余燕?歐國燈?杜耀民?梁蔚陽?鄧鋒

[摘要] 目的 通過對近年來華南地區(qū)早期自然流產(chǎn)孕婦的血清樣品的B19和Parv4感染狀況調(diào)查，分析華南地區(qū)人細(xì)小病毒感染與早期自然流產(chǎn)的關(guān)系。方法 選取門診確診的379例早期自然流產(chǎn)患者，采用q-PCR方法檢測B19和Parv4的感染狀況及病毒載量，以同期348例人工流產(chǎn)孕婦進行對比，將相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。結(jié)果 華南地區(qū)孕婦人群中B19感染率略高于已有調(diào)查地區(qū)，妊娠期前后B19和Parv4感染與妊娠不良結(jié)局有密切關(guān)系。結(jié)論Parv4常與B19合并感染，B19指標(biāo)在很大程度上同時可以反映Parv4的風(fēng)險。

[關(guān)鍵詞] 華南地區(qū)；細(xì)小病毒；q-PCR；早期流產(chǎn)

[中圖分類號] R714.21 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）10-07-04

Relationship between human parvovirus B19 and Parv4 infection and spontaneous abortion in Southern China

YU Yan1 OU Guodeng1 DU Yaomin2 LIANG Weiyang1 DENG Feng1

1.Guangdong Institute for Drug Control，Guangzhou 510180，China；2.Guangdong General Hospital，Guangzhou 510180，China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between infection and early spontaneous abortion in Southern China，to investigate the serum B19 and Parv4 infection in pregnant women with early spontaneous abortion in recent years. Methods 379 cases of patients with early abortion diagnosed in clinic were selected，The q-PCR method was used to detect infection and virus B19 and Parv4 load.At the same period， 348 cases of artificial abortion of pregnant women were selected as control.The relevant data was statistically analyzed. Results The prevalence of B19 infection in pregnant women in Southern China area is slightly higher than that in the investigated areas. Conclusion The B19 and Parv4 infection before and after pregnancy are closely related to the adverse pregnancy outcomes.Parv4 often associates with B19 infection. B19 indicators can largely reflect the risk of Parv4.

[Key words] Southern China；Parvovirus；q-PCR；Early abortion

以B19和Parv4為代表的人細(xì)小病毒感染與危害問題已引起國內(nèi)外醫(yī)藥和醫(yī)療行業(yè)高度關(guān)注。B19導(dǎo)致的疾病與很多因素有關(guān)，包括B19病毒的直接侵襲、機體免疫介導(dǎo)反應(yīng)、個體遺傳差異（如機體HLA、P血型等問題）以及機體的免疫狀態(tài)等[1-4]。此外也有研究表明，B19的感染與肝腎、神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和多種血液疾病有一定關(guān)系[5-6]。據(jù)筆者前期研究的統(tǒng)計，約4%～ 5%的血液制品中可檢測出PARV4或其變種PARV5，在HCV、HBV感染者甚至部分健康獻血者血漿中（<2%）也可檢出。Parv4雖未證實存在直接致病性，但其潛在風(fēng)險和間接危害不容忽視[7-11]。已有研究報道，B19可能與妊娠早期的自然流產(chǎn)有關(guān)[12-15]。

此外，目前國內(nèi)尚無B19和Parv4病毒的標(biāo)準(zhǔn)

檢測方法，實驗室檢測兩種病毒最常用的方法主要有核酸檢測法和血清學(xué)檢測法[16-22]。前者主要包括斑點雜交、原位雜交及PCR等方法；后者主要有通過檢測IgG和IgM的構(gòu)象表位抗體的抗體檢測法，以及通過原核表達系統(tǒng)及真核表達系統(tǒng)來制備的、以檢測病毒衣殼蛋白VP1和VP2的抗原檢測法，筆者在前期研究中已建立準(zhǔn)確度較高、快速靈敏的q-PCR方法[23]。本文試圖通過對多例妊娠早期自然流產(chǎn)與人工流產(chǎn)的孕婦血清中細(xì)小病毒感染率的差異，以探究細(xì)小病毒B19和Parv4與早期自然流產(chǎn)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年6月～2016年10月于廣東省人民醫(yī)院（含東川路門診和惠福西路門診）經(jīng)門診及住院檢查收集的379例不明原因流產(chǎn)或死胎的孕婦血清作為研究組，平均年齡為（28.1±4.2）歲，流

產(chǎn)時妊娠天數(shù)為23 ～ 71d，考慮到對照組的可比性，同時在上述門診以同期同地隨機選取人工流產(chǎn)的348例健康孕婦的血清為對照組，平均年齡為（24.2±2.5）歲，流產(chǎn)妊娠天數(shù)為40～77d。對照組和研究組在年齡和流產(chǎn)次數(shù)等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，且所有病例均通過診斷排除是由于母體免疫疾病、內(nèi)分泌失調(diào)、遺傳基因缺陷、子宮或生殖道畸形、宮腔黏粘以及不良外界環(huán)境影響、弓形蟲、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒感染等多種原因所造成的流產(chǎn)。endprint

1.2 樣品DNA的提取

無菌留取上述研究對象靜脈血5mL，加入細(xì)胞裂解液后，混勻，離心2000g 5min，離心后分離血清，按試劑盒說明操作，提取的病毒DNA-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 材料及方法

1.3.1 儀器 Ultrospec2100核酸蛋白快速測定儀（購自美國GE公司）；Gene Amp PCR System 9700核酸擴增儀（購自美國AB公司）；Bio-rad DNA 凝膠電泳儀（購自美國 Bio-rad公司）；Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)（購自美國Bio-rad公司）；Applied Biosystems 7300 Real-time PCR system（購自美國AB公司）；5804R低溫冷凍離心機（購自美國Eppendorf公司）。

1.3.2 試劑 質(zhì)粒提取試劑盒（購自北京天根生物有限公司 批號：VT303-01）；血液病毒DNA/RNA 小量提取試劑盒（購自上海妙駿生物有限公司 批號：GD2311-01）。Premix Taq 擴增反應(yīng)液（ 購自 Takara 公司 批號：3027A） ；血樣中B19和Parv4的檢測熒光定量試劑盒（自主研發(fā)）。該自主研發(fā)試劑盒所選取的B19、Parv4的引物及探針由上海生物工程有限公司合成。見表1。

1.3.3 熒光定量PCR檢測 將提取的血清DNA分別進行B19，parv4熒光定量檢測，B19PCR擴增反應(yīng)體系為：2×Premix Mix 12.5μL、酶0.25μL、B19.F/R

（10μmol/L）各1μL，B19-p（5μmol/L）1μL、DNA 5 μL、雙蒸水4.25μL，總反應(yīng)體積為25μL；Parv4檢測方法相同，僅加入引物及探針做對應(yīng)調(diào)整。反應(yīng)條件：50℃ 30min，然后以95℃ 2min、95℃ 5s、56℃ 50s 進行40個循環(huán)；結(jié)果通過CT值（CT<35）判別陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計學(xué)軟件采用SPSS 16.0，計量資料以（）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗，等級資料采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組B19的q-PCR檢測結(jié)果

在研究組的379例早期/中期流產(chǎn)孕婦中，B19的q-PCR檢測結(jié)果呈陽性者共75例，占該組比例為19.7%；而對照組的348例孕婦血清檢測結(jié)果呈陽性者共12例，占該組比例為3.44%，兩組間差異統(tǒng)計學(xué)意義顯著，P=0.040。研究組的B19陽性統(tǒng)計概率為對照組的6.35倍（95%CI 1.2～17.83）。研究組75例陽性者中，B19濃度范圍為1.9×104～3.7×106copies/mL，對照組陽性者中濃度范圍為1.2×103～1.8×105copies/mL，研究組陽性者樣品中病毒載量高于研究組約1個數(shù)量級。

2.2 兩組Parv4的q-PCR檢測結(jié)果

在研究組的379例早期自然流產(chǎn)孕婦中，Parv4的q-PCR檢測結(jié)果呈陽性者共13例，占該組比例為3.43%；而對照組的348例孕婦血清檢測結(jié)果呈陽性者共3例，占該組比例為0.86%，兩組間差異統(tǒng)計學(xué)意義顯著，P=0.042。研究組的Parv4陽性統(tǒng)計概率為對照組的5.34倍（95%CI 1.1～15.83）。

研究組13例陽性者中，Parv4濃度范圍為3.1×103～2.7×105copies/mL，對照組陽性者中濃度范圍為1.2×103～1.8×104 copies/mL，研究組陽性者樣品中病毒載量顯著高于研究組。

值得注意的是，在早期自然流產(chǎn)孕婦中Parv4檢測呈陽性者的13例中，有12例B19的檢測也呈陽性，而在對照組的Parv4檢測呈陽性者的3例中，也有2例B19的檢測結(jié)果呈陽性。

3 討論

HPV B19是細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬中一大類目前已知的可使人類致病的、結(jié)構(gòu)最簡單的無包膜線狀單鏈DNA 病毒，感染B19后臨床表現(xiàn)可為無明顯癥狀、傳染性紅斑及頭痛發(fā)燒、慢性貧血及短暫性再生障礙危象等[22] ，此外HPV B19也會導(dǎo)致宮內(nèi)感染引起一些不良妊娠結(jié)局如孕婦非免疫性流產(chǎn)及胎兒水腫等；Parv4是另一種稍晚發(fā)現(xiàn)的一類細(xì)小病毒，其危害尚未明確，多數(shù)認(rèn)為與B19具有一定相似性，兩者均可通過呼吸道、血液制品、輸血等方式傳播，兒童和孕婦為主要易感人群[24]。據(jù)報道地方性流行時孕婦發(fā)病率可達1%～2%，而幼兒教師、兒童等發(fā)病率更是高達20%～30%[25]。筆者在前期的無償獻血樣品調(diào)查中也發(fā)現(xiàn)，華南地區(qū)的健康獻血者中B19攜帶率已高達3-7%，Parv4的攜帶率統(tǒng)計數(shù)據(jù)較少，但一般認(rèn)為遠(yuǎn)低于B19[23]。

在1984年有研究人員首次報道B19可通過胎盤垂直傳播[26]，歐美研究報道，在B19病毒感染的流行期，其中3%～8%的孕婦存在急性感染，胎盤垂直傳播率為33%～51%，有5%～16%的感染孕婦出現(xiàn)了嚴(yán)重胎兒發(fā)病和死亡，因為B19病毒對人骨髓和脾臟中的祖代紅細(xì)胞具有特殊嗜性，妊娠中期胎兒紅細(xì)胞快速增長且壽命較短，不能形成有效的免疫反應(yīng)來對抗感染，故胎兒感染B19后會使胎兒造血系統(tǒng)的紅系造血細(xì)胞受到破壞，胎兒發(fā)生造血危象、嚴(yán)重貧血、水腫及神經(jīng)系統(tǒng)畸形等，故而引起胎兒水腫和死胎[27]。有研究發(fā)現(xiàn)，感染B19的孕婦患早期流產(chǎn)的風(fēng)險性是未感染組的3.76倍[28]。另有研究數(shù)據(jù)表明，B19病毒是我國孕婦非免疫性流產(chǎn)等疾病的重要病因之一，并可發(fā)生于妊娠期任何時期，尤以旱中期妊娠多見[29]。對某地186例B19感染孕婦調(diào)查結(jié)果表明，胎兒受染率為33%，胎兒死亡率為9%[30]。有研究發(fā)現(xiàn)患者血清中B19IgM陽性率為23.08%，明顯高于對照組的6.67%，表明妊娠早期自然流產(chǎn)與近期B19存在密切聯(lián)系[31]。endprint

從本研究的數(shù)據(jù)來看，華南地區(qū)孕婦人群中B19感染率略高于國內(nèi)其它已有調(diào)查地區(qū)，可能原因為本研究所采用感染檢測方法的靈敏性有關(guān)。多數(shù)文獻均只研究妊娠期前后B19感染與妊娠不良結(jié)局的密切關(guān)系。而本研究發(fā)現(xiàn)不僅B19且Parv4感染均可造成胎兒畸形、胎兒水腫、死胎等，均是妊娠早期自然流產(chǎn)的原因之一。因此預(yù)防B19和Parv4感染以及孕前或孕早期B19和Parv4的篩查對預(yù)防不良妊娠結(jié)局的發(fā)生和優(yōu)生優(yōu)育有重要意義。同時研究也發(fā)現(xiàn)，Parv4常與B19合并感染，B19指標(biāo)在很大程度上同時可以反映Parv4的風(fēng)險。因此血清中的B19可能預(yù)示著存在包括Parv4在內(nèi)的其它人細(xì)小病毒的感染風(fēng)險。

[參考文獻]

[1] Miyagawa E，Yoshida T，Takahashi H，et al.Infection of the erythroid cell line，KU812 Ep6 with human parvovirus B19 and its application to titration of B19 infectivity[J].Journal of Virological Methods，1999，83：45-54.

[2] Gallinella G，Zuffi E，Gentilomi G，et al.Relevance of B19 markers in serum sample for a diagnosis of parvovirus B19 correlated diseases[J].Journal of Medical Virology，2003，71：135-139.

[3] Kaufmann B，Chipman PR，Kostyuchenko VA，et al. Visualization of the externalized VP2 N termini of infectious human parvovirus B19[J].Journal of Virology，2008，8：7306-7312.

[4] Azzi ACS，Morfrni M，Mariani Q，et al.Human parvovirus B19 infection in hemophiliacs first infused with two highpurity，virally attenuated factor VIII concentrates[J].AmJ Hematol，1992，39（3）：228-230.

[5] Santagostino EMP，Azzi A，Morfini M.Eliminating parvovirus B19 from blood products[J].Lancet，1994，43（9）：798.

[6] Laurian YDE，Chalvon-Demersay A，dOiron R，et al.Transmission of human parvovirus B19 by plasma derived factor VIII concentrates[J].Nouv Rev Fr Hematol，1994，36（6）：449-453.

[7] Rollag H，Pattison JR，Degre M，et al.Glomstein A.Prevalence of antibodies against parvovirus B19 in Norwegians with congenitalcoagulation factor defects treated with plasma products from small donor pools[J].Scand J Infect Dis，1991，23（6）：675-679.

[8] Kouki Mori，Yasuhiko Munakata，Takako Saito.Intrathyroidal persistence of human parvovirus B19 DNA in a patient with Hashimoto's thyroiditis[J].Journal of Infection，2007，55（2）：29-31.

[9] Edison L. Durigon，Dean D. Erdman，G.William Gary，et al.Multiple primer pairs for polymerase chain reaction （PCR） amplification of human parvovirus B19 DNA[J].Journal of Virological Methods，1993，44（3）：155-165.

[10] Somsak Tanawattanacharoen，Ronald J. Falk，J.Charles Jennette.Parvovirus B19 DNA in kidney tissue of patients with focal segmental glomerulosclerosis[J].American Journal of Kidney Diseases，2000，35（6）：1166-1174.

[11] Anders Lundqvist，Adiba Isa，Thomas Tolfvenstam，et al.High frequency of parvovirus B19 DNA in bone marrow samples from rheumatic patients[J].Journal of Clinical Virology，2005，33（1）：71-74.endprint

[12] Claudia Aberham，Claudia Pendl，Patricia Gross，et al.A quantitative，internally controlled real-time PCR Assay for the detection of parvovirus B19 DNA[J].Journal of Virological Methods，2001，92（2）：183-191.

[13] SchmidtⅠ，Biomel J，Seit H，et al.LoWer J Parvovirus B19 DNA in plasma pools and plasma derivatives[J].Vox Sanguinis，2001，81（4）：228-235.

[14] Ally AB，Nita S，Philip DM.Evaluation of different assays for the detection of parvovirus B19 DNA in human plasma[J].Journal of Virological Methods，2004，121（1）：7-16.

[15] Wang XM，Zhang GC，Liu F，et al.Prevalence of human parvovirus B19 DNA in cardiac tissues of patients with congenital heart diseases indicated by nested PCR and in situ hybridization[J].Journal of Clinical Virology，2004，31（1）：20-24.

[16] Kouki M，Yasuhiko M，Takako S.Intrantlyroidal persistence of human parvovirus B19 DNA in a patient with Hashimoto's thyroiditis[J].Journal of Infection，2007，55（2）：29-31.

[17] Expert committee on biological standardization.Guidelines on viral inactivation and removal procedures intended to assure the viral safety of human blood plasma products[J].Geneva，2001，32（2）：11-15.

[18] Saldanha J，Minor P.Detection of human parvovirus B19 DNA in plasma pools and blood products derived from these pools：implications for efficiency and consistency of removal of B19 DNA during manufacture[J].Br J Haematol，1996，93（3）：714-719.

[19] Zakrzewska K.Human parvovirus B19 in clotting factor concentrates：B19 DNA detection by the nested polymerase chain reaction[J].Br J Haematol，1992，81（3）：407-412.

[20] McOmish F.Detection of parvovirus B19 in donated blood：a model system for screening by polymerase chain reaction[J].J Clin Microbiol，1993，31（2）：323-328.

[21] Lefrere JJ，Mariotti M，Thauvin M.B19 parvovirus DNA in solvent/detergent-treated anti-haemophilia concentrates[J].Lance，1994，343（8891）：211-222.

[22] Geng Y，Wu CG，Bhattacharyya SP，et al.Parvovirus B19 DNA in Factor Ⅷ concentrates effects of manufacturing procedures and B19 screening by nueleica eidtesting[J].Transfusion，2007，47（5）：883-889.

[23] 鄭榮斌，余燕.血液制品中人細(xì)小病毒B19基因的檢測與分析[J].中國醫(yī)藥科學(xué)，2015，5（13）：151-153.

[24] Brown KE.The expanding range of parvoviruses which infect humans[J].Rev Med Virol，2010，20（4）：231-244.

[25] Hourfar MK，Mayr-Wohlfart U，Themann A，et al.Recipients potentially infected with parvovirus B19by red blood cell products [J].Transfusion，2011，51（1）：129-136.

[26] Corcoran A，Doyle S.Advances in the biology，diagnosis and hostpathogen interactions of parvovirus B19[J].J Med Microbiol，2004，53（Pt 6）：459-475.

[27] 彭燕.人微小病毒B19及其研究新進展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2013，29（7）：1021-1023.

[28] 周惠玲，程秀華，甘燕玲，等.妊娠早期人微小病毒B19感染對孕婦血液系統(tǒng)的影響[J].貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015，37（2）：20-23.

[29] Jia J，Ma Y，Zhao X，et al.Prevalence of human parvovirus B19 in Chinese plasma pools for manufacturing plasma derivatives[J].Virol J，2015，12（1）：162-164.

[30] Kleinman SH，Glynn SA，Lee TH，et al.A linked donor-recipient study to evaluate parvovirus B19 transmission by blood component transfusion[J]. Blood，2009，114（17）：3677-3683.

[31] Oberpenning F，Schmid HP，F(xiàn)uchs-Surdel W，et al.The impact of intraoperative manipulation of the prostate on total and free prostate-specific antigen[J].Int J Biol Markers，2002，17（3）：154-160.

（收稿日期：2017-04-06）endprint