魏喻周昌陽李艷利

（1. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；2. 神經(jīng)學(xué)科學(xué)研究所，上海 200031）

一種利用CRISPR/Cas9 對細胞添加生物條形碼的新方法

魏喻1周昌陽2李艷利1

（1. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；2. 神經(jīng)學(xué)科學(xué)研究所，上海 200031）

旨在利用CRISPR/Cas9對細胞添加不同的生物條形碼（Barcode），實現(xiàn)對細胞進行不同的標記。將生物條形碼序列、條件誘導(dǎo)性Cas9序列及相應(yīng)的sgRNA序列通過PB酶整合到細胞中，誘導(dǎo)Cas9表達之后對生物條形碼序列測序分析細胞的標記情況。所設(shè)計的生物條形碼含有6個相互重疊的sgRNA 識別位點，這種設(shè)計可以使條形碼序列只會被Cas9切割一次。結(jié)果顯示，所設(shè)計的生物條形碼序列在N2a細胞中經(jīng)Dox誘導(dǎo)之后能夠高效地被Cas9切割，所挑的9個克隆中，生物條形碼序列有9種不同的基因型。含有受loxp-stop-loxp 調(diào)控表達Cas9的序列及生物條形碼序列的E14胚胎干細胞經(jīng)Cre誘導(dǎo)之后，挑單克隆測序分析顯示，21株細胞中僅2株單克隆細胞生物條形碼保持原來的基因型，另外19株有18種不同的基因型。成功建立了可進行時空調(diào)控地在細胞內(nèi)高效添加特異且相對穩(wěn)定的生物條形碼標記的方法。

生物條形碼；CRISPR/Cas9；細胞標記

細胞標記在應(yīng)用于細胞譜系追蹤，癌細胞產(chǎn)生過程之中各細胞的異質(zhì)性追蹤等有重要意義。目前細胞標記的方法有多種，如用染料對細胞進行染色標記［1］，不同基因背景胚胎的雜交嵌合標記［2］，外源性DNA如病毒等插入細胞基因組進行標記［3，4］，基因重組進行特異性標記［5，6］，多種熒光對細胞進行標記［7］，以及自然發(fā)生的體細胞突變標記等［8-10］。盡管這些方法已經(jīng)被應(yīng)用于各種細胞的標記，然而其存在的一些問題限制了其應(yīng)用，如標記的種類少，標記效率低下，標記逐漸被稀釋，不相關(guān)的細胞被標記或者檢測太困難等等。

CRISPR/Cas9 在基因編輯領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，Cas9 能夠在sgRNA的指導(dǎo)下對基因組進行特異性切割，產(chǎn)生雙鏈斷裂，之后通過非同源性末端接合（Non-homologous end joining，NHEJ）或者同源指導(dǎo)修復(fù)（Homology directed repair，HDR）對斷裂的DNA雙鏈進行隨機修復(fù)，以此產(chǎn)生多種不同的基因型［11-13］。最近，人們在用于譜系追蹤的合成靶標陣列基因組編輯技術(shù)（Genome editing of synthetic target arrays for lineage tracing，GESTALT）中利用CRISPR/ Cas9能夠?qū)Υ罅康募毎砑硬煌纳飾l形碼，實現(xiàn)對不同的細胞進行不同的標記，并且這種標記能夠遺傳給后代子細胞，同時，對這些不同標記的檢測也相對比較簡單［14］。GESTALT用于細胞標記時在細胞基因組內(nèi)插入10個 sgRNA識別位點序列，每個識別位點由3 bp 堿基分開，通過Cas9對這10個相對獨立位點不同的切割方式，實現(xiàn)對細胞不同的標記［14］。GESTALT 能對大量細胞添加上千種不同的相對容易檢測的標記的特點，使其在應(yīng)用于對大量細胞的譜系追蹤時有著重要的意義。其在研究生長發(fā)育過程中各個器官來源及不同發(fā)育階段不同細胞的來源有著很好的應(yīng)用前景；另外對于研究癌癥中不同癌細胞來源、癌細胞遷徙等，GESTALT提供了一個很好的工具。

然而，GESTALT技術(shù)的生物條形碼有多個連續(xù)的Cas9 切割位點，每個切割位點相對獨立，Cas9會對細胞中的生物條形碼進行多次切割，故而將會導(dǎo)致標記的丟失或者紊亂。我們設(shè)計了一種新的含有6 個相互重疊 sgRNA 識別位點的生物條形碼序列對細胞進行標記，我們稱該方法為 Barcode 技術(shù)。通過 Barcode 技術(shù)，期望能夠高效且穩(wěn)定地對大量的細胞進行標記，以解決 GESTALT 技術(shù)中生物條形碼序列被多次切割導(dǎo)致標記紊亂的問題。

1 材料與方法

1.1 材料

DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、質(zhì)粒中提試劑盒購自天根生物科技有限公司；Taq酶、DNA marker DL2000、DL15000購自南京諾唯贊生物科技公司；T4 ligase、限制性酶切酶購自Thermo Fisher Scientific有限公司；NEBuilder Master Mix重組試劑盒購自NEB生物科技公司；Gibson Assembly? Master Mix重組試劑盒購自NEB；Lipofectamine 3000 Reagent 購自Invitrogen；ClonExpress Entry One Step Cloning Kit購自南京諾為贊生物科技有限公司；PBCMV-mcherry 質(zhì)粒、PB轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒、PB-CAG-LSLCas9-T2A-GFP 質(zhì)粒及Cre表達質(zhì)粒來自神經(jīng)神學(xué)研究所楊輝組；大腸桿菌感受態(tài)DH5α購自2ndLab。

小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞株N2a、小鼠胚胎干細胞E14購自中國科學(xué)院細胞庫；E14細胞培養(yǎng)基 中FBS 及Pen/Strep購 自Gibco；DMEM、Non-Essential Amino Acid、Nucleosides、L-glutamine及 2-mercaptoethanol購 自 Millipore；PD0325901、CHIR99021購自 Sellck；N2a細胞培養(yǎng)基為DMEM、FBS加上pen/strep，來源與上述相同。細胞流式分選于神經(jīng)科學(xué)研究所流式細胞分選平臺操作。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 采用Snapgene軟件設(shè)計引物，質(zhì)粒測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成，PCR擴增引物由上海華津生物科技有限公司合成。

1.2.2 Barcode V1質(zhì)粒的構(gòu)建 Barcode序列被設(shè)計成6個重疊的CRISPR/Cas9靶序列，包含23 bp的protospacer序列和PAM序列，其序列為5′-taac agtagccagacctaccaaaggactggcatggatgatccg-3′，設(shè)計引物Barcode target-F：5′-ggctctatggcggcgcgcctaacagtagccag acctaccaaaggactggc-3′和 Barcode target-R：5′-caaaac ttttaggcgcgtcggatcatccatgccagtcctttggtagg-3′，通過兩條引物進行退火，用重組酶（ClonExpress Entry One Step Cloning Kit）將其插入AscI線性化的PB轉(zhuǎn)座子CMV-mcherry過表達質(zhì)粒內(nèi)；分別構(gòu)建出6個靶向Barcode序列的sgRNA質(zhì)粒（表1），利用Gibson Assembly? Master Mix重組試劑盒將6個U6-sgRNA序列串聯(lián)到一起。構(gòu)建出Barcode V1質(zhì)粒，元件依次 為PB 5′ arm-6*U6-sgRNA-pCMV-mCherry-WPREPolyA-Barcode-PB 3′ arm。

1.2.3 Barcode V2質(zhì)粒的構(gòu)建 將含有6個U6-sgRNA片段和Barcode靶位點序列插入到PB-CAG-LSL-Cas9-T2A-GFP的Cre依賴表達的Cas9過表達載體中，其中LSL為loxp-stop-loxp，這種設(shè)計使Cas9的表達受Cre的調(diào)控，GFP的強度反映Cas9的表達情況。通過Gibson Assembly? Master Mix重組試劑盒構(gòu)建Barcode V2質(zhì)粒，其元件依次為：PB 5′armpCAG-LSL-Cas9-T2A-GFP-WPRE-PolyA-6*U6-sgRNA-pCMV-mCherry-WPRE-PolyA-Barcode-PB 3′arm。

表1 靶向Barcode序列的sgRNA

1.2.4 Barcode 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的建立 利用Lipofectamine 3000 Reagent 試劑盒將Barcode質(zhì)粒及PB轉(zhuǎn)座酶表達質(zhì)粒等質(zhì)粒共轉(zhuǎn)N2a細胞或者E14細胞系。細胞傳代至六孔板2 d 生長至較密集狀態(tài)后，取Opti-MEM 100 μL 與5 μL P3000、3.5 μg Barcode 質(zhì)粒及1.5 μg PB轉(zhuǎn)座酶質(zhì)?；旌?；取另一EP管加入100 μL Opti-MEM 和5 μL Lipo 3000。進一步將兩者混合，孵化5 min。將混合液加入N2a 細胞或者E14細胞中增養(yǎng)12 h 后換液培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染72 h 后通過流式分選出m-Cherry陽性細胞，培養(yǎng)5 d 后挑取單細胞克隆測序。

1.2.5 驗證Cas9 對Barcode序列的切割 通過Suveryor assay 檢測Cas9 序列對Barcode序列的切割［11］。提取E14單克隆細胞的基因組，用Sequencing PCR primer-F：5′-cggacatttaggtgacactataggca-3′及 Sequencing PCR primer-R：5′-acgtaatacgactcactatagggcgg -3′將Barcode序列通過PCR從細胞基因組中擴增出來。進一步用Suveryor nuclease 切割PCR產(chǎn)物，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳；另取部分PCR產(chǎn)物進行測序分析。

2 結(jié)果

2.1 Barcode序列的設(shè)計

Barcode序列如圖1所示，包含有6 個相互重疊的sgRNAs 靶向位點，當其中一個sgRNA位點被Cas9 切割之后將破壞所有的sgRNA 識別位點，使Barcode序列只能被Cas9 切割一次。6個sgRNA的靶向序列在NCBI中通過Blast比對，確定在小鼠基因組中沒有完全匹配的序列，避免了sgRNA切割小鼠內(nèi)源基因組DNA的可能。

圖1 Barcode序列

2.2 Cas9在N2a細胞中能對Barcode序列進行切割

將構(gòu)建的Barcode V1質(zhì)粒（圖2-A）通過PB轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)入到含有Doxycycline 誘導(dǎo)表達Cas9 的N2a細胞中，加入Doxycycline誘導(dǎo)之后，Suveryor assay結(jié)果（圖2-B）顯示Cas9 能夠?qū)arcode序列切割。PCR產(chǎn)物連接T載體，挑取9個單克隆進行測序。測序結(jié)果（圖2-C）顯示6個單克隆產(chǎn)生不同的堿基缺失，3個克隆產(chǎn)生不同的堿基插入。說明Cas9對Barcode序列能夠切割并能產(chǎn)生多種基因型。

2.3 Barcode V2穩(wěn)轉(zhuǎn)胚胎干細胞系的建立

將Barcode V2（圖3-A）質(zhì)粒用PB轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)入E14小鼠胚胎干細胞系中，培養(yǎng)72 h 后流式分選。通過熒光顯微鏡可觀察到生長出的單克隆中均有mCherry的表達（圖3-B），說明目標序列成功轉(zhuǎn)入細胞之中。通過對挑取的Barcode V2 E14單克隆細胞進行測序（圖3-C，成功獲得帶有Barcode序列的穩(wěn)轉(zhuǎn)株，稱其為Barcode V2 E14穩(wěn)轉(zhuǎn)株）。

2.4 Cre調(diào)控下的對細胞的特異性的標記

將Cre質(zhì)粒用PB轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)入Barcode V2 E14穩(wěn)轉(zhuǎn)株內(nèi)，分選出GFP陽性細胞，即Cas9表達的細胞。挑單克隆細胞對Barcode序列進行測序分析顯示，所挑的21株單克隆細胞中，2株單克隆細胞的Barcode序列為WT基因型，另外19株有18種不同的基因型（圖4）。證明該系統(tǒng)能夠高效地在Barcode區(qū)域產(chǎn)生不同的基因型，即對細胞產(chǎn)生不同的標記。

3 討論

圖2 Cas9在N2a細胞中對Barcode序列的切割

圖3 帶有Cre 調(diào)控的Cas9和Barcode序列的穩(wěn)轉(zhuǎn)E14細胞株的建立

Barcode技術(shù)在細胞內(nèi)插入一段含有6個相互重疊的sgRNA識別位點的DNA序列，利用Cas9對這段序列不同的切割方式及不同的修復(fù)方式，給不同的細胞隨機加上不同的標記。通過對這一小段序列的測序即可對細胞的不同來源進行標記。相對于以往的細胞標記方式，Barcode技術(shù)有很多種優(yōu)勢：（1）標記效率很高，細胞被特異性標記的概率高達90.5%；（2）標記方式種類多，6種不同的切割方式及多種不同的修復(fù)方式可以對大量的細胞進行不同的標記；（3）分析相對很簡單，只需對一小段序列進行測序即可識別不同的標記；（4）可以實現(xiàn)對標記的時空調(diào)控，如利用Tet-on 或者Cre-loxP 系統(tǒng)條件性控制對細胞的標記。特別是其應(yīng)用于譜系追蹤或發(fā)育譜研究時，新設(shè)計的Barcode 序列可以給細胞系添加多種穩(wěn)定的標記，對于長時程及復(fù)雜的追蹤有重要意義。

圖4 Barcode 序列經(jīng)Cas9切割后的測序結(jié)果

Barcode技術(shù)與GESTALT相比，都是利用CRISPR/Cas9 對一含有多個sgRNA識別位點的DNA序列——合成靶標陣列進行切割，通過不同的修復(fù)方式，從而產(chǎn)生多種不同的細胞標記。其共同的優(yōu)點有：（1）可以同時對大量的細胞進行標記；（2）這種組合型多樣性突變能夠在一段密集的CRISPR/ Cas9 識別位點中產(chǎn)生；（3）通過對單個細胞中一小段序列的測序，即可得到大量細胞的標記信息；（4）能夠應(yīng)用于包括細菌、植物及動物等多種生物的細胞中［14］。不同之處在于，GESTALT的合成靶標陣列由10個被3 bp 堿基隔開的sgRNA識別位點構(gòu)成，而Barcode 技術(shù)的合成靶標陣列由6個相互重疊的sgRNA識別位點構(gòu)成。Barcode技術(shù)的這種設(shè)計使得合成的靶標陣列被Cas9切割之后產(chǎn)生的標記在細胞后續(xù)的生長發(fā)育過程之中不會發(fā)生變化，即對于每個細胞中的合成靶標陣列，Cas9只會切割一次，不會因為Cas9的多次切割導(dǎo)致標記的丟失或者紊亂，分析相對更加簡單。而GESTALT中的合成靶標陣列由于每個sgRNA識別位點相對獨立，致使其會被Cas9多次切割，導(dǎo)致標記的紊亂，后續(xù)的分析過程將會很復(fù)雜。Barcode 技術(shù)與GESTALT相比缺點是產(chǎn)生的標記種類相對較少。一個可能的解決方法是在Barcode序列中加入更多的sgRNA 識別位點，或者設(shè)計多個不同的Barcode位點進行標記，以此來增加標記種類的多樣性，劣勢是增加了Cas9多次切割的概率，導(dǎo)致標記的丟失或者紊亂。但是與GESTALT相比，標記的穩(wěn)定性相對要高很多。可以根據(jù)研究目的在標記數(shù)量和標記穩(wěn)定性方面尋求一個平衡，并在標記的時間點及位置上進行控制，以達到精確標記細胞的目的。另外一種解決方法是將兩個或者兩個以上的Barcode序列插入細胞基因組中不同的位置，這種設(shè)計避免了Cas9對同一位點多次切割導(dǎo)致的標記紊亂，同時增加了標記的多樣性。

4 結(jié)論

利用Barcode技術(shù)，可以對大量的細胞進行高效的、多樣的、相對穩(wěn)定的標記，通過對一小段序列的測序可以讀出這些不同的標記。利用重組酶Cre來調(diào)節(jié)Cas9的表達，能夠?qū)崿F(xiàn)對細胞標記的時空調(diào)控和小鼠體內(nèi)的組織特異性調(diào)控。

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（責任編輯 李楠）

A Novel Approach to Establish Bio-barcode in Cells by CRISPR/Cas9

WEI Yu1ZHOU Chang-yang2LI Yan-li1
（1. College of Life Sciences，Shanghai University，Shanghai 200444；2. Institute of Neuroscience，Shanghai 200031）

The aim of this study is to add bio-barcode in cells by CRISPR/Cas9 for differentially marking the cells. The bio-barcode sequence，conditional induced Cas9 sequence and the corresponding sgRNA sequence were integrated into the cell through the PB enzyme，and then the cell markers were analyzed by sequencing the bio-barcode after inducing the expression of Cas9. The designed bio-barcode sequence contained 6 sgRNA target sites overlapping each other，which allowed the bio-barcode sequence to be spliced only once by Cas9. As results，the designed bio-barcode sequence in N2a cells after Dox induction was efficiently spliced by Cas9，and there were 9 different genotypes among 9 clones. After Cre inducing the E14 embryonic stem cells containing Cas9 sequence regulated by loxp-stop-loxp and biobarcode sequence，monoclonal sequencing showed that only 2 monoclonal cells of 21 cell lines remained the original genotype，and the rest 19 strains presented 18 different genotypes respectively. In summary，this study established a novel approach to spatio-temporally add bio-barcode markers with high specificity and relative stability into cells.

bio-barcode；CRISPR/Cas9；cell marking

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0087

2017-02-10

新藥研究國家重點實驗室開放基金（SIMM1601KF12）

魏喻，男，碩士，研究方向：細胞重編程與胚胎發(fā)育；E-mail：hustweiyu@163.com

李艷利，女，博士，研究方向：腫瘤的分子治療；E-mail：liyanli@shu.edu.cn