侯國輝 羅騰 陳秉靈 劉杰 林子揚(yáng) 陳丹妮 屈軍樂

(深圳大學(xué)光電工程學(xué)院,光電子器件與系統(tǒng)(教育部/廣東省)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,深圳 518060)

雙光子熒光與相干反斯托克斯拉曼散射顯微成像技術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究?

侯國輝 羅騰 陳秉靈 劉杰 林子揚(yáng) 陳丹妮?屈軍樂?

(深圳大學(xué)光電工程學(xué)院,光電子器件與系統(tǒng)(教育部/廣東省)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,深圳 518060)

(2017年1月12日收到;2017年3月13日收到修改稿)

雙光子熒光與相干反斯托克斯拉曼散射同屬于三階非線性效應(yīng),二者之間的差異與聯(lián)系是一個(gè)值得研究的問題.本文基于自行搭建的超連續(xù)譜近紅外寬帶相干反斯托克斯拉曼散射顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行光譜成像,同時(shí)通過理論與實(shí)驗(yàn)對比分析了雙光子熒光與相干反斯托克斯拉曼散射圖像存在差異的原因.結(jié)果表明,具有亞微米以上橫向分辨率的相干反斯托克斯拉曼散射成像系統(tǒng),可以使用較大尺寸的熒光珠進(jìn)行雙光子熒光成像,通過解卷積得到雙光子熒光成像的系統(tǒng)分辨率,并將它近似等效于相干反斯托克斯拉曼散射成像系統(tǒng)的當(dāng)下分辨率.如果需要得到相干反斯托克斯拉曼散射成像系準(zhǔn)確的分辨率結(jié)果,就必須使用尺寸比相干反斯托克斯拉曼散射成像系統(tǒng)實(shí)際分辨率小的球形樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測量.

∶相干反斯托克斯拉曼散射,拉曼光譜,熒光,非線性光學(xué)

PACS∶42.65.Dr,36.20.Ng,32.50.+d,42.65.—kDOI∶10.7498/aps.66.104204

1 引 言

基于分子自身的特性,無需引入外源探針進(jìn)行標(biāo)記的相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-Stokes Raman scattering,CARS)顯微成像技術(shù)[1]屬于三階非線性效應(yīng),所以具有較高的空間分辨率.由于成像的過程中引入了斯托克斯光的緣故,相比于自發(fā)拉曼散射,信號增強(qiáng)了106量級[2],但同時(shí)也引入了非共振背景.為了更加容易理解該技術(shù),我們從時(shí)間分辨的角度把CARS過程分解成兩個(gè)作用階段∶第一階段,頻率不同的兩個(gè)光分別為(ωP)和(ωS),當(dāng)它們之間的差值ωP?ωS正好與分子的拉曼振動能級相匹配,分子就會躍遷至第一振動激發(fā)態(tài),與此同時(shí),抽運(yùn)光由于與分子發(fā)生非完全彈性碰撞失去一部分能量而變成新增的斯托克斯光,這個(gè)階段對應(yīng)的就是受激拉曼散射(stimulated Raman scattering,SRS),對于這個(gè)階段,如果應(yīng)用時(shí)關(guān)心的是抽運(yùn)光的損耗,那么它就是受激拉曼損耗[3](stimulated Raman loss,SRL),如果關(guān)心的是新生成的斯托克斯光的增量,那么它就是受激拉曼增益[4](stimulated Raman gain,SRG),此階段自動滿足動量守恒;第二階段,對于第一階段處于振動激發(fā)態(tài)的分子,吸收一個(gè)頻率為的光子,躍遷至更高的虛能態(tài),由于不穩(wěn)定而返回基態(tài),同時(shí)釋放一個(gè)更高頻率ωAS的光子ωAS=ωP?ωS+,此過程滿足能量守恒與動量守恒.其中,動量守恒也就是相位匹配條件,兩個(gè)階段合起來就是CARS過程.雙光子激發(fā)熒光[5,6](two-photon excited fluorescence,TPEF)也是一個(gè)三階非線性過程,因?yàn)殡p光子熒光的信號強(qiáng)度與雙光子吸收截面成正比,雙光子吸收截面與三階非線性極化率的虛部成正比.而采用近紅外兩個(gè)不同中心頻率的激光脈沖分別作為抽運(yùn)光(ωP)和斯托克斯光(ωS),如果滿足分子中的電子同時(shí)吸收兩個(gè)(ωP)或兩個(gè)(ωS)的光子,或者ωP+ωS的能量,從基態(tài)能級躍遷至電子上能級,然后經(jīng)過振動弛豫達(dá)到第一單線激發(fā)態(tài)的最低振動能級時(shí),處于第一單線激發(fā)態(tài)最低振動能級的電子可通過自發(fā)輻射躍遷回到基態(tài)的過程.它們的能級表述過程如圖1所示.其中,ge表示基態(tài)電子能級,gv表示基態(tài)第一振動激發(fā)態(tài)能級,fe表示第一電子能級,fev表示第一電子激發(fā)態(tài)上的振動能級,virtual表示引入的虛能級.

圖1 TPEF與CARS能級原理圖Fig.1.The Energy diagram for TPEF and CARS.

同是三階非線性效應(yīng),TPEF和CARS的差異是什么?本文通過寬帶近紅外光源進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn),將這兩個(gè)不同的過程合二為一進(jìn)行對比.同時(shí),將與信號有關(guān)的三階非線性極化率χ(3)分解成兩個(gè)部分,即分子中的電子同時(shí)吸收兩個(gè)光子的能量達(dá)到電子上能級然后發(fā)射熒光的TPEF部分,以及拉曼共振躍遷與形成CARS信號有關(guān)的部分(包含共振信號與非共振信號部分).而非共振部分通常被稱為非共振背景,在一定程度上會淹沒共振信號,所以形成了幾種抑制的方法[7?10].而非共振背景也就是沒有被充分利用的干擾項(xiàng),一旦被利用,它就是信號.該干擾項(xiàng)是非線性四波混頻過程特有的產(chǎn)物.而CARS效應(yīng)的共振部分本質(zhì)上就是拉曼特征峰在CARS信號產(chǎn)生的過程中引入了斯托克斯光的緣故,使其比自發(fā)拉曼散射的信號增強(qiáng)了5個(gè)數(shù)量級,同時(shí)由于過程中使用的是激光光源,所以方向性比較好,這就是相干共振增強(qiáng)的內(nèi)在因素.為了同時(shí)清晰地呈現(xiàn)這兩個(gè)作用過程,我們利用實(shí)驗(yàn)室自己搭建的近紅外寬帶CARS成像系統(tǒng)對實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的聚苯乙烯熒光微球(激發(fā)光譜峰488 nm與發(fā)射光譜峰520 nm)進(jìn)行光譜成像.因?yàn)樾纬傻男盘柺且粋€(gè)寬帶光譜,所以采用前向點(diǎn)掃描的方式通過光譜儀同時(shí)記錄寬帶CARS信號與雙光子熒光信號,然后再根據(jù)感興趣的波長或波數(shù)進(jìn)行圖像重構(gòu),便可以獲得樣品的熒光分布圖像或者感興趣的化學(xué)鍵的分布圖像.結(jié)果表明,熒光材料同時(shí)吸收兩個(gè)頻率(可以是同頻,也可以是不同頻率)的光子躍遷至更高的電子激發(fā)態(tài)能級,然后經(jīng)過自發(fā)輻射躍遷回到基態(tài)并發(fā)射熒光信號;同時(shí),處于拉曼振動上能級的分子,在滿足相位匹配條件的探測光誘導(dǎo)下回到基態(tài)能級,產(chǎn)生CARS信號.本文通過實(shí)驗(yàn)給出了在0.75 NA的物鏡,對聚苯乙烯熒光珠樣品尺寸大于艾里斑尺寸的情況下,實(shí)際測量的結(jié)果顯示CARS圖像偏小,而雙光子熒光圖像的尺寸比較接近實(shí)際尺寸,得到系統(tǒng)雙光子熒光成像模式下的分辨率[11].產(chǎn)生這種結(jié)果的原因正是由于相位匹配條件的影響,導(dǎo)致同是三階非線性過程,成像結(jié)果卻存在一定的差異.這意味著對于CARS系統(tǒng)的分辨率測量,不能用尺寸大于系統(tǒng)點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的樣品.同時(shí),此結(jié)果也告訴我們,對于實(shí)際的物理過程,一旦發(fā)生就會有相應(yīng)的信號產(chǎn)生,這就是CARS過程中非共振背景存在的原因,它的存在是CARS過程中引入了斯托克斯光的緣故.

2 理 論

在平面波近似的條件下,在遠(yuǎn)離單光子電子共振的前提下,抽運(yùn)光與斯托克斯光光場的偏振平行通過微擾論[12]獲得

其中,χNR表示非共振電子貢獻(xiàn),T代表雙光子和頻吸收電子能級躍遷,R表示分子拉曼振動能級躍遷,A表示振幅強(qiáng)度,ω表示光子頻率,Γ表示弛豫率.

雙光子熒光的吸收截面正比于三階非線性極化率的虛部,于是有信號強(qiáng)度If,

對于CARS過程而言,有

進(jìn)一步,對于頻率差ωP?ωS不處于拉曼共振峰位置的信號,表達(dá)式退化為

這就是遠(yuǎn)離拉曼共振峰位置的非共振信號,其他文獻(xiàn)都將其稱為非共振背景,它具有與CARS信號相同的特性∶1)滿足相位匹配條件;2)方向性.在前向緊聚焦CARS成像的過程中,弱信號具有不可忽略的影響.因?yàn)榉肿庸舱癫糠值恼駝油讼鄷r(shí)間與非共振部分信號弛豫時(shí)間相當(dāng)這一情況,在寬帶CARS生物顯微成像進(jìn)行組分定量時(shí)是難以避免的問題.

上述表達(dá)式給出了雙光子熒光信號與四波混頻CARS信號的差異,主要凸顯在相位匹配條件?k上.如果將兩個(gè)信號產(chǎn)生的方式定義為二次發(fā)射,那么對于雙光子熒光而言,就是自發(fā)輻射.自發(fā)輻射具有全立體角空間等概率發(fā)射的特性;而四波混頻發(fā)射的信號可以稱之為相干誘導(dǎo)發(fā)射,需要滿足相位匹配條件,而相位匹配條件的實(shí)質(zhì)就是動量守恒,也就是方向性.

3 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)

我們的成像實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)如圖2所示.鎖模鈦寶石激光振蕩級的重要參數(shù)包括∶脈沖寬度120 fs,中心波長782 nm,重復(fù)頻率76 MHz,平均輸出功率1.3 W.輸出的激光脈沖先經(jīng)過光隔離器之后由分光平板分成兩路,一路送入光子晶體光纖產(chǎn)生超連續(xù)譜(800—1200 nm),另一路經(jīng)過一維電動位移臺(其作用是使兩路分開的脈沖在樣品位置時(shí)間上重合),在位移臺之后,可以選擇性地插入1 nm的窄帶通濾光片,用于雙脈沖成像的抽運(yùn)與探測.最后,兩路光在合束鏡的反射表面合為一束送入前向緊聚焦光譜顯微成像裝置.因?yàn)槭乔跋驅(qū)拵Ч庾V測量,所以我們采用三維納米位移臺進(jìn)行樣品掃描成像,其重復(fù)精度小于2 nm.其中,一維電動位移平臺的時(shí)間延遲的調(diào)節(jié)精度達(dá)到6.7 fs,產(chǎn)生的前向光譜信號由QE65 pro(charge coupled device,CCD)光譜儀(光譜響應(yīng)范圍200—1000 nm)探測接收.相比于激光中心波長782 nm與800—1200 nm的超連續(xù)譜而言,產(chǎn)生的光譜信號是藍(lán)移的,也就是說信號的波長小于782 nm.所以,在信號收集時(shí),先將光譜儀用商家已經(jīng)生產(chǎn)好的截止波長為790 nm的短波通濾光傾斜一定的角度來濾除超連續(xù)譜與激光的影響.其中的擴(kuò)束器是將光束直徑擴(kuò)大,使準(zhǔn)平行的光束按照一定的比例填充物鏡的后光瞳,或者充滿物鏡的后光瞳,當(dāng)充滿時(shí)說明物鏡的數(shù)值孔徑(numerical aperture,NA)得到了充分利用,也是成像分辨率最佳的時(shí)候.

圖2 超連續(xù)CARS和TPEF成像光路示意圖Fig.2.Two-pulse super-continuum CARS and TPEF microscopy setup.

4 結(jié)果與討論

由于我們主要采用的是0.75 NA物鏡(干鏡),通過前向緊聚焦方式進(jìn)光譜成像,而物鏡的工作距離都是0.51 mm,所以樣品都是夾在兩片0.17 mm厚的蓋玻片之間,采用的樣品主要為干樣品.

在滿足系統(tǒng)合軸、齊焦、滿物鏡后光瞳的前提下,利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的1.01μm的干聚苯乙烯熒光珠(激發(fā)與發(fā)射峰對應(yīng)488 nm與520 nm)進(jìn)行光譜成像,成像過程中樣品處的激光約12 mW,超連續(xù)譜的功率約4 mW,光譜儀的積分時(shí)間為50 ms.然后,根據(jù)聚苯乙烯材料的明顯寬帶,CARS在拉曼峰位[13]1000,2870與3040 cm?1分別進(jìn)行圖像重構(gòu),對應(yīng)圖3(a)—(c).同時(shí),根據(jù)熒光發(fā)射波段500—600 nm也就是圖3(e)中的3878—7212 cm?1進(jìn)行圖像重構(gòu),得到的結(jié)果如圖3(d)所示.圖3(g)和圖3(h)是以波長與波數(shù)為橫軸信號對應(yīng)的光譜曲線.

圖3 (網(wǎng)刊彩色)不同波數(shù)重建的CARS圖像、雙光子熒光圖像及圖(d)中的黃點(diǎn)處對應(yīng)的光譜Fig.3.(color online)CARS image reconstruct at different wavenumber,the TPEF image and the spectrum at yellow point in(d):(a)CARS image at 1000 cm?1;(b)CARS image at 2870 cm?1;(c)CARS image at 3040 cm?1;(d)florescence of 1.01μm PS beads;(e)CARS FWHM across the white line;(f)TPEF FWHM across the white line;(g),(h)CARS and TPEF spectral with Wavelength and Wavenumber at the yellow point in(d).

圖3(e)與圖3(f)對應(yīng)的是穿過白色線位置的路徑,白色的曲線依次經(jīng)過上中下三個(gè)珠子.獲得對應(yīng)路徑上的測量強(qiáng)度值分布后,采用origin曲線擬合工具選擇高斯函數(shù)進(jìn)行多峰曲線擬合.從圖3(c)可以看到,白色直線正好穿過中間那顆珠子的中軸線,并非會通過上下兩顆珠子的中軸線,這也是在雙光子熒光成像時(shí)得到的半高寬為0.76022μm的原因.選擇中間的珠子的原因是從CARS重構(gòu)的圖像來看,周圍珠子的信號對其影響比較小,輪廓比較清晰.因此,選擇對中間珠子的中心直徑測量的擬合半高寬(full width at half maximum,FWHM),圖3(e)表示CARS信號的半高寬,中間的珠子擬合結(jié)果是0.5249μm.圖3(f)表示雙光子熒光對中間珠子測量值進(jìn)行擬合的結(jié)果為1.1033μm.由卷積定理∶d2+PSF2=FWHM2,其中,d是樣品直徑,PSF是系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)(point spread function)的橫向半高寬,也就是系統(tǒng)的橫向分辨率,對于雙光子熒光解卷積后的分辨率為0.4404μm.但是,對于CARS而言,當(dāng)分子直徑大于點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)時(shí),這種去卷積的方式就會失靈.因?yàn)榇藭r(shí)珠子的直徑是1.01μm,實(shí)際測量的FWHM值是0.5249μm.從實(shí)際的測量結(jié)果來看,CARS測量的結(jié)果與雙光子熒光的比值是0.476,其測量結(jié)果與實(shí)際珠子的直徑的比值是0.520.此差異是CARS過程的相位匹配條件所造成的.所以,對于CARS過程,如果想要得到準(zhǔn)確的系統(tǒng)分辨率,就需要采用尺寸比系統(tǒng)實(shí)際分辨率小的樣品進(jìn)行測量.

圖3(a)與圖3(b)中,右上角存在明顯的非共振背景,而此背景是玻璃的信號,而玻璃在常溫常壓下不具有特征拉曼峰,或者說不存在明顯的拉曼峰,或者說即使有也與非共振背景相當(dāng).從圖中可以得到該非共振背景的三個(gè)特殊性質(zhì)∶1)方向性,也就是相位匹配特性;2)頻差特性,如果采用單頻四波混頻,可以清晰地看到它就是位于本該是拉曼共振峰的反斯托克斯信號位置,它隸屬于非線性四波混頻CARS過程,卻又高于它,因?yàn)榧词箾]有拉曼共振峰,它仍會存在,它是受激拉曼散射過程特有的現(xiàn)象,因?yàn)閾醯羧我庖粋€(gè)照射樣品的光信號都會消失.

同時(shí),在成像的過程中,我們分別擋掉激光于寬帶近紅外超連續(xù)譜,避免它們同時(shí)照射到樣品,此時(shí)寬帶CARS信號消失,只剩余TPEF信號,其中激光單獨(dú)照射樣品產(chǎn)生雙光子熒光信號,說明發(fā)生的是相同頻率雙光子和頻激發(fā)熒光樣品,兩路光同時(shí)照射樣品產(chǎn)生的雙光子信號大于各自單獨(dú)激發(fā)的熒光信號總和,說明同時(shí)也發(fā)生了不同頻率雙光子和頻激發(fā)熒光樣品.

然后,我們采用280 nm干的聚苯乙烯微球進(jìn)行CARS成像,每一個(gè)像素的積分時(shí)間50 ms一次,樣品處的總功率9.5 mW,超連續(xù)譜在樣品處的功率是2 mW.圖4是測量值進(jìn)行高斯曲線擬合得到的半高寬507.03 nm,通過卷積定理解卷積之后的實(shí)際分辨率是422.70 nm.其中,聚苯乙烯珠周圍的圓環(huán)之外是玻璃的非共振信號,從色度bar來看,藍(lán)色表示信號的強(qiáng)弱.此結(jié)果是由于聚苯乙烯珠與蓋玻片的折射率存在一定的差異所造成的,也就是相位失配所造成的.

圖4 (網(wǎng)刊彩色)280 nm聚苯乙烯珠圖像與測量值的半高寬擬合值507.03 nmFig.4.(color online)The CARS imaging of 280 nm polystyrene bead and its measured FWHM is 507.03 nm.

圖5 (網(wǎng)刊彩色)190 nm熒光珠雙光子熒光圖像與所測量的半高寬值816.08 nmFig.5.(color online)The TPEF imaging of 190 nmfluorescent PS beads and its measured FWHM is 816.08 nm along the white line.

經(jīng)過解卷積之后的CARS圖像分辨率422.70 nm,與通過解卷積TPEF圖像之后的結(jié)果440.4 nm基本一致.而兩者又同屬于三階非線性效應(yīng),所以從這個(gè)層面上來說,可以先通過雙光子熒光進(jìn)行測量,然后再通過去卷積的方式得到系統(tǒng)的TPEF分辨率近似等效于CARS成像系統(tǒng)的分辨率.此時(shí),并未進(jìn)行光束擴(kuò)束,也就是光束并未填充滿物鏡的后光瞳,采用190 nm直徑的熒光珠,進(jìn)行雙光子熒光測量,結(jié)果如圖5所示.

圖5中的分辨率測量是沿著圖中所示的直線位置,通過高斯函數(shù)擬合的半高寬是816.08 nm,與190 nm解卷積之后的半高寬是793.65 nm.此結(jié)果說明對于TPEF而言,不管尺寸大小,周圍的折射率分布對其成像結(jié)果并沒有太多影響.而對于CARS而言,不管樣品實(shí)際尺寸如何,周圍環(huán)境的折射率差異都會存在影響,就會引入相位失配,其結(jié)果就會像圖4中280 nm的聚苯乙烯珠一樣,在樣品的周圍存在強(qiáng)度差異.

5 結(jié) 論

我們利用鈦寶石激光器激發(fā)光子晶體光纖產(chǎn)生近紅外超連續(xù)譜與激光形成的雙脈沖寬帶CARS光譜顯微成像技術(shù)研究同為三階非線性效應(yīng)的TEPF與CARS,它們在微米或亞微米成像時(shí),雙光子成像結(jié)果與實(shí)際的樣品的大小基本一致.但是,CARS成像的結(jié)果受到周圍環(huán)境折射率差異引起的相位失配的影響,造成成像結(jié)果比實(shí)際尺寸小,至于小多少,可以通過本文給出的測量方式,直接通過測量獲得準(zhǔn)確值.這樣做還可以降低成像探測器對探測靈敏度的要求,但是對于分辨率比較高的CARS成像系統(tǒng),若希望獲得分辨率的準(zhǔn)確值,就需要用于測量分辨率的樣品比實(shí)際的分辨率小的材料,測量之后通過解卷積獲得.因?yàn)槿藗兺ǔ？偸菍㈦p光子熒光與二次諧波效應(yīng)成像放在一起對比,二次諧波的“二”字與雙光子熒光的“雙”字,都表示二的意思,還有就是在做二次諧波實(shí)驗(yàn)的時(shí)候,經(jīng)常會出現(xiàn)雙光子熒光信號,但是實(shí)際上雙光子熒光的信號強(qiáng)度正比于三階非線性極化率的虛部.同時(shí),對1.01μm的聚苯乙烯熒光珠的光譜成像的結(jié)果表明,我們的近紅外寬帶CARS成像系統(tǒng)具有兩種模式(雙光子熒光及寬帶CARS)同時(shí)成像的能力.這將有利于我們獲得探測樣品更加詳細(xì)的信息,實(shí)現(xiàn)從材料(雙光子熒光)到分子(CARS)成像研究.而細(xì)節(jié)的分子信息又包含在寬帶CARS信號里面,又因?yàn)楦唠A非線性效應(yīng),具有焦點(diǎn)激發(fā)的特性,致使它們具有較高的空間分辨率.所以,具有較高空間分辨率并能提供較為豐富的信息使得它們在生命科學(xué)及材料科學(xué)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值.

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PACS∶42.65.Dr,36.20.Ng,32.50.+d,42.65.—kDOI∶10.7498/aps.66.104204

*Project supported by the Special Funds of the Major Scientific Instruments Equipment Development of China(Grant No.2012YQ15009203),the National Natural Science Foundation of China(Grant No.61235012),and the National Basic Research Program of China(Grant Nos.2015CB352005,2012CB825802).

?Corresponding author.E-mail:danny@szu.edu.cn

?Corresponding author.E-mail:jlqu@szu.edu.cn

Experimental study on two-photon fluorescence and coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy?

Hou Guo-HuiLuo Teng Chen Bing-Ling Liu Jie Lin Zi-Yang Chen Dan-Ni?Qu Jun-Le?
(Key Laboratory of Optoelectronic Devices and Systems of Ministry of Education and Guangdong Province,College of Optoelectronic Engineering,Shenzhen University,Shenzhen 518060,China)

12 January 2017;revised manuscript

13 March 2017)

Two-photon excitation fluorescence(2PEF)and coherent anti-Stokes Raman scattering(CARS)are both thirdorder nonlinear optical processes,but for a long time,the true relationship and differences between them are not clearly understood.For decades,the second harmonic generation has been studied in conjunction with two-photon excitation fluorescence,so it was thought that the latter was a second-order nonlinear optical process.In order to make the two nonlinear interaction processes clear enough,the two nonlinear interaction processes are worthy to study at the same time.In this paper,firstly,we give the relationships between the 2PEF,CARS signal and their third-order nonlinear susceptibility,respectively;secondly,we use our own near infrared super-continuum CARS microscopy system to study both processes.In doing so,we describe the relationship between their third-order nonlinear susceptibility and the signal.The reconstructed images derived from CARS and those derived from 2PEF differ significantly when imaging the same 1.01μm fluorescence polystyrene beads.If the lateral spatial resolution of the CARS imaging system is larger than the fluorescence polystyrene beads,the measured size cannot be used to calculate the real spatial resolution of the CARS system.However,the resolution of the 2PEF microscopy system can be obtained through the de-convolution of the 2PEF image,which is approximately equivalent to the current resolution of the CARS imaging system,which is measured using 280 nm polystyrene beads.The images of 280 nm polystyrene beads and 190 nmfluorescent polystyrene beads also exhibit differences between the two samples and the environment around them,respectively.This means that although CARS and 2PEF are both third-order nonlinear optical processes,they have their own properties.In particular,CARS is a third-order nonlinear opticaloscillation process which is caused by the phasing match condition,but 2PEF is not influenced by the phasing match condition.The phase matching condition is responsible for the differences around the sample in the images of the 280 nm pure polystyrene beads,but not for the 190 nmfluorescent polystyrene beads.The de-convolution results for the 1.01μm fluorescence polystyrene beads and the 280 nm pure polystyrene beads are very similar,so we can use the de-convolution results for 2PEF by the 1.01μm fluorescence polystyrene beads to approximate the current measure condition and the resolution of the CARS imaging system.If we want to gain a more accurate resolution from the CARS imaging system,the spherical sample should be smaller than the lateral spatial resolution of this system.

∶coherent anti-Stokes Raman scattering,Raman spectra, fluorescence,nonlinear optics

?國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)(批準(zhǔn)號:2012YQ15009203)、國家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號:61235012)和國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(批準(zhǔn)號:2015CB352005,2012CB825802)資助的課題.

?通信作者.E-mail:danny@szu.edu.cn

?通信作者.E-mail:jlqu@szu.edu.cn

?2017中國物理學(xué)會Chinese Physical Society