王亞軍 浪萬英 宋亞文 張來舉 宋凱

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，甘肅 蘭州 730000 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院2014級(jí)碩士研究生,甘肅 蘭州 730000

近些年，我國(guó)患骨質(zhì)疏松癥的人數(shù)呈上升趨勢(shì)，且因其嚴(yán)重的癥狀引起醫(yī)學(xué)人士的關(guān)注[1-3]。為此，醫(yī)學(xué)專業(yè)人員不斷探索，尋求有效的防治方法。其探索范圍主要涉及西藥、中醫(yī)藥以及運(yùn)動(dòng)和飲食療法。其中中醫(yī)治療方法中，針灸顯示了其獨(dú)特的治療優(yōu)勢(shì)[4，5]。因此，醫(yī)學(xué)研究人員開始對(duì)針灸治療骨質(zhì)疏松癥的效果及其機(jī)理進(jìn)行研究總結(jié)[6，7]。本文從基因水平研究了針刺血清對(duì)去卵巢大鼠骨形成和骨吸收活性的影響，為后續(xù)研究針刺治療骨質(zhì)疏松癥提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

電針(上海華誼醫(yī)用儀器有限公司)；雙能X線骨密度測(cè)定儀(美國(guó)GE公司)；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司 批號(hào)：199A3)；兔IgG-免疫組化試劑盒SABC即用型(博士德生物工程有限公司 批號(hào)：SA1022)；大鼠OPG原位雜交檢測(cè)試劑盒(博士德生物技術(shù)有限公司 批號(hào)：MK2149)；大鼠RANKL原位雜交檢測(cè)試劑盒(博士德生物技術(shù)有限公司 批號(hào)：MK2100-r)；大鼠成骨細(xì)胞專用培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司 批號(hào)：CM-R091)；PBS液(北京雷根生物技術(shù)有限公司 批號(hào)：0111/A16)；通用細(xì)胞凍存液(北京雷根生物技術(shù)有限公司 批號(hào)：0111A16)；過氧化物酶阻斷液(博士德生物工程有限公司 批號(hào)：11C17B08)；DAB顯色試劑盒(博士德生物技術(shù)有限公司 批號(hào)：11B23C22)； 載玻片(中國(guó)制造批號(hào)：CAT.7101P)；顯微鏡蓋玻片(中國(guó)制造 批號(hào)：10212020C)；針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠，0.35 mm×13 mm，0.5寸)。

1.2 方法

1.2.1骨質(zhì)疏松癥模型大鼠的制備方法

選取SPF級(jí)2月齡SD雌性大鼠48只，隨機(jī)分為藥物組、針刺組、模型組和空白組，每組12只。將大鼠以0.3 mL/100 g的10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，在其最末肋骨下一橫指且旁開脊柱有一小的隆起處，剃去此處鼠毛，鋪無菌洞巾，以碘酊消毒。切開皮膚、背部肌肉、腹膜，以小鑷子輕輕將白色發(fā)亮脂肪團(tuán)拉出切口外，分離脂肪團(tuán)，便可見到粉色菜花樣卵巢。先將卵巢下端輸卵管用絲線結(jié)扎，然后摘除卵巢。切口縫合后，對(duì)皮，碘酊消毒，同法摘除另一側(cè)卵巢，造成骨質(zhì)疏松癥模型大鼠；空白組不切除[8]雙側(cè)卵巢。造模后飼養(yǎng)3個(gè)月，檢測(cè)骨密度和骨礦物含量。檢測(cè)結(jié)果顯示造模成功，見表1、表2。

組別nBMD(g/cm2)空白組120.172±0.003模型組120.157±0.012??

注：與空白組相比，**P<0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
Note: Compared with the blank group,**P<0.01, statistically significant.

組別nBMC(g/cm2)空白組1219.62±0.017模型組1218.54±0.058??

注：與空白組比較，**P<0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
Note: Compared with the blank group,**P<0.01, statistically significant.

1.2.2動(dòng)物處理方法

空白組：不予任何處理，常規(guī)飼養(yǎng)。

模型組：灌服與藥物組同體積的蒸餾水，常規(guī)飼養(yǎng)。

藥物組：按照1 mL/100 g標(biāo)準(zhǔn)灌胃給予0．02 mg/mL戊酸雌二醇水溶液(大鼠給藥劑量按照人與大鼠體表面積比值折算而得)[9]，1次/1天，連續(xù)治療5天，間隔2天。20天1療程，治療3療程。

針刺組：“三陰交”穴位于后肢內(nèi)踝尖直上10 mm，直刺5 mm；“足三里”穴位于膝關(guān)節(jié)下側(cè)，腓骨小頭下緣5 mm處，直刺5 mm；“脾俞”穴位于第十一胸椎棘突下旁開1.5寸，直刺5 mm；“腎俞”穴位于第2腰椎棘突下旁開1.5寸，直刺5 mm。以大鼠腳趾中指和同身寸法確定旁開位置和針刺深度。剃去背部鼠毛，應(yīng)用針具及穴位常規(guī)消毒后，用30號(hào)0.5寸不銹鋼毫針快速刺入皮下一定深度，接入電針，頻率為2Hz，斷續(xù)波[10-12]，刺激強(qiáng)度1.0mA，以局部見肌肉輕微收縮為佳，每次15 min。同時(shí)灌服與藥物組同體積的蒸餾水，1次/1天，連續(xù)治療5天，間隔2天。20天1療程，治療3療程。

1.2.3大鼠全身骨密度檢測(cè)

治療3個(gè)療程后，采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉各組大鼠。待至大鼠處于全身迷醉狀態(tài)下(用拇指和食指掐其尾端，如果大鼠沒有甩尾動(dòng)作，顯示達(dá)到最佳測(cè)定時(shí)段)，將其依次置于骨密度測(cè)定儀器。將大鼠置于測(cè)定板上，使四肢，尾部全部集中于測(cè)定板上，使頭部，軀體和尾部處于測(cè)定板的縱端中線上，避免偏移，并使全身處于伸展?fàn)顟B(tài)。掃描全身，采用計(jì)算機(jī)顯示大鼠全身骨影像，保存掃描圖片，抄錄檢測(cè)數(shù)據(jù)[13-15]。

1.2.4大鼠成骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)

將SD大鼠乳鼠(來自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室)置于75%酒精中浸泡處死，無菌條件下取其顱骨并去除骨膜及結(jié)締組織，PBS 清洗3次；將骨片剪碎(大小約1 mm×1 mm×1 mm)，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，0.25%胰酶消化2 次(37 ℃，每次10 min)，棄去上清液，0.1% 的Ⅱ型膠原酶消化10 min，棄上清；再用0.1% 的Ⅱ型膠原酶消化4 次(37 ℃，每次20 min)，收集合并上清液，加入5 mL含血清的培養(yǎng)基中止酶消化，150目濾網(wǎng)過濾3次，1 000 r /min離心10 min；棄上清，加入培養(yǎng)基(α-MEM培養(yǎng)基，內(nèi)含10% PBS)，吹打均勻并計(jì)數(shù)。原代細(xì)胞懸液以3×104/mL接種于大皿(Nunc) 中培養(yǎng)，每皿10 mL，37 ℃、5%CO2和飽和濕度的條件下培養(yǎng)，每3 d換液1 次。待細(xì)胞鋪滿80%培養(yǎng)皿后進(jìn)行爬片培養(yǎng)。

1.2.5成骨細(xì)胞的血清處理方法

采用10%水合氯醛(0.03 mL/100 g)麻醉各組大鼠，待大鼠麻醉充分后，用5 mL真空采血針對(duì)準(zhǔn)心臟部位扎取一定量血液，冷置1 h，離心(2 500 r/min，25 min)，棄去沉淀物，保留上層血清。將上層血清采用56 ℃水浴滅活30 min，并用0.22 μm的濾網(wǎng)抽濾除菌。將各組制備血清依10%的比例加入爬片培養(yǎng)的成骨細(xì)胞3天后，4%多聚甲醛固定10 min。采用原位雜交法處理各組細(xì)胞爬片，并通過圖像分析處理軟件IPP選取恰當(dāng)視野，提取灰度值，結(jié)果采用積分光密度(IOD)表示。

1.2.6原位雜交方法

(1)OPG mRNA的檢測(cè)

運(yùn)用針對(duì)Osteoproteogrin(OPG)的寡核苷酸探針，經(jīng)地高辛標(biāo)記，采用多相寡核苷酸探針和高敏感標(biāo)記技術(shù)，并配合使用敏感性加強(qiáng)型的原位檢測(cè)方法。針對(duì)大鼠OPG靶基因的mRNA序列為：

(1)5’——TGGAC AACCC AGGAA ACCTT TCCTC CAAAA——3’

(2)5’——TTTGC CTGGG ACCAA AGTGA ATGCA GAGAG——3’

(3)5’——AGAAA TGATA GGGAA TCAGG TTCAA TCAGT——3’

將成骨細(xì)胞爬片采用4%多聚甲醛/0.1MPBS(PH7.2-7.6),含有1/1000DEPC,室溫固定20-30分鐘，蒸餾水充分洗滌，干燥后-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

30%H2O21份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘，蒸餾水洗滌2次。

暴露mRNA核酸片段：爬片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1 mL 3%檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，室溫消化5-120秒。PBS洗3次×5分鐘，蒸餾水洗1次。

后固定：4%多聚甲醛/0.1MPBS(PH7.2-7.6),含有1/1000DEPC,室溫固定10分鐘，蒸餾水洗滌3次。

預(yù)雜交：濕盒的準(zhǔn)備——干的雜交盒底部加20%甘油20 mL以保持濕度，每張爬片20 μL加預(yù)雜交液，恒溫箱38 ℃-42 ℃，2-4小時(shí)，吸取多余液體，不洗。

雜交：按每張爬片20 μL雜交液，加在爬片上，將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開后，蓋在爬片上，恒溫箱38 ℃-42 ℃雜交過夜。

雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37 ℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次。

滴加封閉液：37℃30分鐘，甩去多余液體，不洗。

滴加生物素化鼠抗地高辛：室溫120分鐘，PBS洗5分鐘×4次。

滴加SABC:室溫30分鐘，PBS洗5分鐘×3次。

滴加生物素化過氧化物酶：室溫30分鐘，PBS洗5分鐘×4次。

使用DAB顯色后流水清洗，乙醇梯度脫水，樹脂封片，拍照采集照片。

(2)RANKL mRNA的檢測(cè)

運(yùn)用針對(duì)RANKL的寡核苷酸探針，經(jīng)地高辛標(biāo)記，采用多相寡核苷酸探針和高敏感標(biāo)記技術(shù)，并配合使用敏感性加強(qiáng)型的原位檢測(cè)方法。針對(duì)大鼠RANKL靶基因的mRNA序列為：

(1)5’——TACTT TCGAG CGCAG ATGGA TCCTA ACAGA ATATC——3’

(2)5’——TTGGT ACCAT GATCG AGGCT GGGCC AAGAT CTCTA——3’

(3)5’——GATCC GGATC AAGAT GCGAC GTACT TTGGG GCTTT——3’

檢測(cè)步驟同上。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠全身骨密度BMD檢測(cè)結(jié)果

如表3所示，與空白組相比，模型組全身BMD顯著降低(P<0.01)，說明去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型建立成功。經(jīng)過藥物或針刺處理后，BMD顯著升高，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

組別nBMD(g/cm2)空白組120.179±0.001??模型組120.156±0.005藥物組120.169±0.034??針刺組120.170±0.001??

注：**P<0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
Note:**P<0.01, statistically significant.

2.2 大鼠全身骨礦物含量BMC檢測(cè)結(jié)果

如表4所示，與空白組相比，模型組全身BMC顯著降低(P<0.01)，說明去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型建立成功。經(jīng)過藥物或針刺處理后，BMC顯著升高，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

組別nBMC(g/cm2)空白組1222.213±0.016??模型組1218.550±1.086藥物組1220.038±2.105??針刺組1220.213±1.267??

注：**P<0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
Note:**P<0.01, statistically significant.

2.3 大鼠血清處理后成骨細(xì)胞OPG mRNA表達(dá)結(jié)果

如圖1所示，其中空白組OPG mRNA表達(dá)量最高，模型組最低，經(jīng)過藥物或針刺處理后，OPG mRNA表達(dá)顯著升高，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 各組成骨細(xì)胞OPG mRNA表達(dá)情況注：與模型組相比，**P<0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Fig.1 OPG mRNA expression in osteoblasts of each groupNote: Compared with the model group, **P<0.01，statistically significant.

2.4 大鼠血清處理后成骨細(xì)胞RANKL mRNA表達(dá)結(jié)果

如圖2所示，其中空白組RANKL mRNA表達(dá)量最低，模型組最高，經(jīng)過藥物或針刺處理后，RANKL mRNA表達(dá)顯著下降，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 各組成骨細(xì)胞RANKL mRNA表達(dá)情況注：與模型組相比,**P<0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Fig.2 RANKL mRNA expression in osteoblasts of each groupNote: Compared with the model group,**P<0.01，statistically significant.

3 討論

筆者在查閱有關(guān)針灸治療骨質(zhì)疏松癥的研究[16-18]中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)研究集中在探究針刺對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠生化、骨密度、生物力學(xué)、蛋白和基因等方面，其研究結(jié)果亦證實(shí)針灸確實(shí)能明顯改善患者的臨床骨質(zhì)癥狀。在此基礎(chǔ)上，本課題結(jié)合了“針灸血清學(xué)”研究方法并進(jìn)一步探索。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，藥物和針刺對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型大鼠均能取得療效。從成骨細(xì)胞骨重建方面來講，針刺血清能從基因水平影響成骨細(xì)胞OPG，RANKL的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)骨重建和骨破壞環(huán)節(jié)的平衡。因此，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床上針灸治療多種原因?qū)е碌墓琴|(zhì)疏松癥提供理論支持。

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，腎主骨生髓，脾主四肢肌肉，肝主筋。因此本研究依據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸學(xué)選取了最具調(diào)節(jié)肝脾腎三臟功能的穴位，同時(shí)設(shè)立陽性藥物組與之形成對(duì)比。探究結(jié)果進(jìn)一步深化了以往研究結(jié)果，給針灸治療骨質(zhì)疏松癥的理論研究再添新象，亦能更好地支持臨床采用針灸推拿治療骨質(zhì)疏松癥。與此同時(shí)，希望該領(lǐng)域研究人員能更深入探索運(yùn)用針灸骨質(zhì)疏松癥的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容[19-21]。