李海龍，王勇，翟宇，程小麗，安霞，李紅亮，康萬榮，吳紅彥

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，甘肅 蘭州 730000；4.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020

加味當(dāng)歸貝母苦參丸對(duì)MFC胃癌荷瘤小鼠瘤組織Toll樣受體通路分子的影響

李海龍1，2，王勇1，2，翟宇1，2，程小麗3，安霞4，李紅亮2，康萬榮2，吳紅彥2

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，甘肅 蘭州 730000；4.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020

目的 觀察加味當(dāng)歸貝母苦參丸對(duì) MFC 胃癌荷瘤小鼠瘤組織 Toll樣受體（TLR2、TLR4、TLR6）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子 6（TRAF6）和髓分化因子 88（MyD88）表達(dá)的影響，探討其相關(guān)的作用機(jī)制。方法 建立 MFC 胃癌荷瘤小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)。將篩選合格的 48 只 MFC 胃癌荷瘤小鼠隨機(jī)分為模型組，陽性對(duì)照組（順鉑組），加味當(dāng)歸貝母苦參丸高劑量組（當(dāng)高組）、低劑量組（當(dāng)?shù)徒M）和順鉑聯(lián)合加味當(dāng)歸貝母苦參丸高劑量組（順高組）、低劑量組（順低組），各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù) 14 d，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況及小鼠一般情況、腫瘤大體標(biāo)本及 HE 染色后組織形態(tài)；RT-qPCR 和免疫組化分別檢測(cè)腫瘤組織TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6 和 M yD88 的表達(dá)。結(jié)果 模型組腫瘤細(xì)胞豐富，細(xì)胞大小不一、體積大、核大深染、異型明顯，可見小灶性壞死，間質(zhì)血管豐富；各給藥組腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少、排列疏松、細(xì)胞體積明顯縮小、核固縮，細(xì)胞壞死明顯增加，間質(zhì)血管數(shù)量減少，膠原纖維增多，其中以順低組、順高組較為明顯。與模型組比較，各給藥組 TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6 和 MyD88 mRNA 和蛋白表達(dá)均降低，順低組、順高組TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6 和 M yD88 蛋白著色變淺，呈弱陽性表達(dá)，較順鉑組、當(dāng)高組、當(dāng)?shù)徒M蛋白改變更加明顯。結(jié)論 加味當(dāng)歸貝母苦參丸可能通過下調(diào)荷瘤小鼠腫瘤組織 TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6 和MyD88 mRNA 和蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤作用。

加味當(dāng)歸貝母苦參丸；胃癌；Toll樣受體通路；小鼠

胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一，據(jù)國(guó)家癌癥中心 2015 年統(tǒng)計(jì)，胃癌在我國(guó)惡性腫瘤死亡排名第 3位[1]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)歸貝母苦參丸干預(yù)胃癌和肝癌的藥效明確[2-3]。當(dāng)歸貝母苦參丸出自《金匱要略》，原用于治療妊娠小便困難。本實(shí)驗(yàn)以當(dāng)歸貝母苦參丸為基礎(chǔ)方，增加黃芪、山慈菇、全蝎組成當(dāng)歸貝母苦參丸加味方。該方具有活血化瘀、化痰散結(jié)、解毒攻癌，兼顧調(diào)節(jié)機(jī)體補(bǔ)虛扶正、化生氣血的功效。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體（TLRs）與炎癥相關(guān)腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。TLRs 是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)中模式識(shí)別受體，可識(shí)別不同病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），從而啟動(dòng)相關(guān)下游 TLR4 胞內(nèi)信號(hào)通路，包括髓分化因子（MyD88）依賴和非依賴途徑[5]。TLR4激活 MyD88 后，活化的 MyD88 聚集并結(jié)合 IRAK1和 IRAK2，然后作用于腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子 6（TRAF6），進(jìn)一步激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[6]。本研究采用 RT-qPCR 和免疫組化檢測(cè)，探討加味當(dāng)歸貝母苦參丸的抑瘤作用及對(duì)荷瘤鼠 MFC 胃癌組織TLR2、TLR4、TLR6 和 MyD88 表達(dá)的影響，為其臨床防治胃癌提供有效的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí) BALB/c-nu 小鼠 60 只，雌、雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物許可證號(hào) SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于室溫 20～25 ℃、濕度 45%～55%環(huán)境，分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水。

1.2 細(xì)胞、藥物及制備

MFC 前胃癌細(xì)胞，中科院上海細(xì)胞庫(kù)。加味當(dāng)歸貝母苦參丸（黃芪、當(dāng)歸、浙貝母、苦參、山慈菇、全蝎），飲片購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，加 10 倍量水浸泡 1 h，加熱煮沸 40 m in，濾出煎液，藥渣再加 6 倍量水加熱煮沸 40 m in，合并 2 次煎液，70 ℃水浴蒸發(fā)濃縮至含 1.0 g 原藥材/m L；順鉑注射液，江蘇毫森藥業(yè)股份有限公司，20 mg/支，批號(hào) 20160522，將 30 mg 順鉑粉針加生理鹽水，稀釋為 0.25 mg/m L，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑和儀器

胎牛血清（杭州四季青公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒DR036A（上海寶生物工程有限公司），擴(kuò)增試劑盒（PREMEGO 公司），二抗（中杉金橋公司），TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6 和 MyD88 一抗（IMMONOWAY公司）。生物安全柜、DMEM 培養(yǎng)基（健順生物公司），CO2培養(yǎng)箱（力康公司），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS），ABI7500 熒光 PCR 儀（美國(guó) ABI公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模

將凍存細(xì)胞株取出，快速置于 37 ℃水浴解凍，并轉(zhuǎn)移細(xì)胞液于離心管中，加入適量培養(yǎng)液（高糖DMEM＋10%胎牛血清），1000 r/m in 離心 3 min，棄上清液，加入適量培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種入培養(yǎng)瓶，置于 37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后，PBS 清洗細(xì)胞 3遍，更換培養(yǎng)液。1～2 d 換液 1 次。每日倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好鋪滿瓶底時(shí)，25%胰酶常規(guī)方法消化、傳代，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)傳代，棄去培養(yǎng)基，將細(xì)胞制成懸液，濃度調(diào)整為 15×106/m L，小鼠腋下接種胃癌 MFC 細(xì)胞，每只 0.2 m L。

2.2 分組和給藥

造模后觀察腫瘤體積直徑達(dá) 0.5 cm 時(shí)，剔除體積過大或過小小鼠，48 只篩選合格小鼠隨機(jī)分為模型組、陽性對(duì)照組（順鉑組）、加味當(dāng)歸貝母苦參丸高劑量（當(dāng)高組）、加味當(dāng)歸貝母苦參丸低劑量組（當(dāng)?shù)徒M）和順鉑聯(lián)合加味當(dāng)歸貝母苦參丸高劑量組（順高組）、順鉑聯(lián)合加味當(dāng)歸貝母苦參丸低劑量組（順低組）。第 2 日開始，模型組小鼠予蒸餾水 0.2 m L 灌胃及腹腔注射生理鹽水 0.1 m L；當(dāng)高組、當(dāng)?shù)徒M予中藥 0.2 m L 灌胃，每日 1 次；順鉑組予蒸餾水 0.2 m L灌胃及腹腔注射順鉑（25 mg/kg）0.1 m L，隔 5 d 給藥1次，共3次；順高組、順低組予等量中藥灌胃及腹腔注射順鉑（25 mg/kg）0.1 m L，共 14 d。第 15 日18∶00 時(shí)禁食，不禁水。第 16 日處死小鼠取材備檢。

2.3 腫瘤大體標(biāo)本及組織形態(tài)觀察

對(duì)荷瘤小鼠腫瘤組織進(jìn)行剝離并進(jìn)行肉眼觀察，對(duì)腫瘤體積、顏色和質(zhì)地進(jìn)行記錄，與此同時(shí)，需觀察確定腫瘤組織假膜完整程度，是否存在出血狀況等。隨后 4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，染色。對(duì)腫瘤組織和細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行鏡檢，實(shí)體瘤療效以抑瘤率表示。抑瘤率（%）＝（模型組平均瘤重－實(shí)驗(yàn)組平均瘤重）÷模型組平均瘤重×100%。

2.4 熒光定量 PCR 檢測(cè) TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和 MyD88 mRNA 表達(dá)

稱取 30 mg 腫瘤組織置于無 RNA 酶的 EP 管中勻漿，再加 1 m L 提取液靜置 5 m in，常規(guī)低溫抽提總RNA 后溶解并檢測(cè)其濃度，用 Takara 036A 反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。使用 ABI7500 熒光定量 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃、5 m in 預(yù)變性，95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，40 個(gè)循環(huán)，并分析融解曲線，確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，相對(duì)表達(dá)量采用 2-ΔΔCT法計(jì)算，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次，基因引物序列見表 1。

2.5 免疫組化檢測(cè) TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6 和 MyD88蛋白表達(dá)

采用 ABC 法。切片常規(guī)脫蠟水化，3%去離子水滅活內(nèi)源性酶 10 min，微波修復(fù)抗原 5 m in，間隔重復(fù) 1 次；然后依次滴加 TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和 MyD88 一抗及生物素化山羊抗兔二抗；滴加SABC，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，梯度脫水透明后封片，顯微鏡下觀察。以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)記錄各自 TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6 和 M yD88 積分光密度和平均灰度，作為蛋白表達(dá)的量化指標(biāo)，每組各取材5個(gè)樣本。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，組間比較用方差分析，方差齊用 LSD 法，方差不齊用 Dunnett'T3 法。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 加味當(dāng)歸貝母苦參丸對(duì) MFC 胃癌荷瘤小鼠瘤組織抑制率的影響

順鉑組小鼠體質(zhì)量逐漸下降，精神差，進(jìn)食減少，反應(yīng)遲鈍，當(dāng)高組、順高組狀態(tài)較好，瘤質(zhì)量較模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見表 2。

表 2 各組小鼠瘤質(zhì)量和抑瘤率比較

4.2 腫瘤大體標(biāo)本及組織形態(tài)觀察結(jié)果

模型組腫瘤細(xì)胞豐富，細(xì)胞大小不一、體積大、核大深染、異型明顯，可見小灶性壞死，間質(zhì)血管豐富；當(dāng)?shù)徒M腫瘤細(xì)胞豐富，細(xì)胞大小不一、體積相對(duì)縮小、核大深染，部分細(xì)胞核固縮，可見小灶性壞死、間質(zhì)血管豐富，腫瘤細(xì)胞周圍膠原纖維增多；當(dāng)?shù)徒M、當(dāng)高組、順鉑組、順低組、順高組腫瘤細(xì)胞數(shù)減少、排列疏松，細(xì)胞體積縮小、核固縮，細(xì)胞壞死增加，間質(zhì)血管數(shù)量減少，膠原纖維增多。結(jié)果見圖1。

圖 1 各組小鼠腫瘤組織病理形態(tài)（HE 染色，×400）

4.3 加味當(dāng)歸貝母苦參丸對(duì)荷瘤小鼠 MFC 胃癌瘤組織 TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6 和 MyD88 mRNA 表達(dá)的影響

與模型組比較，各給藥組 TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6 和 MyD88 mRNA 表達(dá)均有不同程度變化，當(dāng)高組、順低組和順高組變化較為明顯。結(jié)果見表3。

4.4 加味當(dāng)歸貝母苦參丸對(duì)荷瘤小鼠 MFC 胃癌瘤組織 TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6 和 MyD88 蛋白表達(dá)的影響

胞漿或胞膜出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性著色。與模型組比較，各給藥組 TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和 MyD88 蛋白著色較深，表明為強(qiáng)陽性或陽性表達(dá)，而模型組則呈現(xiàn)弱陽性或陰性表達(dá)。結(jié)果見表4、表5和圖 2～圖 6。

表 3 各組小鼠腫瘤組織 TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6 和 MyD88 mRNA 表達(dá)比較（±s，2-ΔΔCT）

表 3 各組小鼠腫瘤組織 TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6 和 MyD88 mRNA 表達(dá)比較（±s，2-ΔΔCT）

注：與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，▲▲▲P＜0.001；與當(dāng)?shù)徒M比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001；與順鉑組比較，▼P＜0.05，▼▼P＜0.01，▼▼▼P＜0.001；與順低組比較，▽P＜0.05，▽▽P＜0.01，▽▽▽P＜0.001（下同）

組別 n TLR2 TLR4 TLR6 M yD88 TRAF6模型組 3 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.51 1.13±0.00 1.00±0.00順鉑組 3 0.81±0.15 0.85±0.25△△ 0.16±0.08▲▲▲ 0.34±0.18▲ 0.67±0.21▲△△當(dāng)?shù)徒M 3 1.40±0.37 0.27±0.20▲ 0.15±0.08▲▲▲ 0.35±0.18▲ 1.30±0.27當(dāng)高組 3 0.62±0.18▲▲△△ 0.91±0.68△△ 0.11±0.06▲▲▲ 0.05±0.01▲▲▲ 0.59±0.07▲▲△△順低組 3 0.19±0.03▲▲▲△△△▼▼ 0.63±0.08△ 0.13±0.04▲▲▲ 1.04±1.26 0.96±0.06順高組 3 0.15±0.05▲▲▲△△△▼▼ 0.34±0.29▲▲▼▼ 0.22±0.09▲▲▲ 0.90±0.22 0.77±0.21

表 4 各組小鼠腫瘤組織 TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6 和 MyD88 蛋白表達(dá)比較（s，積分光密度）

表 4 各組小鼠腫瘤組織 TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6 和 MyD88 蛋白表達(dá)比較（s，積分光密度）

組別 n TLR2 TLR4 TLR6 M yD88 TRAF6模型組 5 51 580.77± 8 789.62 48 426.71±4009.63 59 149.07±12 242.74 60 528.31±14 388.93 40 908.03± 7 204.26順鉑組 5 26 004.03± 8 297.62▲▲▲△△△33 698.95±4463.42▲▲ 28 643.62± 6 182.55▲▲ 39 907.11± 6 382.09▲▲ 15 992.68± 6 162.31▲▲△△當(dāng)?shù)徒M 5 62 899.57± 9 564.33 36 716.74±6486.72▲▲ 51 396.54± 6 934.28 51 385.57±13 180.59 53 034.00±11 372.75當(dāng)高組 5 29 292.88±14 203.12▲▲▲△△59 534.89±7761.74▲▲△△△ 26 444.05±12 110.22▲▲△△△49 113.19±10 848.19 33 959.18± 9 279.70順低組 5 29 039.61± 8 219.32▲▲▲△△△25 638.99±3519.62▲▲△△▼ 19 987.26± 5 542.95▲▲△△△40 399.84±10 609.29▲▲ 19 515.75±11 404.74△順高組 5 18 438.29± 7 323.22▲▲▲△△△19 805.51±3884.25▲▲△△△▼▼▼19 636.58±10 545.93▲▲△△△18 188.49± 8 369.30▲▲▲△△△▼▼▽▽28 206.35±14 656.73

表 5 各組小鼠腫瘤組織 TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6 和 MyD88 蛋白表達(dá)比較（±s，平均灰度值）

表 5 各組小鼠腫瘤組織 TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6 和 MyD88 蛋白表達(dá)比較（±s，平均灰度值）

組別 n TLR2 TLR4 TLR6 M yD88 TRAF6模型組 5 91.33±1.79 77.68±3.76 88.61±1.88 81.35±2.38 76.92±2.35順鉑組 5 109.29±2.23▲▲▲△△ 101.88±1.92▲▲▲△△△ 118.33±1.00▲▲▲△△△ 109.99±1.79▲▲▲△△△ 112.10±2.09▲▲▲△△△當(dāng)?shù)徒M 5 97.49±0.62▲▲ 91.89±0.75▲▲▲ 101.98±1.24▲▲▲ 89.24±4.90▲▲▲ 89.24±5.03▲▲▲當(dāng)高組 5 104.04±4.19▲▲▲△△ 99.05±2.82▲▲▲△△△ 110.03±1.58▲▲▲△△△ 100.29±2.21▲▲▲△△△ 103.26±1.64▲▲▲△△△順低組 5 114.14±2.43▲▲▲△△△ 119.40±1.49▲▲▲△△△▼▼▼ 126.43±1.93▲▲▲△△△▼▼▼ 114.02±1.97▲▲▲△△△▼ 116.36±2.02▲▲▲△△△▼順高組 5 119.55±3.63▲▲▲△△△▼▼▼ 122.85±1.56▲▲▲△△△▼▼▼▽ 128.28±2.03▲▲▲△△△▼▼▼ 122.71±1.75▲▲▲△△△▼▼▼▽▽▽118.69±1.86▲▲▲△△△▼▼

圖 2 各組小鼠腫瘤組織 TLR2 病理形態(tài)（免疫組化染色，×400）

圖 3 各組小鼠腫瘤組織 TLR4 病理形態(tài)（免疫組化染色，×400）

圖 4 各組小鼠腫瘤組織 TLR6 病理形態(tài)（免疫組化染色，×400）

圖 5 各組小鼠腫瘤組織 M yD88 病理形態(tài)（免疫組化染色，×400）

圖 6 各組小鼠腫瘤組織 TRAF6 病理形態(tài)（免疫組化染色，×400）

5 討論

炎癥可通過 TLRs誘導(dǎo)內(nèi)源性介質(zhì)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。TLRs 高表達(dá)與腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，如陳戰(zhàn)等[7]研究顯示，胃癌組織中 TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)高于癌旁組織，其表達(dá)與胃癌分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，孫運(yùn)良等[8]研究顯示，TLR4 可能參與了胃癌的發(fā)生和發(fā)展，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 TLR4陽性率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，TNM 分期為Ⅲ＋Ⅳ期者 TLR4 蛋白表達(dá)率明顯高于Ⅰ＋Ⅱ期者，Spearman 等級(jí)相關(guān)分析表明，TLR4 蛋白表達(dá)與 MVD呈顯著正相關(guān)。Pimentel-Nunes P 等[9]研究表明，TLR2與幽門螺桿菌感染及胃癌發(fā)生均相關(guān)。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，TLR2、TLR4、TLR6 mRNA 在不同分化程度胃癌細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)于正常胃黏膜上皮GES-1 細(xì)胞明顯上調(diào)；不同濃度脂多糖干預(yù)胃癌SGC7901、BGC-823、MGC-803 細(xì)胞后，TLR2、TLR4、 TLR6 表達(dá)也明顯上調(diào)[10]。

劉鵬軍等[11]研究顯示，胃癌組織 TRAF6 陽性表達(dá)高于癌旁正常組織，其陽性表達(dá)與胃癌組織分化程度、TNM 分期有關(guān)，可能參與胃癌的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。Han F 等[12]研究認(rèn)為，TRAF6 是預(yù)后不良的胃癌患者的預(yù)測(cè)。張金明等[13]研究顯示，MyD88 在食管癌組織中的陽性表達(dá)率為 92.0%，明顯高于癌旁組織中17.3%的陽性表達(dá)率；M yD88 的陽性表達(dá)與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。唐樂輝等[14]研究顯示，與癌旁正常組織相比，M yD88 在乳腺癌組織中表達(dá)明顯增高；MyD88 的陽性表達(dá)與腫瘤的 TNM 分期、腫瘤大小、淋巴侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。厲鷗等[15]研究發(fā)現(xiàn)，MyD88 蛋白在肝癌組織中的陽性表達(dá)高于癌旁組織，MyD88 和 STAT3 表達(dá)與性別、分化程度、有無 HBV感染和肝硬化有關(guān)。秦艷等[16]研究發(fā)現(xiàn)，MyD88 蛋白表達(dá)與結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌中腺瘤異型性相關(guān)。

Maeda Y 等[17]研究表明，在炎癥相關(guān)胃癌小鼠模型中，阻斷 MyD88 的表達(dá)可以降低巨噬細(xì)胞中 TLR2與 COX-2/PGE2 的表達(dá)，M yD88 與 COX-2/PGE2 共同參與了腫瘤炎癥微環(huán)境的產(chǎn)生，并通過誘導(dǎo) TLR2的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Obonyo M 等[18]研究表明，幽門螺桿菌可以激活巨噬細(xì)胞中 TLR2 和 TLR4的表達(dá)，TLR2 激活 MyD88 通路對(duì)幽門螺桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生 IL-6 和 IL-1β 起到至關(guān)重要的作用。Kennedy C L等[19]報(bào)道，在 gp130 基因消減（F/F）小鼠胃癌模型中，TLR2 可以促進(jìn)腫瘤的增殖，而沉默 MyD88 基因可以抑制腫瘤的發(fā)生，其作用與促進(jìn)胃癌上皮細(xì)胞凋亡和抑制其增殖有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，加味當(dāng)歸貝母苦參丸方可使腫瘤組織瘤體縮小，抑瘤作用明顯，并且與化療藥物聯(lián)用后抗腫瘤作用更加明顯。免疫組化研究顯示，當(dāng)歸貝母苦參丸加味方可抑制腫瘤組織 TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6 和 MyD88 mRNA 和蛋白的表達(dá)，并且與化療藥物聯(lián)用后 TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和 MyD88 mRNA 和蛋白下調(diào)表達(dá)更明顯。另外，TLR2、TLR4、TLR6/MyD88 通路及下游 TRAF6 炎證相關(guān)通路參與了胃癌發(fā)病機(jī)制，加味當(dāng)歸貝母苦參丸可調(diào)控該通路發(fā)揮抗腫瘤作用。值得注意的是，中藥治療引起的靶標(biāo)分子轉(zhuǎn)錄層次的改變與蛋白層次的改變并不同步，蛋白層次的表達(dá)改變更加顯著一些，這說明中藥治療效應(yīng)除經(jīng)過基因轉(zhuǎn)錄外，表觀遺傳改變也可能起作用，這有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，當(dāng)歸貝母苦參丸加味方對(duì)荷瘤小鼠MFC 胃癌的抗瘤作用與下調(diào) TLRs通路分子 TLR2、TLR4、TLR6、RAF6 和 MyD88 mRNA 和蛋白的表達(dá)有關(guān)。

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Effects of Modified Danggui Beimu Kushen Pills on Toll-like Receptor Pathway Markers on MFC Gastric Cancer M ice

LI Hai-long1,2, WANG Yong1,2, ZHAI Yu1,2, CHENG Xiao-li3, AN Xia4, LI Hong-liang2, KANG Wan-rong2, WU Hong-yan2(1. School of Clinical Medicine, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. Key Laboratory of Traditional Chinese Herbs and Prescription Innovation and Transformation of Gansu Province, Key Laboratory of TCM Pharmacology and Toxicology in Gansu Province, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 3. Teaching and Research Center, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 4. Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730020, China)

Objective To study the effects of modified Danggui Beimu Kushen Pills on the expressions of TLR2, TLR4, TLR6, TRAF6 and M yD88 in tumor tissues on MFC gastric cancer bearing m ice; To discuss relevant mechanism of action. Methods MFC gastric cancer bearing mice were employed to perform anti-tumor experiment in vivo in this study. A total of eligible 48 mice were random ly divided into model group, DDP positive control group, modified Danggui Beimu Kushen Pills high-dose and low-dose groups, modified Danggui Beimu Kushen Pills high-dose and low-dose combined With DDP groups. The treatment was conducted once a day, and lasted for 14 continuous days. After the last administration of gavage orally treatment, all mice were anaesthetized and killed bycervical dislocation method to obtain tumor tissue completely for further HE staining measure and detection of TLR2, TLR4, TLR6, TRAF6 and MyD88 in tumor tissue With the method of RT-qPCR and immunohistochemistry. Meanwhile, the tumor grow th was observed and the general conditions of mice were recorded. Results The model group was rich in tumor cells; the sizes of cells were different; the volume was large; the nucleus was deeply stained and the heterotypic shape was obvious, and the small focal necrosis was seen. The number of tumor cells in each adm inistration group was reduced; the arrangement was loose; the cell volume was significantly reduced, and the nuclear pyknosis was reduced. Cell necrosis significantly increased; the number of interstitial blood vessels decreased; collagen fibers increased, especially in modified Danggui Beimu Kushen Pills high-dose and low-dose combined With DDP groups. Compared with the model group, the expressions of TLR2, TLR4, TLR6, TRAF6 and MyD88 mRNA and protein decreased in each adm inistration group. TLR2, TLR4, TLR6, TRAF6 and MyD88 were lighter and weakly positive expressed in modified Danggui Beimu Kushen Pillshigh-dose and low-dose combined With DDP groups, the protein changes were more obvious Compared with DDP positive control group, modified Danggui Beimu Kushen Pills high-dose and low-dose groups. Conclusion Modified Danggui Beimu Kushen Pills can down-regulate TLR2, TLR4, TLR6, TRAF6 and MyD88 expression of tumor tissue in MFC gastric cancer bearing mice at both mRNA and protein levels to play anti-tumor pharmacology action.

modified Danggui Beimu Kushen Pills; gastric cancer; Toll-like receptor pathway; m ice

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.013

R285.5

A

1005-5304(2017)08-0054-06

2016-11-06）

（

2016-12-25；編輯：華強(qiáng)）

甘肅省科技廳自然科學(xué)基金 B 類計(jì)劃項(xiàng)目（1310RJZA099）；甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（ZDSYS-KJ-2015-010）

吳紅彥，E-mail：wu.hy@126.com