王偉趙丹郭巍，2李新娜張雅昆閆曉平

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)中心，保定 071001；2. 北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；3. 邢臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，邢臺 054000）

Bt Cry8Ea蛋白對華北大黑鰓金龜幼蟲（Holotrichia oblita）中腸微生物菌群的影響

王偉1趙丹1郭巍1，2李新娜3張雅昆1閆曉平1

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)中心，保定 071001；2. 北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；3. 邢臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，邢臺 054000）

Bt Cry8Ea蛋白對華北大黑鰓金龜幼蟲有特異的殺蟲活性，通過中腸微生物宏基因組分析研究了Bt Cry8Ea蛋白與華北大黑鰓金龜幼蟲中腸微生物的相互作用。解剖正常飼喂和飼喂Cry8Ea蛋白的華北大黑鰓金龜Holotrichia oblita二齡幼蟲中腸，提取中腸微生物宏基因組DNA，構(gòu)建16S rDNA文庫。利用PCR-RFLP 方法分析兩個(gè)處理中腸微生物16S rDNA酶切片段多態(tài)性（MspⅠ，RsaⅠ和Hae Ⅲ內(nèi)切酶），不同克隆測序后與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定中腸微生物種屬。結(jié)果顯示，正常飼喂的華北大黑鰓金龜幼蟲中腸微生物共檢出30種細(xì)菌，優(yōu)勢菌群為變形菌門（Proteobacteria）：（Desulfosporosinus，29.63%）；厚壁菌門（Firmicutes）：梭菌屬（Clostridium，12.59%）和芽孢桿菌屬（Bacillus，10.37%），而飼喂Cry8Ea蛋白的華北大黑鰓幼蟲中共檢出4種細(xì)菌，優(yōu)勢菌群為厚壁菌門（Firmicutes）：腸球菌屬（Enterococcus，50%）和鏈球菌屬（Streptococcus，46.88%）。結(jié)果表明，飼喂Cry8Ea蛋白后，中腸微生物的菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化。

華北大黑鰓金龜；中腸微生物；Bt Cry8Ea蛋白；PCR-RFLP

昆蟲中腸內(nèi)豐富的營養(yǎng)物質(zhì)以及獨(dú)特的理化環(huán)境為微生物的生長與繁殖提供了便利條件，其中大部分正常菌群對宿主無害，統(tǒng)稱為有益菌群［1］。正常情況下有益菌群處于動(dòng)態(tài)平衡中，可通過合成多種消化酶參與昆蟲體內(nèi)的消化過程，協(xié)助降解有毒物質(zhì)［2］，提高昆蟲防御能力［3］，進(jìn)而維持蟲體的正常生理機(jī)能。昆蟲中腸內(nèi)有益菌群的動(dòng)態(tài)平衡一旦被打破，會(huì)對昆蟲的生理生化機(jī)能乃至生長發(fā)育產(chǎn)生一定的影響。

昆蟲腸道微生物包括細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物和古生菌，其中細(xì)菌所占比例較高，為主要菌群。不同昆蟲，不同發(fā)育階段中腸內(nèi)的微生物總量和優(yōu)勢菌群也不同。黃勝威等［4］發(fā)現(xiàn)暗黑鰓金龜（Holotrichia parallela ）幼蟲中腸微生物主要以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和梭桿菌門細(xì)菌為主，其中厚壁菌門和變形菌門菌群最多。張玨峰［1］發(fā)現(xiàn)二化螟（Chilo suppressalis）中腸細(xì)菌群落的組成及豐富度隨著蟲體抗藥性的不同存在明顯差異；王堯等［5］發(fā)現(xiàn)黃粉蟲腸道菌群在黃粉蟲蛋白質(zhì)消化過程中發(fā)揮一定的作用。

華北大黑鰓金龜（Holotrichia oblita）屬鞘翅目，鰓金龜科，幼蟲又名蠐螬，是重要的地下害蟲。蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）可分泌具有殺蟲活性的殺蟲晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins，ICPs）和多種營養(yǎng)期殺蟲蛋白（Vegetative insecticidal protein，VIP），對包括蠐螬在內(nèi)的多種昆蟲具有殺蟲活性［6，7］。昆蟲中腸是消化食物的主要場所，也是Bt殺蟲蛋白的靶標(biāo)部位，不同昆蟲飼喂Bt殺蟲蛋白后對昆蟲腸道細(xì)菌的影響各不相同。飼喂商業(yè)型B. thuringiensis subspecies kurstaki（DiPel DF），發(fā)現(xiàn)該Bt菌株對舞毒蛾（Porthetria dispar）幼蟲的毒殺作用依賴于中腸微生物Enterobacter sp，飼喂舞毒蛾抗生素降低腸桿菌濃度后，Bt的殺蟲活性降低［8］。與此相類似，飼喂鱗翅目小紅蛺蝶（Vanessa cardui），煙草天蛾（Manduca sexta），菜粉蝶（Pieris rapae）抗生素后，改變了蟲體內(nèi)中腸微生物的結(jié)構(gòu)組成，降低了蟲體對Bt殺蟲蛋白的敏感性［9］。同時(shí)研究，分別飼喂二化螟幼蟲Bt殺蟲蛋白Cry1Ab、Cry1Ab和Cry1Ca后，相對于對照組，幼蟲的中腸微生物菌群的豐富度發(fā)生改變，優(yōu)勢菌群比重也發(fā)生改變［10］。由此可見，蟲體內(nèi)中腸微生物種群結(jié)構(gòu)變化在Bt蛋白的殺蟲機(jī)理中發(fā)揮重要作用。Cry8Ea對華北大黑鰓金龜幼蟲有特異殺蟲活性，LC50為0.267 9 μg/mL［11］，本研究通過比較正常飼喂和飼喂Cry8Ea蛋白的華北大黑鰓金龜二齡幼蟲中腸微生物菌群變化，揭示Cry8Ea蛋白對微生物菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試?yán)ハx 于河北省保定地區(qū)采集華北大黑鰓金龜，放入裝有細(xì)土的培養(yǎng)箱（長50 cm，寬37 cm，高22.5 cm）中，并保持箱中細(xì)土的濕度，野外采集的榆樹葉室內(nèi)飼養(yǎng)。每日觀察，至成蟲發(fā)生交尾后，每周一次翻土，將初孵幼蟲取出放入裝有細(xì)土的小盒中（每盒10-15頭）培養(yǎng)至二齡，分裝至24孔板中飼養(yǎng)，避免蠐螬自相殘殺。幼蟲分出后即可飼喂新鮮的土豆塊。

1.1.2 主要試劑 DNA抽提緩沖液：1.5 mol/L NaCl，100 mmol/L磷酸鹽緩沖液，100 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCL；10 mg/mL蛋白酶K（BOSTER）；1 mol/L IPTG、20 mg/mL X-gal和100 mg/mL 氨芐青霉素；DNA純化試劑盒（TIANGEN）；pGEM-T Easy載體（Promega）；限制性內(nèi)切酶：MspⅠ，RsaⅠ和Hae Ⅲ（Promega）。

1.2 方法

1.2.1 中腸的提取與分離 將正常飼喂與飼喂Cry8Ea蛋白的華北大黑鰓金龜二齡幼蟲分別用無菌水漂洗30 s，晾干后用75%酒精擦拭清潔幼蟲體表，75%酒精體表消毒2 min，再用無菌水漂洗以徹底去除殘留體表的酒精。在無菌條件下，用已消毒的剪刀從兩側(cè)剪開幼蟲蟲體，取出中腸，放入1.5 mL的EP管中。

1.2.2 DNA的提取和16S rDNA片段的擴(kuò)增 腸道微生物總DNA的提取參照黃勝威采用的方法［4］。以提取的中腸微生物總DNA為模板，用細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），1492R（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：模板DNA 2 μL，10×Reaction Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，10 μmol/L 27F 0.5 μL，10 μmol/L1492R 0.5 μL，Taq polymerase 0.2 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性50 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min 20 s，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA純化試劑盒純化回收。

1.2.3 16S rDNA文庫的構(gòu)建 將純化的PCR產(chǎn)物連接至pGEM-T Easy載體（Promega）中，構(gòu)建華北大黑鰓金龜中腸細(xì)菌16S rDNA文庫。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TG1感受態(tài)中，在含有IPTG、X-Gal和氨芐青霉素的LB平板上37℃培養(yǎng)過夜。挑取白色菌落，用通用引物T7（5′-TAATACGACTCACTATAGGG -3′），SP6（5′-ATTTAGGTGACACTATA-3′） 進(jìn) 行PCR擴(kuò)增鑒定。PCR反應(yīng)體系為：模板DNA 2 μL，10×Reaction Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，10 μmol/L T7 0.5 μL，10 μmol/L SP6 0.5 μL，Taq polymerase 0.2 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min，94℃變性40 s，57℃退火40 s，72℃延伸1 min 10 s，30個(gè)循環(huán)。

1.2.4 PCR-RFLP 對陽性克隆所攜帶的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后分別用3種限制性酶Msp I，Rsa I和Hae III酶進(jìn)行限制性酶切消化（37℃，3 h），用2%的瓊脂糖凝膠電泳分析酶切片段多態(tài)性。根據(jù)Msp I，Rsa I和Hae III 3種酶切基因片段多態(tài)圖譜為基礎(chǔ)進(jìn)行分類。

1.2.5 測序及序列分析 根據(jù)酶切圖譜將陽性克隆送去上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果通過NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast 比對分析，利用clustalx1.83和MEGA6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 華北大黑鰓金龜幼蟲中腸微生物總DNA的提取及16S rDNA的PCR擴(kuò)增

提取正常飼喂與飼喂Cry8Ea蛋白的華北大黑鰓金龜二齡幼蟲中腸微生物的基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示所提取的基因組DNA條帶完整性好，特異度高。分別以兩個(gè)處理的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1 500 bp大小的目的條帶（圖2），與預(yù)期結(jié)果相符，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 16S rDNA的PCR-RFLP分析

將正常飼喂組與飼喂蛋白組酶切圖譜中呈現(xiàn)不同帶型的陽性克隆送去測序（圖3，圖4）。其中正常飼喂組測序150個(gè)，飼喂蛋白組測序50個(gè)。結(jié)果表明正常飼喂組華北大黑鰓金龜幼蟲中腸微生物種群含有30種細(xì)菌。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示（圖5），分別屬于5種細(xì)菌門：變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）和梭桿菌門（Fusobacteria），優(yōu)勢細(xì)菌菌群為變形菌門的Desulfosporosinus（29.63%），厚壁菌門的梭菌屬（Clostridium，12.59%）和芽胞桿菌屬（Bacillus，10.37%）（表1）。飼喂蛋白組華北大黑鰓金龜幼蟲中腸微生物中共檢測出4種細(xì)菌（表2），其中優(yōu)勢菌群為腸球菌屬（Enterococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）。

圖1 中腸微生物基因組DNA

圖2 16S rDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

華北大黑鰓金龜幼蟲（蠐螬）屬于土棲性地下害蟲，體型較大，生活隱蔽，抗藥性強(qiáng)，化學(xué)防治比較困難，農(nóng)藥的大量使用嚴(yán)重污染環(huán)境。因此，尋找新的蠐螬防治方法十分必要。近年來生物防治因其特異性好、安全性高，受到人們的重視。Bt殺蟲蛋白的作用范圍較廣，包括鱗翅目的天蠶蛾［12］、家蠶［13］，直翅目的東亞飛蝗［14］，蜚蠊目的東方蜚蠊［15］。對Bt殺蟲蛋白作用機(jī)制的研究：一方面認(rèn)為可溶性晶體蛋白經(jīng)中腸蛋白酶活化后與中腸上皮細(xì)胞受體結(jié)合，破壞細(xì)胞膜的完整性，最終導(dǎo)致蟲體死亡［16］；另有研究表明，中腸微生物Enterobacter sp 在Bt殺蟲蛋白對舞毒蛾幼蟲的毒殺作用中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，而且這種現(xiàn)象也存在于其他鱗翅目小紅蛺蝶，煙草天蛾，菜粉蝶［8，9］。

圖3 正常飼喂組16S rDNA陽性克隆Msp I（A），Rsa I（B）和Hae III（C）部分酶切圖譜

圖4 飼喂Cry8Ea組16S rDNA陽性克隆Msp I（A），Hae III（B）和Rsa I（C）部分酶切圖譜

昆蟲中腸是消化食物的主要場所，也是Bt殺蟲蛋白的靶標(biāo)部位，不同種類、不同時(shí)期、不同地區(qū)昆蟲中腸內(nèi)微生物菌群結(jié)構(gòu)組成差異較大［17，18］。有研究表明橘小實(shí)蠅 Bactrocera dorsalis 中與免疫調(diào)控有關(guān)的PGRP-LB 和 PGRP-SB基因的缺失會(huì)影響蟲體中腸微生物菌落的結(jié)構(gòu)與組成［19］。由此可見，中腸微生物的多樣性以及豐富度與昆蟲的生長發(fā)育密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用16S rDNA PCR-RFLP的方法對飼喂Cry8Ea毒素蛋白后，華北大黑鰓金龜二齡幼蟲中腸微生物菌群的組成和多樣性進(jìn)行分析結(jié)果顯示，正常飼喂組華北大黑鰓金龜幼蟲中腸微生物種群由30種細(xì)菌組成，優(yōu)勢菌群為變形菌門：（Desulfosporosinus，29.63%）；厚壁菌門：梭菌屬（Clostridium，12.59%）和芽孢桿菌屬（Bacillus，10.37%）；而飼喂殺蟲蛋白后幼蟲中腸微生物種類明顯減少，共檢測出4種細(xì)菌；優(yōu)勢菌群變?yōu)楹癖诰T：腸球菌屬（Enterococcus）和鏈球菌屬（Streptococcus），菌群比例也發(fā)生變化分別上升為50%與46.88%。有研究將Bt殺蟲蛋白飼喂二化螟幼蟲，解剖中腸檢測其微生物結(jié)構(gòu)組成，發(fā)現(xiàn)二化螟幼蟲中腸細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化［10］，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。推測中腸微生物菌群的改變是由于飼喂Bt殺蟲蛋白后對中腸內(nèi)的pH值，離子環(huán)境等產(chǎn)生影響，從而改變了中腸微生物的生境，破壞了原有微生物菌群的動(dòng)態(tài)平衡所致，但Bt蛋白殺蟲活性的發(fā)揮是否依賴于特定的關(guān)鍵中腸微生物，有待進(jìn)一步的研究。

圖5 基于16S rDNA序列的正常飼喂的華北大黑鰓金龜幼蟲中腸微生物系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 正常飼喂組華北大黑鰓金龜幼蟲中腸細(xì)菌種類

表2 飼喂Cry8Ea蛋白華北大黑鰓金龜幼蟲中腸細(xì)菌種類

4 結(jié)論

正常飼喂和飼喂Cry8Ea蛋白華北大黑鰓金龜二齡幼蟲中腸微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，中腸微生物菌群的多樣性和豐度都有很大的差異性。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Effects of Bt Cry8Ea Protein on the Midgut Microbial Flora of Holotrichia oblita Larvae

WANG Wei1ZHAO Dan1GUO Wei1，2LI Xin-na3ZHANG Ya-kun1YAN Xiao-ping1
（1. College of Plant Protection，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001；2. College of Plant Science and Technology，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206；3. Xingtai Academy of Agricultural Sciences，Xingtai 054000）

Bt Cry8Ea protein presents insecticidal activity to Holotrichia oblita larvae. The interaction between Bt Cry8Ea protein and the midgut microorganism in H. oblita larvae was investigated by metagenome DNA analysis. The midguts in normal-fed or Cry8Ea protein-fed H. oblita（2nd-instar larva）were collected and then used to extract metagenome DNAs of midgut microorganism for constructing 16S rDNA gene libraries. Polymerase chain reaction restriction fragment polymorphism（PCR-RFLP）was employed to determine the polymorphisms of 16S rDNA enzyme-spliced fragments（Msp I，Rsa I，and Hae III restriction enzyme）from the midgut microorganism of two fed larvae. Different types of clones were sequenced and then aligned with NCBI gene database，and the phylogenetic tree was constructed to study the differences of microbial communities. The results showed that there were 30 bacteria in the normal group of H. oblita，and the predominant bacteria were Desulfosporosinus（29.63%），Clostridium（12.59%），and Bacillus（10.37%）respectively. However，there were only 4 bacteria in the Cry8Ea protein-fed H. oblita group，and the predominant bacteria were Enterococcus（50%）and Streptococcus（46.88%）. These data revealed that the treatment with Cry8Ea protein changed the abundance and composition of midgut microbial flora.

Holotrichia oblita；midgut microorganism；Bt Cry8Ea protein；PCR-RFLP

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0236

2017-03-25

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-14）

王偉，男，博士研究生，研究方向：生防微生物與基因工程；E-mail：wwjiayou85@126.com

郭巍，女，博士，研究方向：有害生物控制與分子機(jī)理；E-mail：1787421502@qq.com