孫振雙 徐道明 朱媛媛 陶文靜 耿元卿 郭海英* 沈蘊(yùn)茹

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023 2. 江蘇省中醫(yī)院康復(fù)科，江蘇 南京 210023

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是一種與衰老有關(guān)的常見病，由于絕經(jīng)后婦女體內(nèi)雌激素水平迅速降低，導(dǎo)致骨量丟失顯著增加，全身骨密度(BMD)下降及骨組織結(jié)構(gòu)變化，使骨脆性增多易于骨折[1]。隨著我國的人口老齡化進(jìn)程加快，骨質(zhì)疏松癥已成為影響老人尤其是絕經(jīng)后婦女生活質(zhì)量的嚴(yán)重社會問題。近年來研究發(fā)現(xiàn)，將雌激素缺乏作為骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制不夠完善。雌激素的分泌減少、活性氧(reactive oxygen species, ROS) 的增加是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的重要原因[2]。氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制[3,4]。溫腎固疏方以補(bǔ)腎溫陽，健骨固疏為組方原則，在絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松防治中，此方臨床運(yùn)用多年且安全有效。本研究通過建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型，觀察溫腎固疏方對去卵巢PMOP大鼠骨密度(BMD)、骨代謝指標(biāo)及氧化應(yīng)激指標(biāo)的藥效作用，探討中藥溫腎固疏方治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制，以期為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的防治提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 動物

健康9月齡未孕SPF級SD大鼠48只，雌性，體重(350±30)g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號SYXK(蘇)2014-0001-201508662。

1.2 儀器、藥物及試劑

溫腎固疏方各藥物組成由南京中醫(yī)藥大學(xué)百草堂藥房提供，方藥組成: 熟地、淫羊藿、黨參、丹參、枸杞、骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂等7味藥，按比例8∶8∶4∶4∶4∶4∶3配伍，兩次煎液過濾合并濃縮；戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂，德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，批號180A)；10%水合氯醛溶液(中國人民解放軍第一醫(yī)院，批號20130312)，青霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號 B140808)。血清I型原膠原分子N端前肽(PINP) 試劑盒、骨鈣素(BGP) 試劑盒、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP5b) 試劑盒、核因子-κB受體活化因子配體(RANKL) 試劑盒、骨保護(hù)素(OPG)試劑盒 (Jiangsu Yutong Biotechnology Co.LTD，批號201604)。過氧化氫酶(CAT)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20160420)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20160418)；丙二醛(MDA)測試盒(南京建成生物工程研究所，批號：20160419)。數(shù)字化雙能X線骨密度儀(MEDIX-90，法國MEDILINK公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥模型的建立：采用雙側(cè)性腺(卵巢)摘除法[5]制備絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型。大鼠在室溫22±2℃、清潔級環(huán)境飼養(yǎng)1 w后，根據(jù)體重將SD大鼠隨機(jī)分為兩組:假手術(shù)組(SHAM，n=8)和去卵巢組(OVX，n=40)。OVX組首先腹腔注射35 mg/kg的10%水合氯醛溶液麻醉，然后背部切口行去勢手術(shù)，剪除雙側(cè)卵巢，分層縫合。SHAM組大鼠背部切口手術(shù)后，僅切除卵巢旁約1g重的脂肪，不切除卵巢，最后每只大鼠經(jīng)后肢肌肉注射8萬U青霉素，連續(xù)7 d，密切觀察。

1.3.2 分組及干預(yù)：去卵巢組隨機(jī)分為5組，分別為：模型對照組(OVX)，中藥高、中、低組及雌二醇組。大鼠自由攝食、飲水，每周稱量體重1次。各組大鼠均于手術(shù)后1個月，切口愈合后開始分組治療干預(yù)。大鼠等效劑量按成人6.3倍計(jì)算，給藥容積0.5 mL/100 g，中藥高劑量組：溫腎固疏方(21.21 g生藥/(kg·d))；中藥中劑量組：溫腎固疏方(10.605 g生藥/(kg·d))；中藥低劑量組：溫腎固疏方(5.3025 g生藥/(kg·d))。雌二醇組：戊酸雌二醇(10 μg/(kg·d))。模型組：給予生理鹽水0.5 mL/100 g灌胃；假手術(shù)組給予生理鹽水0.5 mL/100 g灌胃；各組灌胃持續(xù)2個月。

1.3.3 標(biāo)本釆集及測定：大鼠末次施治后，禁食24 h，次日取材。處死前稱量大鼠體質(zhì)量，用10%水合氯醛溶液(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，右心室抽血處死。血液收集后，4℃靜置3 h，3000 r/min離心10 min，分離血清。用酶聯(lián)免疫法(ELISA)法檢測OPG、PINP、sRANKL、BGP、TRACP5b；比色法檢測血清中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)MDA、CAT、SOD。骨標(biāo)本收集:大鼠處死后，取右側(cè)脛骨置于4%多聚甲醛中固定，用作骨形態(tài)學(xué)改變觀察。骨密度(BMD) 測定：取大鼠右側(cè)脛骨，放在有機(jī)玻璃盒支架上固定，以MEDIX-90骨密度測定儀掃描其BMD。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨形態(tài)學(xué)改變

光鏡下觀察病理切片顯示：假手術(shù)組可見骨細(xì)胞排列整齊，骨小梁中的骨細(xì)胞清晰可見，骨小梁完整，排列規(guī)則，骨髓中造血細(xì)胞豐富，脂肪細(xì)胞大小一致，形態(tài)正常。模型組大鼠可見骨松質(zhì)骨小梁纖細(xì)明顯，數(shù)量明顯減少，部分骨小梁斷裂呈現(xiàn)典型骨質(zhì)疏松改變， 提示造模成功。各干預(yù)組中溫腎固疏方高、 中劑量組、陽性藥物組可見骨松質(zhì)骨小梁纖細(xì)但不明顯，數(shù)量減少不明顯，較模型組有明顯減輕。溫腎固疏方低劑量組較模型組骨組織病理形態(tài)有改善，但無明顯差異。見圖1。

A．假手術(shù)組；B．模型組；C．戊酸雌二醇片組；D.溫腎固疏方低劑量組；E．溫腎固疏方中劑量組；F．溫腎固疏方高劑量組圖1 溫腎固疏方對骨質(zhì)疏松大鼠骨形態(tài)的影響(HE，×100)Fig.1 Effect of the warming kidney and astringing formula on bone morphology of the rats (HE，×100)

2.2 各組大鼠骨密度變化

模型組股骨近端和股骨總BMD均明顯降低，假手術(shù)組與之比較BMD均明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，雌激素組、溫腎固疏方高、中劑量組BMD均明顯增高(P<0.05)。見表1。

表1 溫腎固疏方對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響(mg/cm2,±s，n=8)Table 1 Effect of the warming kidney and astringing formula on BMD of the rats with osteoporosis(mg/cm2,±s)

注：與模型組比較，*P<0.05，△P<0.01

2.3 各組大鼠血清骨代謝指標(biāo)變化

假手術(shù)組與模型組比較血清TRACP5b、BGP、PINP明顯降低(P<0.01)，而OPG含量、OPG/sRANKL比值明顯升高(P<0.05)，sRANKL含量降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與模型組相比：雌激素組TRACP5b、PINP明顯下降(P<0.05)，BGP下降顯著(P<0.01)；溫腎固疏方低劑量組大鼠血清OPG含量明顯升高(P<0.05)，OPG/sRANKL比值顯著升高(P<0.01)。溫腎固疏方中劑量組TRACP5b含量明顯下降(P<0.05)，PINP、BGP含量下降顯著(P<0.01)，血清OPG含量、OPG/sRANKL比值明顯升高(P<0.05)。溫腎固疏方高劑量組大鼠血清PINP、BGP含量明顯下降 (P<0.05)，OPG/sRANKL比值明顯升高(P<0.05)。溫腎固疏方各劑量組sRANKL含量均下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 溫腎固疏方對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝的影響±s，n=7)Table 2 Effect of the warming kidney and astringing formula on TRACP5b, BGP, PINP, OPG, and sRANKL of rats with osteoporosis (±s，n=7)

注：與模型組比較，*P<0.05,△P<0.01

2.4 各組大鼠血清抗氧化應(yīng)激指標(biāo)變化

假手術(shù)組與模型組比較血清MDA活力明顯下降 (P<0.05)，而CAT活力顯著升高(P<0.01)，SOD活力升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與模型組相比：雌激素組MDA活力明顯降低(P<0.05)，溫腎固疏方中劑量組大鼠血清CAT活力明顯升高(P<0.05)，MDA活力明顯降低(P<0.05)。高劑量組CAT活力顯著升高(P<0.01)。雌激素與溫腎固疏方各劑量組SOD活力均升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 溫腎固疏方對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響±s，n=7)Table 3 Effect of the warming kidney and astringing formula on CAT, SOD, and MDA of rats ±s，n=7)

注：與模型組比較，*P<0.05,△P<0.01

3 討論

雙側(cè)卵巢摘除建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠模型是美國食品與藥物管理局(FDA)和世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的最佳模型。此模型構(gòu)建后大鼠雌激素水平迅速下降，表現(xiàn)為骨高轉(zhuǎn)換、骨吸收增加，造成骨質(zhì)疏松。FDA建議采用月齡6～10個月的大鼠造模，本研究選取9月齡大鼠造模，可較好的模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松狀態(tài)，本研究中模型組股骨近端和股骨總BMD均明顯降低，假手術(shù)組與之比較BMD均明顯增高(P<0.05)；結(jié)合各組大鼠的骨形態(tài)學(xué)改變提示了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠模型造模成功，與模型組比較，雌激素組、溫腎固疏方高、中劑量組BMD均明顯增高(P<0.05)。提示溫腎固疏方可明顯改善骨質(zhì)疏松大鼠骨密度。

婦女絕經(jīng)后期，與衰老相關(guān)的骨損失及伴隨的改變使雌激素不足相關(guān)的骨質(zhì)流失加劇。衰老影響機(jī)體抗氧化效應(yīng)，被視為影響骨組織易受氧化應(yīng)激攻擊的重要因素，它與絕經(jīng)后的大多數(shù)代謝改變和疾病密切相關(guān)[6]。絕經(jīng)期婦女與絕經(jīng)后模型小鼠均被證實(shí)其抗氧化水平顯著下降，從而導(dǎo)致氧自由基水平的上升和骨量的丟失[7,8]。絕經(jīng)后婦女血清炎性細(xì)胞因子濃度和促氧化生物標(biāo)志物，如4-羥基壬烯醛和丙二醛均高于絕經(jīng)前婦女[9]。本研究結(jié)果顯示模型組抗氧化指標(biāo)CAT、SOD活力下降，MDA活力升高，各給藥組血清CAT、SOD活力均有提高，溫腎固疏方中、高劑量組CAT活力顯著增加。雌激素組及溫腎固疏方中劑量組血清MDA活性降低。提示與上述研究相符合，溫腎固疏方具有較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激損傷作用。

OPG/RANK/RANKL信號通路是雌激素參與破骨細(xì)胞生成和抑制骨吸收作用的重要路徑之一，其參與骨質(zhì)疏松的發(fā)病[10]。隨著年齡的增加，成骨細(xì)胞的存活率呈下降趨勢，導(dǎo)致骨代謝軸失衡，OPGmRNA表達(dá)降低和RANKLmRNA表達(dá)增高可能是增齡性骨量流失的重要原因之一[11]。研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后婦女的骨密度與OPG水平呈正相關(guān)[12,13]，OPG水平下降提示絕經(jīng)后婦女的骨代謝正處于高轉(zhuǎn)換水平，OPG水平和OPG/RANKL 比值升高時，說明骨形成增加而骨吸收減少[14]。本研究中模型組與假手術(shù)組比較血清OPG/sRANKL比值明顯升高，而OPG含量下降明顯，提示模型組骨代謝處于高轉(zhuǎn)換水平。溫腎固疏方能顯著提高大鼠血清OPG含量及OPG/sRANKL比值，說明其可促進(jìn)骨形成增加，減少骨吸收；PINP是骨形成的特異和敏感指標(biāo)，2012年國際骨健康聯(lián)盟推薦血清PINP為骨形成參考指標(biāo)[15]。研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女血清PINP值明顯高于絕經(jīng)后骨量減少或骨量正常婦女[16]。BGP是反映成骨細(xì)胞活動度的特異性骨代謝指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女BGP與雌激素、骨密度呈負(fù)相關(guān)[17]。女性絕經(jīng)后血清TRACP5b水平較絕經(jīng)前明顯增高，與骨密度呈負(fù)相關(guān)，是骨質(zhì)疏松癥篩查、診斷、藥物治療效果檢測的敏感指標(biāo)。TRACP5b不受晝夜節(jié)律變化及肝腎功能影響，是高特異性骨吸收指標(biāo)[18]。研究結(jié)果表明雌激素及溫腎固疏方能顯著降低OVX所致的PINP、BGP、TRACP5b水平的增加。以上結(jié)果提示溫腎固疏方可能通過降低骨代謝高轉(zhuǎn)換水平，提高成骨細(xì)胞活性，使骨形成增加，減少骨吸收而發(fā)揮作用抗骨質(zhì)疏松作用。

中醫(yī)認(rèn)為“腎主骨，生髓”。腎藏先天之精，腎陽為五臟陽氣的根本。本病的發(fā)病基礎(chǔ)是腎精衰少，根本在于腎虛陽虧。溫腎固疏方以補(bǔ)腎填精，偏以補(bǔ)陽組方，適于與衰老相關(guān)的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的防治。方中多為抗骨質(zhì)疏松常用藥且具有抗氧化作用。如：淫羊藿可明顯降低血清MDA，提高 SOD、性激素水平，清除活性氧[19]。補(bǔ)骨脂素(psoralen)可能通過植物雌激素OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)產(chǎn)生骨保護(hù)作用，從而抑制骨吸收，防治骨質(zhì)疏松[20]。枸杞多糖對D-半乳糖致衰引起的小鼠肝臟、腦組織及血清中SOD含量下降、MDA 含量上升具有比較顯著的抑制作用，能較好地促進(jìn)機(jī)體對氧自由基等的清除[21]。溫腎固疏方藥可能具有抗氧化應(yīng)激及抗骨質(zhì)疏松的雙重作用。

本實(shí)驗(yàn)通過對去卵巢大鼠骨密度、骨代謝及氧化應(yīng)激指標(biāo)的研究，證實(shí)溫腎固疏方通過降低骨代謝高轉(zhuǎn)換水平，使骨形成增加，減少骨吸收而發(fā)揮作用抗骨質(zhì)疏松作用，同時具有抗氧化應(yīng)激作用，抗氧化應(yīng)激機(jī)制可能是本方抗骨質(zhì)疏松的潛在機(jī)制，因此可能較適合絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松這一與衰老相關(guān)的疾病的治療。但溫腎固疏方抗氧化應(yīng)激防治骨質(zhì)疏松的具體機(jī)制目前尚不明確，有待進(jìn)一步研究。