NCBI Blastx 預測該蛋白的功能域結果顯示，Sc-Nramp2基因有1個較為保守的結構域，利用NetNGlyc 1.0 Server軟件分析得到2個N-糖基化位點，分別在4-7aa，557-560aa。Swiss model軟件預測得到的Sc-Nramp2蛋白的二級結構包含291個氫鍵、19個α-螺旋和28個轉角(圖2)。

3.3Sc-Nramp2基因氨基酸序列同源性及系統(tǒng)進化樹分析

利用MAGE6.0軟件將Sc-Nramp2的氨基酸序列同其他物種Nramp1和Nramp2的氨基酸序列進行比對及用NJ法構建系統(tǒng)進化樹(圖3)。氨基酸序列比對表明，Sc-Nramp2與太平洋牡蠣Nramp2-like(Crassostreagigas， NP_001292237.1)、章魚Nramp2-like(Octopusbimaculoides， XP 014772339.1)、光棘球海膽Nramp1(Strongylocentrotuspurpuratus， XP 003728002.1)等軟體動物的同源性為57%～71.6%，與魚類的同源性在53.4%～54.5%之間，與鳥類的同源性為52.2%～53.5%，與兩棲類的同源性為53.9%～54.9%，與哺乳類Nramp1的同源性(52.7%～53.2%)要低于哺乳類Nramp2的同源性(55.6%～56.1%)。從進化樹中可以看出，魚類聚為一支，再與哺乳類Nramp2聚為一大支，而高等脊椎動物中鳥類、兩棲類與哺乳類Nramp1聚為一大支，推測其具有類似的功能。

3.4Sc-Nramp2基因在6個組織中的表達差異分析

利用實時熒光定量PCR檢測Sc-Nramp2基因在6個組織中的相對表達量，結果顯示，在6個組織中均有表達，其中肝胰腺的表達量最高，其次是鰓，與其他組織有顯著性差異(圖4)。

3.5Sc-Nramp2基因在副溶血弧菌刺激后的表達特征分析

縊蟶在被副溶血弧菌侵染刺激后，不同時間取其肝胰腺組織，檢測在刺激后的Sc-Nramp2基因的表達情況。如圖5所示，實驗組的表達量在刺激后4 h有明顯上升并持續(xù)上升到12 h，在12 h時的表達量達到最大值，約為對照組的12.7倍，與對照組和空白組均呈顯著性差異(P<0.01)。表達量在12 h后開始下降，48 h和72 h后的表達量變化不大。

圖1 Sc-Nramp2基因全長cDNA序列及其氨基酸序列推測Fig.1 The nucleotide and deduced amino acid sequence of the Sc-Nramp2 gene加框部分分別代表起始密碼子、終止密碼子和加尾信號，*代表蛋白翻譯結束，單下劃線代表跨膜區(qū)，分別標注為TM1～10，陰影加粗的是2個N-糖基化位點，位于 3′-UTR 的2個 IRE 位點用陰影和下劃線標出，polyA尾巴用雙下劃線標出The letters boxes are the start codon, the stop codon and the polyadenylation signal sequence, the * represents the end of the protein translation, the transmembrane regions (TM) are underlined with single lines and numbered 1-10, the N-glycosylation sites are marked with shaded and bold, the IRE sites located in 3′UTR are underlined and shaded, and the double underlined part is polyA

圖2 Sc-Nramp2蛋白的二級結構預測圖Fig.2 The prediction of Sc-Nramp2 protein secondary structure紅色為α-螺旋，藍色為轉角The red represents the alpha-helix, blue represents the turn

圖3 用MAGE6.0軟件NJ法構建的縊蟶與其他物種Nramp1和Nramp2系統(tǒng)進化樹Fig.3 Neighbor-joing phylogenetic tree of Nramp between S.constrzcta and other species using MEGA6.0 software

4 討論

本研究克隆得到的Sc-Nramp2基因的全長cDNA，與已報道的其他動物Nramp氨基酸序列比對分析，Sc-Nramp2與其他動物的Nramp2 較為相似，包含10個明顯的跨膜區(qū)域，1個較為保守的結構域和2個N-糖基化位點，這些特征與小鼠[4]、人[25]、草魚[13]和虹鱒[9]等大致相似。另外，在Sc-Nramp2的3′-UTR發(fā)現(xiàn)了2個IRE位點。有研究表明，5′UTR 和 3′UTR端 IRE 位點與細胞中鐵的代謝密切相關[26]，在哺乳動物Nramp2的相關研究中，發(fā)現(xiàn)鐵的轉運吸收與IRE位點緊密相關[27-28]。Saeij等[29]推測，在鯉Nramp中的IRE可能通過與鐵調控蛋白結合來調節(jié)Nramp的mRNA水平，當鐵調控蛋白與Nramp5′-UTR端的IRE位點結合時可以阻止RNA的翻譯，當與3′-UTR端的IRE位點結合時可以保護RNA免受降解。至于貝類Nramp基因的IRE位點是否與其在哺乳動物Nramp2中起著相同的作用還需進一步研究。

圖4 Sc-Nramp2基因在6個組織中的表達特征分析Fig.4 The distribution of Sc-Nramp2 expression in six tissues of S.constrzcta不同字母代表極顯著差異(P<0.01)Different letters indicates an extremely significant difference (P< 0.01)

圖5 副溶血弧菌感染后，Sc-Nramp2在肝胰腺中的表達量變化Fig.5 Expression characteristic analysis of Sc-Nramp2 in hepatopancreas by V. Parahaemolyticus**表示該時間點基因表達量與0 h相比差異極顯著(P<0.01)，##表示相同時間點實驗組與PBS對照組基因表達量差異極顯著(P<0.01)The “**” indicates an extremely significant difference (P<0.01) from the blank group; the “##” indicates that the experimental group is extremely different from the control group (P< 0.01)

Nramp1基因在哺乳動物中呈現(xiàn)特異性表達，如人的肝臟、腎臟和胰臟[30]，牛的網(wǎng)狀內皮中的巨噬細胞[31]，而Nramp2基因則在哺乳動物各組織中廣泛表達。本研究在縊蟶閉殼肌、外套膜、肝胰腺、斧足、水管和鰓6個組織中均檢測到Nramp2基因的表達但表達量不同，其中，在肝胰腺中的表達量最高，鰓組織表達量僅次于肝胰腺，而在水管、外套膜，在足和閉殼肌中的表達量最低。Sc-Nramp2基因的這種組織表達形式與哺乳類Nramp2較為相似。此外，在草魚[13]和鱸魚[11]中發(fā)現(xiàn)Nramp基因在脾臟和腎臟中的表達量最高，而縊蟶中肝胰腺的Nramp2基因表達量最高，這與肝胰臟是大多數(shù)動物的重要解毒器官有關。關于縊蟶免疫相關基因與病菌感染之間的關系已有一些研究，金凱等[32]研究發(fā)現(xiàn)縊蟶絲氨酸蛋白酶基因ScSp在被鰻弧菌(Vibrioanguillarum) 誘導感染后4 h和8 h，在肝胰腺中的表達量顯著上調；馮冰冰[20]研究發(fā)現(xiàn)縊蟶在被副溶血弧菌和鰻弧菌感染后，縊蟶熱休克蛋白70(ScHsc70)、小熱休克蛋白(Sc-sHSP)和鐵蛋白基因(ScFERs)在肝胰腺組織的表達量都顯著高于其他組織且呈現(xiàn)上調趨勢，這與肝胰腺是大多數(shù)動物的一個具有解毒功效的重要組織有關。本研究中的縊蟶6個組織表達情況也表明了Sc-Nramp2具有組織特異性表達模式，與上述研究有相似之處，表明肝胰腺是縊蟶合成免疫相關蛋白的重要組織。

對縊蟶進行副溶血弧菌感染實驗后研究發(fā)現(xiàn)，實驗組縊蟶肝胰腺Sc-Nramp2表達量相較于PBS對照組有明顯的上調，在12 h達到最大值，是PBS對照組的12.7倍左右，隨著時間的推移Nramp2表達量逐漸下降接近正常值，這與半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[33]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[34]、草魚[13]的研究結果相似。由此推測，起始由于副溶血弧菌的感染誘導了縊蟶細胞內免疫相關基因的表達量上升，隨后由于細胞病變效應且細胞生長受到了限制等，致使基因表達量下降，在小鼠中也報道過類似的現(xiàn)象[35]。這些結果表明，Sc-Nramp2基因參與了縊蟶的先天性免疫應答，與被感染后機體的免疫反應密切相關?？O蟶等貝類屬于低等動物，在遭受外界病菌感染時，依靠先天免疫合成蛋白，而肝胰腺則是縊蟶重要的免疫器官，在對抗病菌入侵時發(fā)揮防御作用。至于Sc-Nramp2與副溶血弧菌感染之間的相互作用機理，及其在免疫系統(tǒng)中扮演的具體角色，還需開展大量深入研究。

5 結論

本研究首次克隆得到縊蟶Sc-Nramp2基因全長cDNA序列，同源性分析表明和太平洋牡蠣Nramp2-like基因的相似度最高。Sc-Nramp2基因在縊蟶6個組織中都有表達，且在肝胰腺中的表達量最高；經(jīng)副溶血弧菌侵染后，Sc-Nramp2基因在肝胰腺中表達量上升，表明該基因在肝胰腺中參與了縊蟶的天然免疫過程。研究結果為進一步研究縊蟶Sc-Nramp2基因的功能和作用機制奠定了基礎。

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Cloning of natural resistance associated macrophage protein2 (Sc-Nramp2)gene fromsinonovaculaconstrictaand the expression analysis undervibrioparahaemolyticusstimulation

Lin Dehai1， Liu Chenshan1， Dong Yinghui1， He Lin1， Lin Zhihua1

(1.KeyLaboratoryofAquaticGermplasmResourceofZhejiang，ZhejiangWanliUniversity，Ningbo315100，China)

The cDNA sequence of natural resistance associated macrophage protein inSinonovaculaconstricta(Sc-Nramp2) was cloned by SMART RACE techniques. The ORF of cDNA sequence， coding for a protein of amino acids， was 1 773 bp and the molecular weight was deduced for 65.86 kDa.Sc-Nramp2 protein has the typical structural features with Solute carrier family 11 member， with 10 typical transmembrane domains and 2 glycosylation site. In 3′-UTR，Sc-Nramp2 was the presence of two IRE which was similar to the vertebrate Nramp2. Homology analysis indicated that the identity of Nramp withCrassostreagigaswas 71.6%. Real-time quantitative RT-PCR analysis indicated that the mRNA was expressed in all the six tissues， including adductor muscle， mantle， hepatopancreas， foot， waterpipe and gill. Nramp was expressed with the highest expression level in the hepatopancreas， then the gill， which had extremely significant differences from other tissues(P<0.01). The expression of Nramp in the hepatopancreas injected withV.Parahaemolyticusincreased significantly(P<0.01). It rose to maximum expression at the 12thhour and returned to the initial level. These results indicated thatSc-Nramp2 is involved in innate immunity of this species．

Sinonovaculaconstricta;Sc-Nramp2;gene cloning;VibrioParahaemolyticus;gene expression

10.3969/j.issn.0253-4193.2017.08.007

2016-11-23；

2017-04-13。

國家現(xiàn)代貝類產(chǎn)業(yè)技術體系項目(CARS-48)；浙江省重大科技專項(2016C12907-7)；國家水產(chǎn)種質資源平臺項目(2015DKA30470)；寧波市科技富民項目(2015C1000)；浙江省重中之重學科學生創(chuàng)新項目(CX2015011)；浙江省教育廳一般項目(Y201329410)。

林德海(1990—)，男，浙江省蒼南縣人，從事海洋貝類種質資源與遺傳育種研究。E-mail：772351303@qq.com

*通信作者：林志華，博士，研究員。E-mail：zhihua9988@126.com

Q786

A

0253-4193(2017)08-0070-08

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Lin Dehai， Liu Chenshan， Dong Yinghui，et al. Cloning of natural resistance associated macrophage protein 2 (Sc-Nramp2)gene from sinonovacula constricta and the expression analysis under vibrio parahaemolyticus stimulation[J]. Haiyang Xuebao，2017，39(8)：70—77， doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2017.08.007