谷艷霞 王超 陳鉅濤 李婷婷 王俐婷 張杰 曹來(lái)偉 張兆輝 萬(wàn)芪

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LPA2對(duì)PC12細(xì)胞缺血再灌注損傷致細(xì)胞凋亡的作用

谷艷霞 王超 陳鉅濤 李婷婷 王俐婷 張杰 曹來(lái)偉 張兆輝 萬(wàn)芪

目的 探討LPA2在PC12細(xì)胞缺血再灌注損傷致細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的作用。方法 測(cè)最適缺氧時(shí)間：將PC12細(xì)胞分為6組，分別在三氣培養(yǎng)箱中糖氧剝奪0、3、6、9、12、15 h。換高糖培養(yǎng)基普通培養(yǎng)箱中復(fù)氧24 h，MTT測(cè)細(xì)胞存活率；將PC12細(xì)胞分為5組：正常組、缺血再灌注組(OGD組)、缺血再灌注+溶劑對(duì)照組(OGD+DMSO組)、缺血再灌注+LPA2激動(dòng)劑(Dodecylphosphate)組(OGD+激動(dòng)劑組)、缺血再灌注+LPA2抑制劑(H2L5186303)組(OGD+抑制劑組)，缺氧最適時(shí)間后再?gòu)?fù)氧24 h,MTT測(cè)細(xì)胞存活率，Western Blotting檢測(cè)LPA2及p-akt蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 缺氧處理12 h是模擬缺血再灌注損傷的最適時(shí)間；缺血再灌注組與正常組比較LPA2表達(dá)水平降低；激動(dòng)劑組與溶劑對(duì)照組比較LPA2表達(dá)水平增高，p-akt表達(dá)水平增高。結(jié)論 升高LPA2表達(dá)水平可提高細(xì)胞的存活率，LPA2在缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。

缺血再灌注 糖氧剝奪 溶血磷脂酸受體2 PC12細(xì)胞

目前腦血管病已成為危害人類健康和生命最重要的疾病之一，全球疾病中排名第二位死亡原因[1]。其中缺血性腦血管病占腦卒中總數(shù)的70%～80%，具有較高發(fā)病率、致死率和致殘率的特點(diǎn)[2]，尤其在我國(guó)發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，帶來(lái)嚴(yán)重的家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)。然而，缺血性腦血管病神經(jīng)損傷機(jī)制尚未明確，臨床上對(duì)該病的治療主要采用血管內(nèi)介入及靜脈溶栓治療，但再灌注損傷再次誘發(fā)神經(jīng)元凋亡，加重梗死面積。因此，保護(hù)腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞成為腦梗死治療的方法之一。

溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid，LPA)是生物體內(nèi)普遍存在的、對(duì)多種細(xì)胞具有不同生物活性的磷脂介質(zhì)[3]。前期研究表明LPA是血栓形成前的一種釋放物，可作為早期腦梗死形成的標(biāo)志物[4]。在缺血性腦血管病發(fā)生部位LPA水平增高，高水平的LPA可引起神經(jīng)細(xì)胞壞死[5]，此作用是通過(guò)激活細(xì)胞膜上6種G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)(LPA1-LPA6)[6]。然而，在此過(guò)程中各個(gè)受體所發(fā)揮的作用及其機(jī)制尚未明確。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明在6種受體中LPA2有抗凋亡作用[7]。本研究利用PC12細(xì)胞糖氧剝奪建立體外腦缺血再灌注模型，觀察LPA2變化PC12細(xì)胞的存活率的影響，并初步探討LPA2對(duì)于缺血再灌注損傷中的細(xì)胞發(fā)揮何種作用。

1 材料與方法

1.1 材料及主要儀器

PC12細(xì)胞(褐家鼠腎上腺嗜絡(luò)細(xì)胞瘤)購(gòu)于武漢大學(xué)生物典藏中心；DMEM-高糖培養(yǎng)基、DMEM-無(wú)糖培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司；胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司；RIPA裂解液購(gòu)于北京普利萊公司；BCA蛋白水平測(cè)定試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；MTT、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)于美國(guó)Amresco公司；Akt一抗、Phospho-Akt一抗、GAPDH購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司；LPA2一抗購(gòu)于SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY；三氣培養(yǎng)箱(長(zhǎng)沙華曦電子科技有限公司)，酶標(biāo)儀(Pemn E1mer)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 mg/ml鏈霉素)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次；傳代用0.25%胰酶室溫消化1 min，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT測(cè)最適缺氧時(shí)間

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞以1×104/孔接種于96孔板，并將細(xì)胞分為6組：正常組、缺氧3、6、9、12、15 h組，待細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)基，PBS洗2次，正常組加入高糖培養(yǎng)基在普通培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)24 h；缺氧組加入無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基放于37 ℃、1%O2、5%CO2、94%N2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)3、6、9、12、15 h,至觀察時(shí)間點(diǎn)將細(xì)胞取出，換回原培養(yǎng)基，置于普通培養(yǎng)箱復(fù)氧24 h；正常組正常培養(yǎng)24 h后及缺氧組復(fù)氧24 h后取出細(xì)胞，加入5 mg/mL的MTT溶液20 uL放置普通培養(yǎng)箱中避光孵育4 h后，棄上清，每孔加入DMSO100 uL，置于搖床上震蕩15 min,使結(jié)晶充分溶解后于570 nm處檢測(cè)各孔的吸光度值；每組樣本取3個(gè)復(fù)孔的平均值，每組設(shè)置空白組：加入DMSO；對(duì)照組：正常組。細(xì)胞存活率=(測(cè)試組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.3 細(xì)胞模型的構(gòu)建

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞以1.5×105/孔接種于直徑為35 mm的培養(yǎng)皿中，以1×104/孔接種于96孔板；置于普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，分為5組：正常組、缺血再灌注組(OGD組)、缺血再灌注+溶劑對(duì)照組(OGD+DMSO組)；缺血再灌注+LPA2受體激動(dòng)劑組(OGD+激動(dòng)劑組)、缺血再灌注+LPA2受體抑制劑組(OGD+抑制劑組)。正常組予以高糖培養(yǎng)基置于普通培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)；缺血再灌注組換無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基置于37 ℃、1%O2、5%CO2、94%N2三氣培養(yǎng)箱中糖氧剝奪，缺氧至最佳時(shí)間，取出細(xì)胞，換回普通培養(yǎng)基；OGD組不做處理；OGD+DMSO組加入DMSO(濃度為與配制H2L5186303時(shí)DMSO稀釋的最終濃度)；OGD+激動(dòng)劑組加入激動(dòng)劑Dodecylphosphate(終濃度為100 nm);OGD+抑制劑組加入抑制劑H2L5186303(終濃度為100 nm)；放入普通培養(yǎng)箱復(fù)氧24 h后96孔板做MTT測(cè)細(xì)胞存活率；培養(yǎng)皿提取蛋白做western blotting。

1.2.4 western blotting測(cè)蛋白表達(dá)水平

培養(yǎng)皿中的PC12細(xì)胞經(jīng)糖氧剝奪后取出置冰上，棄培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入細(xì)胞裂解液120 uL，用干凈的刮棒收集細(xì)胞于1.5 mL EP管中，冰上裂解15 min,4 ℃12000 r/min離心5 min，收集上清液，加入1/3體積的4×loading buffer，100 ℃煮沸10 min，取出在室溫下冷卻后BCA法測(cè)蛋白水平；樣品中加入1/20體積的溴酚藍(lán)和β-巰基乙醇，100℃加熱10min，復(fù)溫；制備SDS-PAGE凝膠，每孔上樣蛋白20 ug,根據(jù)BCA測(cè)得的蛋白水平確定上樣體積，loading buffer 配平后電泳分離，聚偏二氟乙烯膜(PVDF)轉(zhuǎn)膜90 min，使用TBST清洗PVDF膜后5%脫脂奶粉封閉，室溫水平搖床1 h，再次清洗后用稀釋的兔抗鼠一抗中(LPA2，1∶500;p-akt，1∶500；t-akt，1∶1000；GAPDH,1∶1000)封閉，放置于4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜；取出后復(fù)溫30 min，TBST洗膜3次，每次10 min；洗膜后用抗兔熒光二抗(1∶20000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；ECL顯影，ImageJ軟件進(jìn)行條帶分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 MTT測(cè)缺氧12 h為最適合的缺氧時(shí)間

表1 OGD不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞存活率比較(%)

注：與正常組比較，*P<0.05

如表1所示，隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，PC12細(xì)胞的存活率逐漸下降。缺氧6 h、9 h、12 h、15 h后再?gòu)?fù)氧24 h的細(xì)胞與正常培養(yǎng)組相比，細(xì)胞存活率明顯降低，(P<0.05)，在缺氧12 h左右細(xì)胞的存活率在50%左右。

2.2 western Blotting測(cè)定各組細(xì)胞p-akt及LPA2蛋白表達(dá)水平

圖1 WesternBlotting檢測(cè)各組細(xì)胞LPA2/GAPDH蛋白表達(dá)水平 與正常組比較,*P<0.05;與OGD+DMSO組比較,#P<0.05

圖2 WesternBlotting檢測(cè)各組細(xì)胞p-akt/t-akt蛋白表達(dá)水平 與正常組比較,*P<0.05;與OGD+DMSO組比較,#P<0.05

如圖1所示，缺血再灌注組相比正常組LPA2表達(dá)顯著降低(P<0.05)；溶劑對(duì)照組相比OGD組沒(méi)有顯著性差異；激動(dòng)劑組相比OGD及溶劑對(duì)照組LPA2表達(dá)顯著增高(P<0.05)；抑制劑組相比OGD及溶劑對(duì)照組LPA2表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

如圖2所示，缺血再灌注組相比正常組p-akt表達(dá)均顯著降低(P<0.05)；溶劑對(duì)照組相比OGD組沒(méi)有顯著性差異；激動(dòng)劑組相比OGD及溶劑對(duì)照組p-akt表達(dá)顯著增高(P<0.05)；抑制劑組相比OGD及溶劑對(duì)照組沒(méi)有顯著差異。

2.3 MTT測(cè)定各組細(xì)胞存活率

如表2所示，缺血再灌注組細(xì)胞的存活率顯著低于正常組；激動(dòng)劑組細(xì)胞存活率相比OGD及溶劑對(duì)照組顯著增高(P<0.05)。

3 討 論

腦卒中發(fā)病率高、病死率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重危害著人類的身體健康和生命，是目前導(dǎo)致人類死亡的第二位原因[1]。大腦幾乎無(wú)能量?jī)?chǔ)備，因此腦組織對(duì)缺血缺氧性損傷十分敏感。全腦組織血供完全中斷5分鐘最易損的特定神經(jīng)元出現(xiàn)不可逆損傷，10-20分鐘大腦皮質(zhì)出現(xiàn)廣泛的神經(jīng)元壞死[8]。近年來(lái)腦卒中的診療技術(shù)已有很大進(jìn)展，但是腦卒中發(fā)生后患者的病理生理過(guò)程無(wú)法逆轉(zhuǎn)，患者神經(jīng)功能恢復(fù)并不理想。

在腦卒中發(fā)病早期，局部腦缺血形成了中心壞死去及周圍的缺血半暗帶區(qū)。壞死區(qū)中神經(jīng)元死亡，半暗帶區(qū)由于存在側(cè)支循環(huán)，尚有大量存活的神經(jīng)元。如果在短時(shí)間內(nèi)迅速恢復(fù)半暗帶區(qū)的血流供應(yīng)，該區(qū)神經(jīng)元仍可以恢復(fù)功能。而中心壞死區(qū)即使很快恢復(fù)血供，會(huì)發(fā)生再灌注損傷繼續(xù)造成腦損傷，針對(duì)壞死區(qū)已無(wú)法挽救，只能進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)。因此搶救缺血半暗帶區(qū)是腦卒中早期治療的主要目的[9-11]。

表2 MTT測(cè)各組細(xì)胞存活率(%)

注：與正常組比較，*P<0.05；與OGD+DMSO組比較，#P<0.05

LPA是一種在生物體液中普遍存在的類似生長(zhǎng)因子的磷脂[12]。LPA介導(dǎo)多種重要的生物反應(yīng)，如生長(zhǎng)、增殖、分化、免疫、血管生成及血小板聚集[13]。目前已有6種G蛋白偶聯(lián)受體被定義為L(zhǎng)PA的受體，分別命名為L(zhǎng)PA1-LPA6。LPA1/EDG2, LPA2/EDG4和LPA3/EDG7屬于內(nèi)皮分化基因受體家族，和S1P家族有很高的同源性。LPA4/P2Y9/GPR23, LPA5/GPR94和LPA6/P2Y5屬于P2Y受體家族[14，15]。這些受體通過(guò)4種G蛋白Gi/o,Gq/11,Gs,G12/13激活一系列下游信號(hào)通路[15]。然而，不同的LPA受體管理廣泛的細(xì)胞反應(yīng)的分子機(jī)制尚不明確。在6種LPA受體中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明LPA2有抗凋亡作用，在電離輻射引起的凋亡中，LPA2基因缺失的老鼠凋亡率明顯增加[16]。細(xì)胞外的LPA刺激LPA2與Gi/o,Gq/11,G12/13三種G蛋白結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)如DNA合成、MAP激酶激活、AKT激活、抑制AC作用、提高細(xì)胞內(nèi)Ca濃度等[17]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在做大腦中動(dòng)脈栓塞模型大鼠的腦缺血半暗帶區(qū)LPA2mRNA表達(dá)顯著低于假手術(shù)組，因此我們提出設(shè)想，人為的改變LPA2的表達(dá)能否改變凋亡率。前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示LPA2對(duì)缺血半暗帶區(qū)有神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)利用PC12細(xì)胞進(jìn)行糖氧剝奪后正常培養(yǎng)模擬生物體內(nèi)的缺血再灌注現(xiàn)象。PC12細(xì)胞系來(lái)源于大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株，具有類似神經(jīng)元的形態(tài)和生理生化特性[18]。糖氧剝奪模型模擬體內(nèi)缺血缺氧，此過(guò)程中O2含量低于1%；使用不含血清不含糖培養(yǎng)基。雖然此模型的制備參照Hillion的方法[19]，但考慮到缺氧時(shí)長(zhǎng)受細(xì)胞及環(huán)境因素影響，因此先測(cè)定得到理想的模型所需缺氧時(shí)長(zhǎng)。如圖一，在缺氧6h之后與正常培養(yǎng)組相比較，細(xì)胞的存活率顯著降低，12 h存活率在50%左右。此時(shí)顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)開(kāi)始出現(xiàn)完整性的破壞，而缺氧15 h,損傷程度加重，形態(tài)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞。因此用缺氧12h細(xì)胞模擬缺血半暗帶區(qū)，是拯救細(xì)胞存活的關(guān)鍵點(diǎn)。隨后，將實(shí)驗(yàn)分成5組分別做western blotting和MTT。Western顯示缺血再灌注的四組相比正常組LPA2表達(dá)顯著降低，應(yīng)用激動(dòng)劑之后相比DMSO組LPA2表達(dá)顯著增加，抑制劑組相比DMSO組顯著降低。P-akt是磷酸化的Akt,介導(dǎo)復(fù)雜的抗凋亡信號(hào)通路。MTT及P-akt蛋白表達(dá)均表明缺血再灌注組存活率下降，激動(dòng)劑組相比DMSO組p-akt表達(dá)顯著增高。應(yīng)用抑制劑后LPA2的表達(dá)降低，Western Blotting測(cè)得細(xì)胞存活率相比DMSO組有所降低，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因有待更深入研究。綜合以上結(jié)果，缺血再灌注后LPA2表達(dá)降低，細(xì)胞存活率降低；應(yīng)用激動(dòng)劑提高LPA2的表達(dá)后細(xì)胞的存活率也增加。

因此，此實(shí)驗(yàn)可得出結(jié)論提高LPA2表達(dá)可減少細(xì)胞凋亡，LPA2通過(guò)下游通路對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用。目前關(guān)于腦卒中的早期治療，溶栓恢復(fù)血液供應(yīng)已在臨床廣泛應(yīng)用，而拯救更多的缺血半暗帶區(qū)的細(xì)胞也是相伴的主要治療手段，LPA及其各個(gè)受體對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的作用及機(jī)制有望成為神經(jīng)功能恢復(fù)的突破點(diǎn)。

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(2016-08-28收稿)

The effect of LPA2on PC12 cell apoptosis induced by ischemia/reperfusion injury

Gu Yanxia,Wang Chao,Chen Jutao, et al.

Department of Neurology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060

Objective To investigate the effect of LPA2on PC12 cell apoptosis induced by ischemia/reperfusion injury.Methods To detect the suitable time of the oxygen glucose deprivation,the PC12 cells were divided into 6 groups, which were deprived of oxygen for 0,3, 6, 9, 12 and 15 h in tri-gas incubators. The cell viability was measured by MTT after 24 h of reoxygenation in a normal incubator.Then,the PC12 cells were divided into 5 groups:the normal culture group; ischemia/reperfusion group, ischemia/reperfusion group+ solvent control(DMSO) group, Ischemia/reperfusion+LPA2antagonist(H2L5186303) group, ischemia/reperfusion+LPA2agonist (Dodecylphosphate) group. The cell viability was measured by MTT assay and the protein expression of LPA2and p-akt were detected by western blotting.Results The oxygen glucose deprivation for 12 hours migat be the suitable time for inducing neuron injury. The expression of LPA2receptor in OGD groups were lower than that in normal group and the expression of p-akt in the OGD group was lower than that in the normal control group. The expression of LPA2receptor and p-akt in the agonist group were higher than that in the solvent control group.Conclusion Increasing the expression of LPA2could improve the survival rate of cells, LPA2played a protective role in PC12 cell apoptosis induced by ischemia/reperfusion injury

Ischemia/reperfusion Oxygen glucose deprivation Lysophosphatidic acid receptor 2 PC12 cell

武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部創(chuàng)新種子基金項(xiàng)目

430060 武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科[谷艷霞(在讀碩士研究生) 王超 陳鉅濤 李婷婷 王俐婷 張杰 曹來(lái)偉 張兆輝(通信作者)]；武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理系(萬(wàn)芪)

R743.32

A

1007-0478(2017)03-0177-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.03.002