何思雨 成文玉 金紅星

（河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津 300130）

S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因失活對(duì)地中海擬無(wú)枝酸菌產(chǎn)利福霉素的影響

何思雨 成文玉 金紅星

（河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津 300130）

為提高利福霉素的產(chǎn)量，構(gòu)建了S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因失活的地中海擬無(wú)枝酸菌。利用融合PCR構(gòu)建S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因的同源重組載體，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到地中海擬無(wú)枝酸菌中，使之發(fā)生同源重組，以安普霉素為標(biāo)記，篩選了S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因失活菌株，并對(duì)比了突變菌株與原始菌株的利福霉素SV產(chǎn)量。成功構(gòu)建了S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因的同源重組載體，獲得了地中海擬無(wú)枝酸菌突變株A. mediterranei △fabD，失活菌株的利福霉素SV產(chǎn)量為168.08 mg/L，比原始菌提高了9.94%。S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因的失活，弱化了突變菌株脂肪酸的合成，強(qiáng)化了利福霉素的合成。

地中海擬無(wú)枝酸菌；利福霉素；S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶；融合PCR；基因失活

利福霉素是一類由地中海擬無(wú)枝酸菌（Amycolatopsis mediterranei）產(chǎn)生的重要安莎類抗生素，主要用于治療肺結(jié)核和其他分枝菌酸感染引起的疾病，如麻風(fēng)和艾滋病等［1-3］。利福霉素可以特異性地抑制依賴于DNA的RNA聚合酶的活性，使病原菌不能正常合成RNA產(chǎn)物，從而達(dá)到抑菌目的［4］。地中海擬無(wú)枝酸菌發(fā)酵得到的利福霉素是由利福霉素A、B、C、D、SV等多種組分構(gòu)成的，其中利福霉素SV是利福平、利福噴丁等利福霉素類藥物的直接合成前體［5-7］。

地中海擬無(wú)枝酸菌作為利福霉素的生產(chǎn)菌，長(zhǎng)期以來(lái)主要以誘變育種為主，Pietro等［8］通過(guò)傳統(tǒng)NTG誘變—篩選的方法得到了利福霉素B的高產(chǎn)菌株A. mediterranei HP-130，金玉坤等［9］利用UV誘變?cè)俳?jīng)L-色氨酸、氯化銫等類似物作耐受處理，使利福霉素SV的產(chǎn)量提高10%左右。但這種化學(xué)或物理的誘變方法具有誘變方向難以掌握，突變體難以集中多個(gè)理想性狀、篩選工作量大等局限性。此外，Priscila等［10］通過(guò)構(gòu)建攜帶血紅蛋白基因vgb的地中海擬無(wú)枝酸菌-大腸桿菌穿梭載體，在地中海擬無(wú)枝酸菌中過(guò)表達(dá)了透明顫菌（Vitreoscilla stercoraria）的vgb基因，使利福霉素B的產(chǎn)量提高了13.9%，但其發(fā)酵過(guò)程中必須添加抗生素，才能保持工程菌中質(zhì)粒的穩(wěn)定性。目前，我國(guó)主要以發(fā)酵利福霉素SV為主，發(fā)酵單位較低，生產(chǎn)水平在5 000 U/mL左右［11］。

趙維等［12］于2010年對(duì)A. mediterranei進(jìn)行了全基因組序列測(cè)定和注釋，明確了利福霉素SV生物合成及前體供給的途徑。丙二酰CoA和甲基丙二酰CoA在3-氨基-5-羥基苯甲酸（AHBA）的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)縮合、環(huán)化和后修飾而形成利福霉素SV。而丙二酰CoA既是脂肪酸生物合成的前體，又是利福霉素生物合成的前體。因此，本研究利用融合PCR構(gòu)建S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因的同源重組載體，將脂肪酸合成途徑中的S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因fabD進(jìn)行失活，弱化脂肪酸的合成，旨在而提高利福霉素SV的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 地中海擬無(wú)枝酸菌（A. mediterranei，由河北欣港藥業(yè)有限公司提供），大腸桿菌（E. coli）DH5α，質(zhì)粒pUC19和pSET152均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 高保真的DNA聚合酶、T4連接酶由謙泰生物技術(shù)有限公司提供，PCR純化試劑盒購(gòu)自Axygen公司，限制性內(nèi)切酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。Trizol試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，氨芐青霉素和安普霉素購(gòu)自Sbase公司。引物由金唯智生物科技有限公司合成（表1）。

表1 本實(shí)驗(yàn)所使用的引物

1.1.3 培養(yǎng)基

1.1.3.1 種子培養(yǎng)基 葡萄糖1.5%，黃豆餅粉1.0%，蛋白胨1.0%，KNO30.05%，CaCO30.1%，KH2PO40.01%，淀粉1.5%，pH7.0。

1.1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖10%，黃豆餅粉1.0%，魚粉0.5%，蛋白胨1.0%，KNO30.8%，CaCO30.3%，KH2PO40.02%，CoCl20.0003%。

1.1.3.3 培養(yǎng) 大腸桿菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃；制備地中海擬無(wú)枝酸菌的電擊感受態(tài)細(xì)胞時(shí)用YEME，地中海擬無(wú)枝酸菌電擊轉(zhuǎn)化后的孵育及篩選用本氏培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為28℃。

1.2 方法

1.2.1 S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因部分序列的克隆 用改進(jìn)的Vingataramin等［13］方法提取地中海擬無(wú)枝酸菌的染色體DNA作模板，以Fabd-F/R為引物，PCR擴(kuò)增了S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因fabD（3.8 kb），連接到pUC19上，命名為pUC19-fabd。

1.2.2 fabD基因的同源重組載體構(gòu)建 以融合PCR擴(kuò)增中間為抗性標(biāo)記基因、兩側(cè)為左右同源臂的DNA片段，連接到pUC19而構(gòu)建fabD基因的同源重組載體pUC19-fabdF-apr-fabdR。

第一輪PCR（常規(guī)PCR）：以pUC19-fabd為模板，以ZF/ZR為引物，擴(kuò)增為710 bp的左同源臂fabD-F，反應(yīng)條件為：98℃ 3 min；98℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 22 s，30個(gè) 循 環(huán)；72℃ 10 min。以YF/YR為引物，擴(kuò)增為1 170 bp的右同源臂fabD-R，反應(yīng)條件為：98℃ 3min；98℃ 30 s，58℃30 s，72℃ 36 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。以質(zhì)粒pSET152為模板，以APR-F/R為引物，擴(kuò)增出長(zhǎng)度為1 200 bp的安普霉素抗性基因AprR。反應(yīng)條件為：98℃ 3 min；98℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 36 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

第二輪PCR（融合PCR）：探索融合PCR反應(yīng)的條件，最終以3種第一輪PCR產(chǎn)物作模板各取0.5 μL，添加3%的DMSO，不加任何引物進(jìn)行擴(kuò)增，其原理是利用擴(kuò)增片段末端的反向互補(bǔ)序列進(jìn)行自身退火并結(jié)合，使安普霉素抗性基因兩側(cè)與fabD基因的左右同源臂相連，反應(yīng)條件為：98℃ 3 min；98℃ 30 s，47℃ 30 s，72℃ 93 s，10個(gè)循環(huán)。

第三輪PCR：以第二輪的PCR產(chǎn)物作為模板，以ZF/YR為引物，擴(kuò)增3 044 bp的融合DNA片段，反應(yīng)條件為：98℃ 3 min；98℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 93 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

1.2.3 地中海擬無(wú)枝酸菌的電擊轉(zhuǎn)化 采用樊菲等［14］的方法將同源重組載體pUC19-fabdF-apr-fabdR導(dǎo)入到地中海擬無(wú)枝酸菌中，涂布于含安普霉素抗性的平板，7-10 d后挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.4 突變菌株的驗(yàn)證 將疑似菌株傳代培養(yǎng)5次，以Verify-F/R為引物，提取染色體DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證。以原始菌株與疑似菌株RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，以Test-F/R（設(shè)計(jì)在突變體中被替換掉的區(qū)域）為引物，進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。以16S rRNA為管家基因，用相對(duì)定量2-ΔΔCT法計(jì)算fabD基因在突變菌株與原始菌株之間的相對(duì)表達(dá)水平［15］，重復(fù)3次。

1.2.5 發(fā)酵 將A. mediterranei突變菌株與原始菌株分別接種于裝有10 mL種子培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，220 r/min振搖培養(yǎng)48 h后，以10%的接種量接種于裝有20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，發(fā)酵136 h后離心去除菌體，上清液按照改進(jìn)的文獻(xiàn)［16］方法進(jìn)行HPLC檢測(cè)利福霉素SV的產(chǎn)量。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建同源重組載體pUC19-fabdF-apr-fabdR

第1輪PCR擴(kuò)增得到了預(yù)期長(zhǎng)度為710 bp的fabD基因左同源臂、1 170 bp的fabD基因右同源臂和1 200 bp的安普霉素抗性基因表達(dá)盒（圖1-A，圖1-B）。

第2輪PCR通過(guò)3個(gè)第1輪PCR產(chǎn)物末端的反向互補(bǔ)序列相互退火結(jié)合，構(gòu)建成安普霉素抗性基因表達(dá)盒兩端分別連接有fabD基因左、右同源臂的DNA融合體。但是此時(shí)該融合體的量比較少，經(jīng)過(guò)第3輪PCR特異性地?cái)U(kuò)增，成功得到了預(yù)期為3 044 bp的fabD同源重組片段（圖1-C）。

將融合PCR產(chǎn)物連接到pUC19上，重組載體經(jīng)EcoR I酶切驗(yàn)證。結(jié)果（圖1-D）顯示，重組載體酶切得到了預(yù)期為2 686 bp的線性pUC19和3 044 bp的融合PCR片段。重組載體測(cè)序結(jié)果表明，同源重組片段基因與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1 重組載體pUC19-fabdF-apr-fabdR的構(gòu)建與驗(yàn)證

2.2 fabD基因失活突變菌株的驗(yàn)證

以染色體DNA為模板進(jìn)行的PCR驗(yàn)證，結(jié)果（圖2）顯示，以Verify-F/R作為引物，與預(yù)期的結(jié)果一樣，原始菌株染色體DNA擴(kuò)增的是預(yù)期1.2 kb的DNA片段，fabD失活的突變菌株染色體DNA擴(kuò)增的是1.85 kb DNA片段（目的失活片段的相對(duì)位置見(jiàn)圖3，設(shè)計(jì)PCR驗(yàn)證引物時(shí)左右同源臂之間缺失550 bp片段）。

圖2 A.mediterranei △fabD菌株的PCR驗(yàn)證電泳圖

為了進(jìn)一步驗(yàn)證fabD基因的失活，提取原始菌株和突變菌株的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，Test-F/R為引物，進(jìn)行RT-PCR。以16S rRNA為管家基因，用相對(duì)定量2-ΔΔCT法計(jì)算fabD基因在突變菌株與原始菌株之間的相對(duì)表達(dá)水平，其結(jié)果如圖4。設(shè)定原始菌株的表達(dá)量為1，由定量PCR結(jié)果可知，在突變菌株A. mediterranei △fabD中，fabD的表達(dá)量極少，證明了fabD基因功能被破壞。

2.3 利福霉素SV的產(chǎn)量比較

突變菌和原始菌發(fā)酵液中利福霉素含量的HPLC檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)圖5。原始菌株發(fā)酵液中利福霉素SV平均含量為152.88 mg/L，突變菌株發(fā)酵液中利福霉素SV含量為168.08 mg/L。與原始菌株相比，突變菌株利福霉素SV的產(chǎn)量增加了9.94%。

圖3 目的基因失活片段和引物的相對(duì)位置

圖4 原始菌株與突變菌株fabD基因的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

基因失活能夠有目的地缺失染色體DNA序列的部分片段，是最直接、最有說(shuō)服力的遺傳育種手段之一。融合PCR技術(shù)［17］是根據(jù)PCR技術(shù)的原理和特點(diǎn)，采用具有互補(bǔ)末端的引物擴(kuò)增目的片段，使擴(kuò)增片段相互搭橋、拼接的一種方法。與傳統(tǒng)方法相比，融合PCR構(gòu)建同源重組載體進(jìn)行基因失活，過(guò)程快捷、簡(jiǎn)便、成本低廉并且克服了常規(guī)的酶切連接中對(duì)于酶切位點(diǎn)的選擇限制的缺點(diǎn)［18］。目前，融合PCR技術(shù)已成為基因失活同源重組載體構(gòu)建的的常用方法，劉小利等［19］采用融合PCR構(gòu)建了親水蛋白Dlp基因同源重組載體，獲得了耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans）dlp基因缺失的突變株；婁菲等［20］利用兩步融合PCR技術(shù)構(gòu)建了大腸桿菌（Escherichia coli）蘋果酸酶基因（macA和macB）的失活同源重組載體，獲得的突變株蘋果酸產(chǎn)量提高了36%。

圖5 原始菌株與突變菌株發(fā)酵液的HPLC檢測(cè)結(jié)果

鑒于fabD基因有較多的常用內(nèi)切酶識(shí)別序列，本研究利用一步融合法將3個(gè)片段（fabD左同源臂、安普霉素抗性基因及fabD右同源臂）進(jìn)行了無(wú)縫拼接并對(duì)融合PCR條件進(jìn)行了優(yōu)化，構(gòu)建了fabD基因失活同源重組載體。因地中海擬無(wú)枝酸菌染色體的GC含量較高，選用適當(dāng)?shù)腜CR緩沖液添加適量的DMSO進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，例如融合PCR模板GC含量為60%-70%時(shí)加3% DMSO、GC含量大于70%時(shí)加5% DMSO；采用高保真DNA聚合酶進(jìn)行融合PCR避免造成突變。為驗(yàn)證融合PCR的準(zhǔn)確性，對(duì)目的片段進(jìn)行了測(cè)序，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)堿基的插入、突變及缺失，表明獲得的同源重組載體可以用于后續(xù)的研究。

由fabD編碼合成的S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶將丙二酰CoA的?；D(zhuǎn)移到?；d體蛋白（ACP），形成丙二酰ACP和游離CoA-SH，是脂肪酸途徑FASII系統(tǒng)中關(guān)鍵的蛋白酶之一［21］。眾所周知，大環(huán)內(nèi)酯抗生素、脂肪酸以及利福霉素的脂肪環(huán)鏈部分都是通過(guò)丙二酰CoA等逐步縮合而成的［22］。本研究利用同源重組的方法失活了脂肪酸途徑中S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因fabD，得到的突變菌株與原始菌株生長(zhǎng)狀態(tài)無(wú)明顯差異，但該基因的破壞可能遏制了脂肪酸的合成，導(dǎo)致丙二酰CoA向脂肪酸的轉(zhuǎn)化量減少，從而使合成脂肪酸的代謝流轉(zhuǎn)向利福霉素環(huán)橋鏈的合成前體丙二酰CoA，增強(qiáng)了利福霉素SV的代謝合成，提高了利福霉素的產(chǎn)量。

地中海擬無(wú)枝酸菌中利福霉素SV生物合成的前體物質(zhì)除丙二酰CoA外，還有AHBA和甲基丙二酰CoA［23］。樊菲等［24］為消除芳香族氨基酸對(duì)AHBA的反饋抑制作用，失活了莽草酸途徑中合成芳香族氨基酸的分支菌酸基因aroC。本研究為降低脂肪酸對(duì)丙二酰CoA合成的抑制作用，失活了脂肪酸合成途徑的關(guān)鍵酶（S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶）基因fabD，獲得的突變菌株利福霉素SV的發(fā)酵單位達(dá)到了168.08 mg/L，比樊菲等改造的A. mediterranei△aroC菌株利福霉素SV的含量提高了13%左右。另外，地中海擬無(wú)枝酸菌的染色體基因組中存在2個(gè)拷貝的S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因（AMED_2102和AMED_3155）［25］，本研究只失活了其中一個(gè)拷貝（AMED_3155）。

4 結(jié)論

本文采用高保真DNA聚合酶，高GC含量的PCR緩沖液，添加3%的DMSO，模板量比例為1∶1∶1，最佳退火溫度為47℃進(jìn)行融合PCR，構(gòu)建了S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因的重組載體。利用同源重組成功得到了地中海擬無(wú)枝酸菌S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因失活菌株，利福霉素SV產(chǎn)量相比原始菌株增加了9.94%。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Effects of S-malonyltransferase Gene Inactivation on Rifamycin Production by Amycolatopsis mediterranei

HE Si-yu CHENG Wen-yu JIN Hong-xing
（School of Chemical Engineering and Technology，Hebei University of Technology，Tianjin 300130）

To increase rifamycin yield，the Amycolatopsis mediterranei mutant of the inactivated S-malonyltransferase gene（fabD）was constructed. S-malonyltransferase gene homologous recombinant vector was constructed using fusion PCR，and then transformed into A. mediterranei by electroporation，making the homologous recombination occurr. Then fabD-inactivated strain was screened by apramycin as a marker. Further，the rifamycin production between mutant strains was wmpared and the parental strain by fermentation. The results showed that the homologous recombinant vector of fabD was successfully constructed，and the A. mediterranei △fabD was obtained；the production of rifamycin SV in the mutant strain was 168.08 mg/L，with 9.94% increase in contrast to the parent strain. The inactivation of S-malonyltransferase gene weakened the fatty acid synthesis of mutant strain，subsequently strengthened the synthesis of rifamycin.

Amycolatopsis mediterranei；rifamycin；S-malonyltransferase；fusion PCR；gene inactivation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0200

2017-03-17

何思雨，女，碩士，研究方向：微生物遺傳育種學(xué)；E-mail：hesiyu2017@126.com

金紅星，男，博士，副教授，研究方向：微生物遺傳育種學(xué)；E-mail：jinhx87@126.com