王佳梅 安雪嬌 張治國

（中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

研究報告

水稻無蠟質(zhì)葉片突變體wcl1的圖位克隆

王佳梅 安雪嬌 張治國

（中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

從水稻T-DNA插入突變體庫中篩選獲得1份葉片表皮無蠟質(zhì)的突變體wcl1（Wax Crystal-Sparse Leaf 1），突變體wcl1有如下主要特征：一是突變體葉片角質(zhì)層蠟質(zhì)減少，二是突變體的干旱敏感性高于野生型。通過圖位克隆技術(shù)，克隆了wcl1基因，其編碼酮酯酰輔酶A（LOC_OS09g25850），在突變體中LOC_OS09g25850基因的第10個外顯子處鳥嘌呤（G）突變?yōu)樾叵汆奏ぃ═）導致轉(zhuǎn)錄提前終止，經(jīng)分析表明突變體wcl1是一個wsl2基因的等位突變體。

水稻；無蠟質(zhì)葉片突變體；圖位克隆

植物角質(zhì)層蠟質(zhì)是一層覆蓋在植物葉片表面的表皮細胞的脂肪性物質(zhì)，它具有防止植物體內(nèi)水分喪失［1-3］、對抗非生物脅迫干旱［4］、保護植物抵御紫外輻射以及幫助葉片免受積聚灰塵、花粉和空氣污染［5］的影響、抵抗細菌和真菌類病原菌［6-8］等作用。研究表明，有蠟質(zhì)（白霜狀）表型的材料其抗旱節(jié)水性和產(chǎn)量都要高于無蠟質(zhì)表型的材料［9，10］。雙子葉植物擬南芥是典型的葉片角質(zhì)蠟質(zhì)含量低的植物，葉片表面缺乏蠟質(zhì)晶體，而單子葉模式植物水稻葉片角質(zhì)蠟質(zhì)含量豐富。水稻作為重要的模式作物，其蠟質(zhì)調(diào)控基因的研究將有利于提高其抗逆能力。目前，在擬南芥中對表皮蠟質(zhì)的合成基因的調(diào)控研究較多［11-15］，而對水稻蠟質(zhì)合成途徑研究較少。迄今，在水稻中已克隆了13個蠟質(zhì)相關(guān)基因，其中wda1是水稻中第一個被克隆的蠟質(zhì)基因，wda1突變體花藥表面蠟質(zhì)晶體減少，花粉小孢子發(fā)育受阻，花粉外壁發(fā)育缺陷，從而雄性不育。wsl1基因是第一個克隆到的、影響水稻葉片表面蠟質(zhì)含量的基因，編碼水稻KCS基因家族一員。大多蠟質(zhì)基因過表達能夠顯著提高植物的抗旱性，但是部分附帶著一些不利農(nóng)藝性狀：如矮化、育性低等形態(tài)特點，限制了這些蠟質(zhì)基因的進一步應(yīng)用。

為進一步研究水稻葉片蠟質(zhì)合成的作用機理，利用本實驗室前期建立的一個水稻大容量T-DNA插入突變體庫［17］，從突變體庫篩選獲得15份葉片不粘水的突變體。本研究對其中一份無蠟質(zhì)突變體wcl1（Wax Crystal-Sparse Leaf 1）開展研究，從遺傳、表型特征上進行分析，并圖位克隆控制突變體wcl1的基因，進一步探索利用水稻無蠟基因提高水稻耐旱的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻無蠟質(zhì)突變體wcl1來自本實驗室所創(chuàng)制的粳稻品種日本晴（Oryza sativa L. japonica cv. Nipponbare）T-DNA插入突變體庫。經(jīng)過多次自交，突變體wcl1性狀穩(wěn)定遺傳，后代無性狀分離。

1.2 方法

1.2.1 遺傳規(guī)律和表型性狀統(tǒng)計 將突變體wcl1種植農(nóng)科院試驗基地，觀察表型。水稻成熟后統(tǒng)計其農(nóng)藝性狀。同時將突變體wcl1和野生型進行正反交，統(tǒng)計F2代分離規(guī)律。

1.2.2 突變體wcl1和野生型水稻葉片的掃描電鏡觀察 在正常大田生長條件下，在抽穗期取野生型和突變體的劍葉，置于空氣中自然風干，將樣品置于JEOUFC-1600鍍膜機上噴金后，在掃描電子顯微鏡（JSM-6380LV）下觀察、拍照。

1.2.3 圖位群體的構(gòu)建 將突變體wcl1與秈稻廣親和親本Dular進行正反交，收獲F1、F2種子，將F2種于大田，取隱性單株進行遺傳定位和基因克隆。定位群體、日本晴及Dular的葉片DNA提取參照改進的CTAB法［18］。初定位用3個混池，每個混池由3個隱性單株組成，同時提取500份隱性表型單株DNA用于精細定位。

1.2.4 圖位克隆

1.2.4.1 分子標記設(shè)計及PCR擴增 基于不同水稻品種產(chǎn)生的基因組插入與缺失差異，應(yīng)用網(wǎng)上公布的粳稻日本晴與秈稻9311全基因組序列的比對結(jié)果，尋找具有差異的基因組片段來設(shè)計引物。引物設(shè)計所用軟件為DNAMAN VERSION 4.0，用于對日本晴和Dular的DNA 進行PCR擴增，來獲取多態(tài)性。累計設(shè)計了初定位引物共200對，實際檢測可用引物110對，12條染色體中平均3 Mbp設(shè)計一對引物。

PCR擴增體系（20 μL）：2×buffer 10 μL，20 pmol/L引物（正向+反向）2 μL，模板DNA（100 ng）2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1μL，rTaq DNA 聚合酶1 μL，ddH2O補足為10 μL。反應(yīng)程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃復性30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃總延伸5 min。根據(jù)PCR產(chǎn)物片段差異的大小選擇4%的瓊脂糖凝膠電泳（插入或缺失片段16 bp以上）或10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（插入或缺失片段5 bp以上）檢測，結(jié)果用凝膠成像儀記錄下來。

1.2.4.2 精細定位 應(yīng)用圖位克隆［18］技術(shù)，利用初定位引物對3個DNA混池、日本晴及Dular進行PCR擴增和凝膠電泳，確定連鎖關(guān)系，得到共分離引物后，在區(qū)間內(nèi)設(shè)計精細定位引物，擴大定位群體，逐漸縮小定位區(qū)間。

根據(jù)凝膠電泳結(jié)果，將與隱性親本帶型一致的標為1型帶，與顯性親本一致的標為2型帶，同時具有雙親本帶型的標為3型帶，統(tǒng)計各帶型數(shù)量和分布規(guī)律。

1.2.4.3 突變基因分析 對精細定位區(qū)段內(nèi)的候選基因進行測序，尋找到突變基因，并對該基因和突變位點進行生物信息學相關(guān)分析，進一步闡明表型與基因的對應(yīng)關(guān)系。

1.2.4.4 干旱脅迫分析 利用20%PEG4000的水培營養(yǎng)液模擬干旱脅迫環(huán)境，對生長至三葉期的野生型和wcl1突變體進行PEG4000干旱處理。每隔1 d對野生型和突變體進行表型觀察、拍照。并統(tǒng)計突變體wcl1和野生型葉片在干旱條件下（0-8 h）葉片水分散失率（注：在正常生長條件下，突變體與野生型水稻散失率沒有顯著區(qū)別）。

2 結(jié)果

2.1 突變體wcl1形態(tài)學特征和細胞學特征

與野生型日本晴相比，突變體wcl1的農(nóng)藝性狀（株高、分蘗數(shù)、花期等）沒有顯著差別（圖1-A）。但是，在粘水后，兩者呈現(xiàn)顯著的差別，因野生型葉皮有蠟質(zhì)，呈現(xiàn)出粘水特性，而突變體wcl1葉片因缺少蠟質(zhì)，表現(xiàn)為不粘水（圖1-B）。掃描電鏡（SEM）觀察顯示，與野生型相比，突變體wcl1表皮葉片蠟質(zhì)晶狀體密度降低、含量減少，乳突數(shù)量減少。這可能是突變體wcl1呈現(xiàn)不粘水的主要原因（圖1-C、D）。

圖1 突變型與野生型表型比較圖

2.2 突變體wcl1耐旱性試驗

由于葉片角質(zhì)層與非氣孔水分散失的功能有關(guān)，突變體水稻的耐旱性很可能也會改變。為了驗證該假設(shè)，對萌發(fā)3葉期的野生型和突變體wcl1進行干旱處理。處理前兩者生長狀態(tài)基本一致（圖2-A），干旱處理3 d時，發(fā)現(xiàn)突變體wcl1已基本卷曲枯萎，而野生型有80%植株表現(xiàn)綠色（圖2-B），結(jié)果表明突變體wcl1是一個干旱敏感突變體（圖2-C）。

2.3 突變體wcl1遺傳分析

為了研究突變體wcl1的遺傳規(guī)律，我們進行了突變體wcl1與野生型的正交與反交，F(xiàn)1代葉片表面蠟質(zhì)表型表現(xiàn)為野生型，表明該表型由隱性核基因控制。統(tǒng)計了F2代植株的分離比（突變體表型∶野生型表型）結(jié)果（表1）顯示差異顯著，符合孟德爾 1∶3的分離規(guī)律，表明突變體表型受一對單隱性核基因控制。

圖2 野生型和突變體wcl1干旱試驗比較圖

表1 F2代分離群體統(tǒng)計結(jié)果

2.4 突變體wcl1的初定位和精細定位

用均勻分布于全基因組的110對初定位引物對日本晴和Dular的3個混池、進行PCR擴增和凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)3個混池和9號染色體長臂上的Indel1-1和Indel1-2分子標記連鎖。再用Indel1-1和Indel1-2分子標記對17株F2代單株進行進一步連鎖分析，結(jié)果表明該分子標記確實與突變位點連鎖，將基因鎖在分子標記Indel1-1（圖3-A）和Indel1-2（圖3-B）之間。

2.5 突變體wcl1的精細定位和圖位克隆

利用F2代群體，將基因WCL1鎖定在分子標記Indel1-1和Idel1-2的區(qū)間內(nèi)（圖4-A），在區(qū)間內(nèi)再設(shè)計新的分子標記P1和P2，并進一步縮小了區(qū)間（圖4-B）。對該區(qū)間4個候選基因Os09g25830、Os09g25840、Os09g25850、Os09g25860（圖4-C）在突變體wcl1中進行PCR擴增并測序，發(fā)現(xiàn)在Os09g25850中的一個堿基鳥嘌呤（G）顛換為胸腺嘧啶（T）（圖4-D），經(jīng)生物信息學分析，該突變導致轉(zhuǎn)錄提前終止。

圖3 突變體wcl1基因連鎖分析電泳圖

圖4 基因wcl1圖位克隆

3 討論

本研究通過篩選水稻T-DNA突變體庫，獲得了一個穩(wěn)定遺傳的隱性無蠟質(zhì)的突變體wcl1，相對于野生型，其具有葉片失水率快，不耐干旱等特點。對成熟期葉片進行掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)突變體wcl1葉片表面缺少蠟質(zhì)，這可能是使植物葉片不粘水的主要原因。雖然突變體wcl1是從T-DNA插入突變體庫篩選獲得，但是其不是由T-DNA插入引起。我們通過圖位克隆該基因，其突變位點在LOC_ OS09g25850基因第10外顯子上，發(fā)生鳥嘌呤（G）顛換為胸腺嘧啶（T），造成基因轉(zhuǎn)錄提前終止，從而致使基因失活，且該基因等位于wsl2［19］。LOC_ OS09g25850編碼β-酮脂酰輔酶A合成酶（LOC_ OS09g25850），是超長鏈脂肪酸延伸過程中的關(guān)鍵酶，負責蠟質(zhì)成分前體的合成。雖然它與wsl2基因等位，但是其屬于不同的突變方式，在wcl1中LOC_OS09g25850基因提前終止，而在wsl2中LOC_ OS09g25850基因的第六外顯子與內(nèi)含子不能正確剪切，wcl1的突變位置位于第10外顯子處，相較wsl2，wcl1可能屬于一個弱突變。該研究結(jié)果明確了突變體wcl1的表型特征與遺傳基礎(chǔ)。

干旱等非生物逆境造成農(nóng)作物的生長抑制和嚴重的減產(chǎn)［20，21］。植物從水生的藻類進化到陸生植物，處于最外層的表皮蠟質(zhì)提供了必需的保護層以阻擋體內(nèi)水分流失，使得植物能夠適應(yīng)干旱等不利環(huán)境［22］。目前雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個蠟質(zhì)代謝相關(guān)基因參與了植物對干旱環(huán)境的適應(yīng)，但是大部分均沒有用于改良農(nóng)作物的抗旱性實踐。突變體wcl1對干旱敏感特性為進一步利用wcl1基因用于植物的耐旱性遺傳改良提供了新的啟示。

4 結(jié)論

本實驗篩選獲得1個無蠟質(zhì)突變體wcl1?？寺×薟CL1基因，雖然它與WSL2基因等位，但是其屬于不同的突變方式，wcl1是提前終止，而wsl2不能正確剪切。

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（責任編輯 李楠）

Mapping-based Cloning of a Wax Crystal-Sparse Leaf Mutant wcl1 in Rice

WANG Jia-mei AN Xue-jiao ZHANG Zhi-guo
（Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Here a wax crystal-sparse leaf mutant（wcl1）was screened from rice T-DNA Insertion Mutant Library. The mutant wcl1has two main features as following：1）the wcl1 leaf cuticular wax reduced；2）the drought sensitivity in the wcl1 plant was higher than wild type. Map-based cloning of wcl1 revealed that a point mutation of G to T in the 10th exonof gene LOC_OS09g25850encodingketoacyl coenzymeA resulted in the termination of transcription. The analysisshowed that the wcl1was allelic to wsl2.

rice；wax crystal-sparse leaf mutant；map-based cloning

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0132

2017-02-27

中國農(nóng)業(yè)科學院創(chuàng)新工程（CAAS-XTCX2016002）

王佳梅，女，碩士，研究方向：植物分子生物學及基因工程；E-mail：953867377@qq.com

張治國，男，副研究員，研究方向：植物基因功能組；E-mail：zhangzhiguo@caas.cn