毛建霏，王加啟鄭楠文芳李松勵(lì)雷紹榮，郭靈安，付成平，仲伶俐

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（北京），農(nóng)業(yè)部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（北京），動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心;農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(成都),成都610066）

UHPLC法測(cè)定生鮮乳中黃曲霉毒素M1及M2

毛建霏1,2，王加啟1，鄭楠1，文芳1，李松勵(lì)1，雷紹榮2，郭靈安2，付成平2，仲伶俐2

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（北京），農(nóng)業(yè)部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（北京），動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心;農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(成都),成都610066）

建立了免疫親和層析凈化同時(shí)測(cè)定生鮮乳中黃曲霉毒素M1和M2的-超高效液相色譜（ultra high performance liquid chroma?tography，UHPLC）-熒光檢測(cè)法。黃曲霉毒素M1儀器線性范圍0.40～100 μg/mL，儀器定量限0.40 ng/mL，儀器檢出限0.10 ng/mL，方法檢出限0.005 μg/kg，回收率91.8%～96.8%；。黃曲霉毒素M2儀器線性范圍0.10～100 μg/mL，儀器定量限0.10 ng/mL，儀器檢出限0.03 ng/mL，方法檢出限0.0015 μg/kg，回收率86.4至94.1%。兩者的日內(nèi)和日間變異系數(shù)均小于10%。使用該方法對(duì)來自成都市20個(gè)牧場的20個(gè)生鮮乳進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果黃曲霉毒素M1的風(fēng)險(xiǎn)是安全可控的。此外除了黃曲霉毒素M1，還應(yīng)加強(qiáng)黃曲霉毒素M2的監(jiān)控。

超高效液相色譜；免疫親和層析凈化；黃曲霉毒素M1；黃曲霉毒素M2；生鮮乳

0 引言

黃曲霉毒素被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為1類致癌物[1-5]。黃曲霉毒素M1(AFM1)和M2(AFM2)分別為黃曲霉毒素B1和B2的羥基化代謝物[6-7]。當(dāng)哺乳動(dòng)物食用黃曲霉毒素污染的食物后，代謝物會(huì)分泌到乳汁中造成污染[8]。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)的數(shù)據(jù),數(shù)十個(gè)國家已對(duì)牛奶及乳制品中的AFM1含量進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定[9]。雖然對(duì)AFM1的監(jiān)測(cè)已經(jīng)有大量報(bào)告[2,10-13],但對(duì)于牛奶中的AFM2的監(jiān)測(cè)還很少[14-15]。目前已經(jīng)有了普通液相色譜同時(shí)測(cè)定AFM1和AFM2的報(bào)告，但耗時(shí)較長，且并未對(duì)我國生鮮乳進(jìn)行測(cè)定，缺乏目前我國生鮮乳AFM1和AFM2的數(shù)據(jù)[16,17]。本文采用超高效液相色譜法對(duì)生鮮乳中的AFM1和AFM2進(jìn)行了準(zhǔn)確快速的同時(shí)測(cè)定，并對(duì)成都市20個(gè)牧場的生鮮乳進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明AFM1和AFM2的風(fēng)險(xiǎn)安全可控。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器、試劑與材料

安捷倫1290超高效液相色譜儀：四元泵(G7104A)，自動(dòng)進(jìn)樣器(G7167B)，柱溫箱(G7116B)，熒光檢測(cè)器(FLD,G1321B)。安捷倫化學(xué)工作站(版本C.01 07 SR1[13])。

色譜柱：Phenomenex Kinetex XB-C18,1.7 μm, 2.1 mm×100 mm。

黃曲霉毒素M1標(biāo)液(10.0 μg/mL，溶于乙腈)；黃曲霉毒素M2標(biāo)液(10.0 μg/mL，溶于乙腈)；甲醇(色譜純)；乙腈(色譜純)；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水；黃曲霉毒素M1免疫親和柱(Clover)。

1.2 UHPLC條件

進(jìn)樣體積：10 μL，樣品溶劑為50%甲醇/水溶液（體積比）；

流動(dòng)相：25%乙腈/水溶液（體積比）等度洗脫，流速0.30 mL/min；

柱溫：40℃；

熒光檢測(cè)器波長：激發(fā)365 nm，發(fā)射435 nm；熒光檢測(cè)器增益：12；

峰響應(yīng)參數(shù)：峰寬＞0.05 min。

1.3 牛奶樣品采集及前處理

生鮮乳使用無菌瓶采集后,立即與冰袋一起置于保溫箱中帶回實(shí)驗(yàn)室處理。稱取50.0 g生鮮乳于離心管，4 500 r/min，4℃離心10 min，玻璃纖維濾紙過濾后以1～2滴每秒的速度將液體全部通過免疫親和柱。用20 mL純水以1～2滴每秒的速度清洗，擠干。用1.25 mL甲醇以2～3 s每滴的速度洗脫至空氣進(jìn)入，收集于試管。加入1.25 mL純水渦旋混勻后，用0.22 μm孔徑尼龍濾頭過濾裝瓶，待上機(jī)。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法選擇

由于黃曲霉毒素在牛奶中的含量極低,需要采用準(zhǔn)確靈敏的檢測(cè)方法。免疫親和柱凈化方法目前仍然為常用的凈化方法,能夠從復(fù)雜基質(zhì)中富集極低濃度的目標(biāo)化合物,并具有極高的選擇性[18]。過去對(duì)牛奶中霉菌毒素的關(guān)注主要集中在AFM1上，本研究發(fā)現(xiàn)，常用的AFM1免疫親和柱可以同時(shí)對(duì)AFM2進(jìn)行富集和凈化。因此本研究采用AFM1免疫親和柱作為樣品前處理方法。洗脫時(shí)使用1.25 mL甲醇可以充分將待測(cè)物洗脫，直接加水稀釋減輕溶劑效應(yīng)，避免了繁瑣的溶劑替換，大大提高了檢測(cè)效率。

2.2 液相條件優(yōu)化

使用近年來商品化的核殼填料色譜柱進(jìn)行液相分離，相比傳統(tǒng)全多孔填料，其具有更高的柱效[10,19-20]。使用乙腈-水或者甲醇-水均能夠有效分離AFM1和AFM2。由圖1可以看出，使用25%乙腈/水(圖2a)和40%甲醇/水(圖2b)體系可以獲得相似的保留情況，但使用25%乙腈/水作為流動(dòng)相可以獲得更尖銳的峰形，從而提高靈敏度。因此使用25%乙腈/水作為流動(dòng)相。對(duì)于高柱效的核殼填料色譜柱，采用梯度洗脫可以使峰高進(jìn)一步增加，但考慮到靈敏度已經(jīng)滿足國內(nèi)外嚴(yán)格限量要求并且25%乙腈/水作為流動(dòng)相等度分析AFM1在國內(nèi)外較為常用[21]，為節(jié)約分析時(shí)間，仍然采用等度洗脫方法。

圖1 兩種流動(dòng)相體系分析AFM1和AFM2的UH?PLC-FLD色譜

熒光檢測(cè)器屬于濃度型檢測(cè)器,在一定范圍內(nèi),色譜峰的峰高隨著進(jìn)樣量的增加而增加。在相同儀器條件下噪音水平相當(dāng)，因此更高的峰高意味著更高的靈敏度。但過大的進(jìn)樣量容易造成色譜峰展寬,尤其是使用高柱效色譜柱和超高效液相色譜儀并存在溶劑效應(yīng)的情況下。由圖2可以看出，1～10μL進(jìn)樣體積時(shí)，峰高與進(jìn)樣量成正比，并且色譜峰沒有明顯展寬，當(dāng)超過10μL進(jìn)樣體積時(shí)，色譜峰高增加不明顯，并且峰寬開始明顯增加。因此使用10μL進(jìn)樣體積。

圖2 不同進(jìn)樣量情況下AFM1和AFM2的UHPLC-FLD色譜

2.3 方法驗(yàn)證

該分析條件下，在0.040～100 ng/mL質(zhì)量濃度范圍，AFM1質(zhì)量濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程y=3.2256x-0.1034，相關(guān)系數(shù)0.99999，y為峰面積，x為質(zhì)量濃度；在0.010～100 ng/mL質(zhì)量濃度范圍，AFM2質(zhì)量濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系，AFM2線性回歸方程y=8.4493x-0.1089，相關(guān)系數(shù)0.99999。

在空白生鮮乳中添加3個(gè)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（低、中、高3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02,0.1,0.4 μg/kg）的AFM1和AFM2進(jìn)行回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)6個(gè)平行樣，在不同日重復(fù)測(cè)定2次，計(jì)算日內(nèi)、日間變異系數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。從表中可以看出，本方法AFM1在3個(gè)添加水平平均回收率范圍在91.8至96.8%之間，變異系數(shù)范圍在3.6%至6.1%之間，AFM2在3個(gè)添加水平平均回收率范圍在86.4至94.1%之間，變異系數(shù)范圍在3.8%至5.7%之間，均具有良好的正確度和精密度，同時(shí)可看出測(cè)定的誤差與殘留水平?jīng)]有明顯相關(guān)關(guān)系。

表1 AFM1和AFM2方法回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果%

圖3為UHPLC-FLD色譜圖。圖3（a）中，AFM1對(duì)應(yīng)信噪比為10時(shí)的儀器定量限為0.40 ng/mL，AFM2對(duì)應(yīng)信噪比為10時(shí)的儀器定量限0.10 ng/mL。AFM1和AFM2對(duì)應(yīng)信噪比為3時(shí)的儀器檢出限分別為0.10 ng/mL和0.03 ng/mL。以取50 g樣品最終定容至2.5mL計(jì)算，AFM1和AFM2方法定量限分別為0.005 μg/kg和0.0015 μg/kg。AFM1和AFM2的保留時(shí)間分別為1.85和2.31 min，相比傳統(tǒng)HPLC在靈敏度顯著提高的同時(shí)獲得更好的色譜分離并顯著縮短樣品的儀器分析時(shí)間。

圖3 UHPLC-FLD色譜

2.4 樣品分析

使用該色譜方法對(duì)20個(gè)收集于成都市不同牧場和奶站的生鮮乳樣品進(jìn)行測(cè)定，含AFM10.31μg/kg和AFM20.018μg/kg的典型生鮮乳樣品的色譜圖如圖3（b）所示，AFM1和AFM2獲得快速分離，峰型良好并且無干擾峰。20個(gè)樣品AFM1檢出率65%，最大值0.31μg/kg,平均值0.026μg/kg,遠(yuǎn)低于國家限量值；AFM2檢出率65%，最大值0.018μg/kg，平均值0.0031μg/kg，含量為AFM1的1/8左右。

3 結(jié)論

本文建立了同時(shí)測(cè)定生鮮乳中黃曲霉毒素M1和黃曲霉毒素M2的免疫親和層析凈化-超高效液相色譜法，具有良好的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度。通過對(duì)20個(gè)收集于成都市不同牧場和奶站的生鮮乳樣品進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素M1和黃曲霉毒素M2的存在是比較普遍的(檢出率均為65%)。兩者的平均含量和最大值均遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)?？傊?，分析結(jié)果表明目前成都市生鮮乳中黃曲霉毒素M1和黃曲霉毒素M2的風(fēng)險(xiǎn)是安全可控。此外，有必要增加對(duì)AFM2的監(jiān)測(cè)，以免造成風(fēng)險(xiǎn)的低估。

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Quantification of aflatoxin M1and aflatoxin M2in raw milk with UHPLC

MAO Jianfei1,2,WANG Jiaqi1,ZHENG Nan1,WEN Fang1,LI Songli1,LEI Shaorong2, GUO Lingan2,FU Chengping2,ZHONG Lingli2
(1.Institute of Animal Science of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Ministry of Agriculture Laboratory of Quali?ty&Safety Risk Assessment for Dairy Products(Beijing),Ministry of Agriculture-Milk and Dairy Product Inspection Center(Beijing),State Key Laboratory of Animal Nutrition,Beijing 100193,China;2.Analysis and Testing Center of Si?chuan Academy of Agricultural Science;Laboratory of Quality&Safety Risk Assessment for Agro-products(Chengdu), Ministry of Agriculture,Chengdu,610066,China)

An ultra high performance liquid chromatography with fluorescence detection(UHPLC-FLD)after immunoaffinity column puri?fication has been developed for the simultaneous determination of AFM1and AFM2in raw milk.The linear range of AFM1is 0.40～100 μg/ mL and the instrumental limits of quantification and determination are 0.40 ng/mL and 0.10 ng/mL,respectively.The limit of determination of method is 0.005 μg/kg and the average recoveries were 91.8%～96.8%for AFM1.The linear range of AFM2is 0.10～100 μg/mL and the in?strumental limits of quantification and determination are 0.10 ng/mL and 0.03 ng/mL,respectively.The limit of determination of method is 0.0015 μg/kg and the average recoveries were 86.4%～94.1%for AFM2.Inter and intra day CVs were lower than 10%for both AFM1and AFM2.The proposed sensitive UHPLC-FLD method was applied to 20 raw milk samples collected from 20 different pastures in Chengdu. As the results indicate,the contamination level of AFM1is quite safe.Besides,AFM2should also be routinely monitored along with AFM1.

immunoaffinity column purification;UHPLC;Aflatoxin M1;Aflatoxin M2;raw milk

TS252.7

：A

：1001-2230（2017）06-0045-04

2016-12-31

國家奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重大專項(xiàng)(GJFP2016008002)；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)(201403071)；四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)秀論文基金2014LWJJ-010；2016年“西部之光”訪問學(xué)者項(xiàng)目。

毛建霏（1983-），男，碩士研究生，從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作。

鄭楠