劉蓉 商宇紅

1. 青海省西寧市第一人民醫(yī)院，青海 西寧 810000 2. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，遼寧 大連 116011

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是一類由于骨質(zhì)吸收增強(qiáng)導(dǎo)致單位體積內(nèi)骨組織量減少，繼而出現(xiàn)以骨微結(jié)構(gòu)破壞為特點(diǎn)的代謝性骨病變[1,2]。目前，OP已躍居世界常見疾病的第7位，由此引起的醫(yī)療和社會(huì)負(fù)擔(dān)已成為全球公共衛(wèi)生關(guān)注的熱點(diǎn)問題。其中，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)在原發(fā)性 OP 中占有很大比例，其發(fā)生與雌激素缺乏密切相關(guān)[3,4]。目前采用補(bǔ)充鈣劑、維生素D3、雌激素替代治療和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑等藥物治療PMOP療效并不理想，普遍存在藥物價(jià)格昂貴、鈣吸收較差和骨脆性增加等弊端。因此，進(jìn)一步探索抗骨吸收藥物的潛在靶標(biāo)對(duì)于治療PMOP具有巨大潛力，其中骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)/核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)系統(tǒng)作為調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化成熟和生物活性的最終因子，更是極具開發(fā)前景[5]。

PMOP在我國中醫(yī)學(xué)中屬“骨痿”范疇，中醫(yī)認(rèn)為其發(fā)生與腎精不足有關(guān)，如《內(nèi)經(jīng)》曰“腎主骨”，婦女絕精后腎氣漸衰，久之腎陰虧虛，骨髓化生乏源，骨失所養(yǎng)，故而出現(xiàn)骨脆易折等癥狀[6]。因此，補(bǔ)腎填精壯骨是治療PMOP的根本大法。補(bǔ)腎壯骨顆粒是中醫(yī)治療PMOP的經(jīng)驗(yàn)方，具有較好的療效?；诖耍狙芯坷萌ヂ殉泊笫竽MPMOP模型，觀察在適當(dāng)規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ)上服用補(bǔ)腎壯骨顆粒對(duì)改善骨質(zhì)疏松癥病情的效果，同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)OPG/RANKL是否發(fā)生變化，為防治PMOP開辟新的選擇方向。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物、試劑及儀器

健康SD雌性大鼠購自本地動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量(200±20)g。補(bǔ)腎壯骨顆粒由青海省西寧市第一人民醫(yī)院提供(主要成分：淫羊藿、鹿角膠、龜板膠、生地、骨碎補(bǔ)、肉桂、山藥、茯苓、三棱、水蛭)，鹽酸雷洛昔芬片購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，注射用青霉素鈉購于開封豫港制藥有限公司。TRIzol?試劑、cDNA第一鏈合成試劑盒和micro RNA SYRB Green實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購于北京全是金生物技術(shù)有限公司，三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，DEPC試劑購自Sigma公司，Rotor-Gene 3000 Real-time PCR儀器購自QIAGEN公司，5417R小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購自Eppendorf公司，小動(dòng)物骨骼強(qiáng)度儀購自北京冀諾泰科技發(fā)展有限公司。

1.2 動(dòng)物模型建立和分組

60只大鼠中選出10只作為假手術(shù)組，其余大鼠施行去勢(shì)手術(shù)，具體操作如下[7]：大鼠經(jīng)常規(guī)腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉后，仰臥固定，在無菌操作下以第13肋遠(yuǎn)端脊柱旁縱行切開，逐層分離，找到卵巢，將卵巢完整摘除(確保無殘留)，然后逐層縫合。傷口用碘酒外擦，并于術(shù)后第2d起每只大鼠肌注青霉素，連續(xù)3d，3萬U/d，以預(yù)防術(shù)后感染。假手術(shù)組除了保留卵巢并且只對(duì)包裹卵巢的脂肪進(jìn)行一小塊切除外，其余操作與去勢(shì)手術(shù)組相同。正常喂養(yǎng)2 w后，施行去勢(shì)手術(shù)的大鼠隨機(jī)分為模型組(n=10)、陽性組(n=10)、有氧運(yùn)動(dòng)組(n=10)、補(bǔ)腎壯骨顆粒組(n=10)和聯(lián)合組(n=10)。

1.3 給藥方法

分組后，各組大鼠每天上午灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥12w，具體給藥方案為：①陽性組以劑量為6.25 mg/kg灌胃雷洛昔芬片(相當(dāng)于臨床等效劑量)；②補(bǔ)腎壯骨顆粒組以劑量為1.66 g/kg灌胃補(bǔ)腎壯骨顆粒(相當(dāng)于臨床等效劑量)；③有氧運(yùn)動(dòng)組每日灌胃等量蒸餾水，并參考文獻(xiàn)方案[8]和結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，采用遞增負(fù)荷進(jìn)行跑步訓(xùn)練。 設(shè)計(jì)的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷為適應(yīng)性跑步3 d，跑臺(tái)傾斜度為0°，起始運(yùn)動(dòng)時(shí)間由20 min/d開始逐漸遞增10 min，一直增加到60 min/d，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為12 m/min。正式跑步每周訓(xùn)練6 d，跑臺(tái)傾斜度調(diào)整為5°，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為18 m/min，運(yùn)動(dòng)時(shí)間為60 min，持續(xù)運(yùn)動(dòng)12 w；④聯(lián)合組每日灌胃與補(bǔ)腎壯骨顆粒組相同劑量的藥物并進(jìn)行與有氧運(yùn)動(dòng)組相同運(yùn)動(dòng)量的跑步訓(xùn)練；⑤假手術(shù)組、模型組每日灌胃等量蒸餾水。每周稱量1次各組大鼠體重，并根據(jù)體重結(jié)果調(diào)整給藥劑量。

1.4 末次給藥后動(dòng)物處理

最后一次大鼠進(jìn)行各種干預(yù)后，將所有大鼠斷頭處死，迅速取下大鼠兩側(cè)股骨，剝除其附著在骨上的肌肉和軟組織。左側(cè)用生理鹽水浸泡的濕紗布包裹置于-20℃保存，用于骨組織生物力學(xué)檢測(cè)；右側(cè)用生理鹽水沖洗骨髓，用錫箔紙包裹后放入液氮罐過夜，行qRT-PCR檢測(cè)。

1.5 骨組織生物力學(xué)檢測(cè)

從-20℃冰箱中取出股骨，室溫自然解凍，將修剪后股骨組織塊放置于YLS-16小動(dòng)物骨骼強(qiáng)度測(cè)定儀的模具之間，參照說明測(cè)定骨組織最大負(fù)荷、骨結(jié)構(gòu)強(qiáng)度。

1.6 Real-time PCR

①RNA的提?。悍Q取大鼠右側(cè)股骨200 mg，敲碎并研磨成粉末，按照TRIzol?試劑(Invitrogen life technologies)說明書的步驟，加入3倍體積的TRIzol試劑與粉末混合，置于冰沙中，依法提取出標(biāo)本中的總RNA，通過紫外分光光度計(jì)法測(cè)定總RNA的純度和濃度，以及凝膠電泳法鑒定RNA的完整性。②逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)需參照試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)條件為：16℃，30 min；42℃，42 min；85℃，5 min。結(jié)束后立即1 μL cDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)。目的基因的引物設(shè)計(jì)是根據(jù)GeneBank提供的mRNA序列由上海生工合成，見表1所示。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，94℃變性14 s，61℃退火延伸58 s，共42個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，進(jìn)行PCR定量時(shí)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線等。為減小因RNA濃度定量誤差和RNA逆轉(zhuǎn)錄效率誤差等的影響，將三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后所得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt公式進(jìn)行分析[7]，計(jì)算公式為：ΔCt值=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)-ΔCt對(duì)照。用計(jì)算得到的值判定標(biāo)本中目的miRNA的表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 目的基因的引物設(shè)計(jì)Table 1 Primer design of the target genes

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，各組大鼠體重均有所增加，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組體重為：假手術(shù)組(418.32±36.84)g、模型組(436.73±29.65)g、陽性組(426.15±32.40)g、補(bǔ)腎壯骨顆粒組(422.51±21.04)g、有氧運(yùn)動(dòng)組(412.37±18.62)g、聯(lián)合干預(yù)組(435.09±31.43)g，各組大鼠平均體重?zé)o明顯差異(P>0.05)。

2.2 大鼠股骨生物力學(xué)指標(biāo)變化

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的左股骨最大負(fù)荷、左脛骨最大負(fù)荷和第四腰椎結(jié)構(gòu)強(qiáng)度均顯著降低(P<0.05)，表明大鼠去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型建造成功。與模型組相比，陽性組、有氧運(yùn)動(dòng)組、補(bǔ)腎壯骨顆粒組和聯(lián)合組的左股骨最大負(fù)荷、左脛骨最大負(fù)荷和第四腰椎結(jié)構(gòu)強(qiáng)度均顯著提高(P<0.05)。與陽性組相比，聯(lián)合干預(yù)組的左股骨最大負(fù)荷和第四腰椎結(jié)構(gòu)強(qiáng)度均顯著提高(P<0.05)。與有氧運(yùn)動(dòng)組相比，陽性組、補(bǔ)腎壯骨顆粒組和聯(lián)合干預(yù)組的左股骨最大負(fù)荷、左脛骨最大負(fù)荷和第四腰椎結(jié)構(gòu)強(qiáng)度均顯著提高(P<0.05)。見表2所示。

表2 各組大鼠股骨生物力學(xué)指標(biāo)變化情況(kg,±s)Table 2 The changes of biomechanical indexes of the femur in each group (kg, ±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與陽性組比較，&P<0.05；與有氧運(yùn)動(dòng)組比較，△P<0.05

Note: Compared with the sham-operated group,*P<0.05; compared with the model group,#P<0.05 compared with the positive group; compared with the aerobic exercise group,△P<0.05

2.3 PCR 產(chǎn)物鑒定

各產(chǎn)物的熔解曲線僅有1個(gè)峰，說明為產(chǎn)物較純，見圖1所示。

圖1 qRT-PCR擴(kuò)增曲線及溶解曲線Fig.1 The amplification curve and melting curve of genes

2.4 骨代謝相關(guān)基因表達(dá)情況

熒光定量PCR對(duì)骨代謝相關(guān)基因RANKL、OPG mRNA表達(dá)進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的RANKL和RANKL/OPG均顯著提高(P<0.05)，而OPG則顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，陽性組、有氧運(yùn)動(dòng)組、補(bǔ)腎壯骨顆粒組和聯(lián)合組的RANKL和OPG均顯著提高(P<0.05)，而RANKL/OPG顯著降低(P<0.05)。與陽性組相比，聯(lián)合干預(yù)組的RANKL和OPG均顯著提高(P<0.05)，而RANKL/OPG顯著降低(P<0.05)。見表3所示。

表3 各組骨代謝相關(guān)基因表達(dá)情況Table 3 The expression of bone metabolism related genes in each group

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與陽性組比較，&P<0.05；與有氧運(yùn)動(dòng)組比較，△P<0.05

Note: Compared with the sham-operated group,*P<0.05; compared with the model group,#P<0.05 compared with the positive group; compared with the aerobic exercise group,△P<0.05

3 討論

PMOP作為一種全球性的慢性疾病正悄無聲息在中老年女性人群中蔓延，被稱為中老年人的隱性殺手，調(diào)查顯示50歲及以上女性O(shè)P的患病率約為男性的2.5～3.5倍，尤其絕經(jīng)后激素水平急劇下降，PMOP發(fā)病率顯著升高，并且胸腰椎、髖骨、四肢等骨折患病率約為男性的1.5倍，骨折的發(fā)生極大降低中老年人的生活質(zhì)量，并且長期臥床可能誘發(fā)其他疾病給患者生命安全造成嚴(yán)重威脅[8,9]。目前，PMOP的治療策略與其他原因所致OP大致相同，然而采用補(bǔ)充雌激素、骨吸收抑制劑、鈣劑和維生素D3等針對(duì)發(fā)病的病理環(huán)節(jié)的傳統(tǒng)治療策略，雖然具有一定的治療效果，但并不能滿足大多數(shù)患者[10]。因此，進(jìn)一步篩選開發(fā)出安全高效的抗PMOP新藥物是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重要課題。

傳統(tǒng)中藥治療PMOP著重調(diào)動(dòng)內(nèi)因、辨證論治，具有標(biāo)本兼治、整體觀念等優(yōu)點(diǎn)，最終達(dá)到糾正機(jī)體激素失衡和負(fù)鈣平衡的功效。中醫(yī)認(rèn)為，腎為先天之本，主藏精，其盛衰與骨髓的生長發(fā)育和強(qiáng)勁衰弱密切相關(guān)[11]。絕經(jīng)后婦女血海無盈，骨髓生源不足，不能濡養(yǎng)骨骼，發(fā)為“骨痿”。正如《素問·痿論篇第四十四》曰：“腎主身之骨髓，腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”。因此，補(bǔ)腎填精壯骨是中醫(yī)治療PMOP的根本大法。補(bǔ)腎壯骨顆粒是根據(jù)鄧偉民教授創(chuàng)意的經(jīng)驗(yàn)方采用現(xiàn)代提取工藝手段分別從淫羊藿、鹿角膠、龜板膠、生地、骨碎補(bǔ)、肉桂、山藥、茯苓、三棱、水蛭等10味中藥提取有效成分組合構(gòu)成，方中淫羊藿、鹿角膠、龜板膠溫腎壯陽、強(qiáng)筋骨、益精養(yǎng)血、溫通經(jīng)脈；肉桂、生地、骨碎補(bǔ)散寒止痛、強(qiáng)骨溫筋、益陰生津；茯苓、山藥健脾和胃益腎；三棱、水蛭專治血瘀經(jīng)閉、血脈不調(diào)。諸藥合用共奏補(bǔ)腎壯骨、活血祛瘀功效，由于其療效顯著，目前臨床上已被廣泛應(yīng)用于OP治療，如陳東等[12]臨床觀察證實(shí)補(bǔ)腎壯骨方長期服用能明顯提高及穩(wěn)定老年性骨質(zhì)疏松癥患者骨礦含量、骨密度水平，降低新骨折率；又如鄧偉民等[13]通過5年觀察發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎壯骨沖劑長期服用能明顯提高及穩(wěn)定老年性骨質(zhì)疏松癥患者骨礦含量、骨密度水平，降低新骨折率。

適當(dāng)?shù)囊?guī)律運(yùn)動(dòng)是目前治療骨質(zhì)疏松癥的重要方法,對(duì)于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥而言，運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的力學(xué)刺激能引起細(xì)胞骨架形態(tài)的改變進(jìn)而活化或抑制細(xì)胞內(nèi)的生物信號(hào)改變，可以發(fā)揮等同于補(bǔ)充雌激素的作用,有助于提高骨密度，減少鈣質(zhì)流失[14]?；诖?，本研究中我們觀察了在有氧運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ)上服用補(bǔ)腎壯骨顆粒對(duì)改善去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松癥病情的協(xié)同效果，結(jié)果顯示聯(lián)合干預(yù)組的左股骨最大負(fù)荷和第四腰椎結(jié)構(gòu)強(qiáng)度均顯著高于陽性組、有氧運(yùn)動(dòng)組、補(bǔ)腎壯骨顆粒組，提示結(jié)合補(bǔ)腎壯骨顆粒和有氧運(yùn)動(dòng)的綜合性治療策略對(duì)于改善去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松癥病情更明顯，二者聯(lián)合應(yīng)用具有明顯的協(xié)同作用，可能由于二者作用機(jī)制不完全相同，將二者聯(lián)合治療PMOP具有互補(bǔ)功效。

正常情況下，骨吸收和骨形成之間維持動(dòng)態(tài)平衡，其平衡打破與眾多骨疾病發(fā)病密切相關(guān)。其中，由成骨細(xì)胞分泌的OPG、RANKL是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化成熟和生物活性的最終調(diào)節(jié)因子，在維持骨吸收和骨形成之間平衡中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠OPG基因可使小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松，而敲除RANKL基因可使骨密度提高[15]。因此，OPG/RANKL比值常被用來評(píng)價(jià)破骨細(xì)胞的活性。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合補(bǔ)腎壯骨顆粒的治療策略是否對(duì)OPG、RANKL產(chǎn)生影響，結(jié)果顯示聯(lián)合干預(yù)組的RANKL/OPG顯著低于陽性組、有氧運(yùn)動(dòng)組、補(bǔ)腎壯骨顆粒組，提示二者聯(lián)合干預(yù)可發(fā)揮明顯的協(xié)同作用可能與抑制破骨細(xì)胞的活性作用有關(guān)，從而有效改善去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松癥狀，促進(jìn)骨形成。然而，關(guān)于有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合補(bǔ)腎壯骨顆粒如何調(diào)節(jié)OPG、RANKL的表達(dá)水平仍有待繼續(xù)深入研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)腎壯骨顆粒結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)的綜合性治療策略對(duì)于改善去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松癥病情更明顯，二者聯(lián)合應(yīng)用具有明顯的協(xié)同作用，可能主要通過降低骨組織中OPG/RANKL比值，從而抑制破骨細(xì)胞的活性實(shí)現(xiàn)。本研究為臨床上治療PMOP選擇治療策略提供了一定理論依據(jù)。