鄭亞強，杜廣祖，李亦菲，陳 斌*，李正躍，肖關(guān)麗

馬鈴薯塊莖蛾腸道細(xì)菌分離鑒定及其對植物源大分子化合物的降解作用

鄭亞強1，杜廣祖1，李亦菲1，陳 斌1*，李正躍1，肖關(guān)麗2*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201)

為弄清馬鈴薯塊莖蛾腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)及其功能。本研究采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，對馬鈴薯塊莖蛾4齡幼蟲腸道細(xì)菌進(jìn)行了分離培養(yǎng)，采用16S rDNA序列對各菌株進(jìn)行種屬鑒定，并采用酶鑒定培養(yǎng)基法測定了腸道各細(xì)菌對淀粉、纖維素、木聚糖和果膠等植物源大分子物質(zhì)的降解作用。從馬鈴薯塊莖蛾腸道內(nèi)共分離到細(xì)菌8屬10種，分別為不動桿菌屬Acinetobacte、葡萄球菌屬Staphylococcus、腸桿菌屬Enterobacter、節(jié)細(xì)菌屬Arthrobacter、鞘氨醇桿菌屬Sphingobacterium、寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas、束村氏菌屬Tsukamurella和克雷白氏桿菌屬Klebsiella。其中僅鞘氨醇桿菌屬菌株LZD10、阿氏節(jié)桿菌屬菌株LZN13、煙草節(jié)桿菌屬菌株HZN9對淀粉具有明顯的降解作用，但對纖維素、木聚糖和果膠無降解作用，而其余菌株對4種化合物均無降解作用。該研究結(jié)果將為深入研究馬鈴薯塊莖蛾對馬鈴薯塊莖的食物適應(yīng)機(jī)制及防治提供理論依據(jù)。

馬鈴薯塊莖蛾；腸道細(xì)菌；降解作用

馬鈴薯塊莖蛾P(guān)hthorimaeaoperculella(Zeller)又名煙草潛葉蛾，隸屬于鱗翅目雙孔亞目麥蛾總科麥蛾科莖麥蛾屬(李后魂，2002)。該蟲目前已分布至亞洲、歐洲、北美洲、非洲、大洋洲、中美及南美洲，分布范圍較廣，該蟲能取食煙草、馬鈴薯、茄子、曼陀羅和龍葵等茄科作物和雜草。但是喜食煙草、馬鈴薯、茄子，其中馬鈴薯在大田種植期和儲存期皆能被其危害(Rondon and Xue，2010)。其分布范圍之廣，繁殖力之快，給防治帶來了巨大的困難。

昆蟲腸道微生物被認(rèn)為是昆蟲的第二套遺傳密碼(Zilber and Rosenberg，2008)，其參與昆蟲機(jī)體許多重要的生理生化反應(yīng)，如幫助昆蟲消化大分子物質(zhì)(Warneckeetal.，2007；Lundgren and Lehman，2010)、合成昆蟲所需的營養(yǎng)物質(zhì)(Hansenetal.，2011 ；Salemetal，2014)、介導(dǎo)昆蟲抗藥性(Mansourietal.，2013)、影響昆蟲的交配行為(Sharonetal.，2010)、寄主選擇性(McLeanetal.，2011)和對環(huán)境的適應(yīng)性(Tsuchidaetal.，2010)等生理作用。而基于昆蟲共生微生物和昆蟲的共生關(guān)系而發(fā)展起來的共生防治(Dillon and Dillon，2004)，將為害蟲綜合防治提供新途徑，因此弄清腸道微生物種類和功能顯得尤其重要。然而，對于馬鈴薯塊莖蛾腸道微生物的多樣性和功能還知之甚少，僅Sevim等(2015)直接將馬鈴薯塊莖蛾幼蟲體研磨成菌懸液，從中分離得到8個菌株，但是這些菌株具體的生理功能并不清楚。本研究基于微生物分離培養(yǎng)技術(shù)，對馬鈴薯塊莖蛾腸道細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)及形態(tài)與分子鑒定，測定了這些菌株對大分子物質(zhì)的降解能力，擬揭示馬鈴薯塊莖蛾腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和研究馬鈴薯塊莖蛾腸道細(xì)菌功能提供可培養(yǎng)菌株。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

供試馬鈴薯塊莖蛾采集于云南省宣威市板橋鎮(zhèn)馬鈴薯種植區(qū)，海拔1967 m，N26°05′52.3″，E104°04′27.5″，室內(nèi)采用馬鈴薯塊莖飼養(yǎng)3代。

1.2 主要試劑

果膠(Sigma公司)，可溶性淀粉(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)，纖維素(Sigma公司)，木聚糖(Sigma公司)，瓊脂糖(基因科技(上海)有限公司)，100 bp DNA ladder和2×Taq PCR Mastermix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，Goldview核酸染料(上海賽百盛基因技術(shù)有限公司)，引物Prime1：27F-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG，Prime2：1492R-CGGTTACCTTGTTACGA CTT(由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成)，溶菌酶，蛋白酶K，酚∶氯仿∶異戊醇(體積比25∶24∶1)，1×TE配制方法參照薩姆布魯克等(2002)的方法。

1.3 腸道細(xì)菌分離及形態(tài)鑒定

選取大小一致、健康的馬鈴薯塊莖蛾4齡幼蟲，饑餓處理24 h，取50頭于-20 ℃下凍3 min，于無菌水中清洗1 min，再放于75%乙醇消毒3 min，最后放于無菌水中清洗，用鑷子從蟲體尾部取出腸道，放于1.5 mL離心管中，加少量生理鹽水，勻漿，補充水量至1 mL。將上述制備好的懸浮液，分別稀釋到10-5、10-6和10-7梯度，然后用移液槍移取100 μL菌懸浮液涂于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(黃秀梨和辛明秀，2008)，30℃培養(yǎng)24-48 h后，根據(jù)菌落形態(tài)，挑取形態(tài)各異的單菌落到新培養(yǎng)基上劃線純化2-3次，斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后于4℃保存。

采用革蘭氏染色法對細(xì)菌進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)及其革蘭氏陰陽性。

1.4 細(xì)菌分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

采用凍溶法提取細(xì)菌DNA(馮廣達(dá)等，2013)，具體操作如下，將菌株分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，然后放置于30 ℃、150 r/min的搖床(上海知楚儀器有限公司，ZQLY-180F)，振蕩培養(yǎng)48 h。每個菌株分別取2 mL菌液于離心管中，12000 r/min 離心2 min，棄上清液。在上述沉淀中加入500 μL無菌蒸餾水，渦旋1 min，使其菌體完全懸浮于水中。置于液氮冰凍10 min，沸水中水浴 5min，12000 r/min離心2 min，上清液即可作為PCR模板備用。

運用細(xì)菌通用引物27 f和1492 r 擴(kuò)增16S rRNA基因，反應(yīng)體系為25 μL：引物各1 μL，模板 DNA 1 μL，PCR mi×12.5 μL，dd H2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃熱變性5 min；94 ℃變性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸2 min，32個循環(huán)，72℃延伸10 min。取3 μL PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測。鑒定好的PCR產(chǎn)物送昆明碩擎生物技術(shù)有限公司測序。

運用Contigexpress軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接，將拼接好的16S rDNA序列，提交到NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查找相似性最高的典型菌株并下載序列，運用MEGA 6.06 軟件，采用國際通用的鄰接法(Neighbour-Joining)和Kimura雙參數(shù)矯正模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。以重復(fù)抽樣1000次進(jìn)行Bootstrap 驗證，分析評估系統(tǒng)進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

1.5 可培養(yǎng)菌株對大分子物質(zhì)的降解能力的測定

采用透明圈法測定可培養(yǎng)細(xì)菌對淀粉、果膠、纖維素、木聚糖4種大分子物質(zhì)的降解能力。淀粉降解能力測定，具體參照黃秀梨和辛明秀(2008)的方法；纖維素降解能力，果膠降解能力和木聚糖降解能力參照夏曉峰(2014)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離及形態(tài)結(jié)果

本試驗從馬鈴薯塊莖蛾4齡幼蟲腸道中(包括前腸，中腸和后腸)，分離得到菌落形態(tài)各異的14個菌株。其菌落形態(tài)有圓形，有規(guī)則性，有不規(guī)則性，顏色有淡黃色，乳白色，半透明透明，其菌落具體形態(tài)詳見表1。通過革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)陽性菌11株，3株為革蘭氏陰性。菌株細(xì)胞形態(tài)為6株球形，8株桿狀。

表1 馬鈴薯塊莖蛾4齡幼蟲腸道細(xì)菌的菌落形態(tài)及培養(yǎng)性狀Table 1 Colonial morphology and cultural characteristics of bacteria from gut of the 4th instar larvae of Phthorimaea operculella(Zeller)

2.2 細(xì)菌分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

通過16S rDNA序列比對，發(fā)現(xiàn)在分離培養(yǎng)的14株細(xì)菌中，分別屬于4門7科8屬10種，其中有6株菌株分別屬于變形菌門Proteobacteria莫拉氏菌科Moraxellaceae的不動桿菌屬Acinetobacter、黃單胞菌科Xanthomonadaceae的寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas、腸桿菌科Enterobacteriaceae的克雷伯氏桿菌屬Klebsiella和Morganellaceae科的變形桿菌屬Proteus；4株菌株屬于厚壁菌門Firmicutes葡萄球菌科Staphylococcaceae的葡萄球菌屬Staphylococcus；1株屬于Bacteroidetes擬桿菌門的鞘脂桿菌科Sphingobacteriaceae的鞘氨醇桿菌屬Sphingobacterium；3株屬于放線菌門微球菌科Micrococcaceae的Glutamicibacter菌屬和束村氏菌科Tsukamurellaceae的束村氏菌屬Tsukamurella。

表2 分離菌株與數(shù)據(jù)庫典型菌株的比對結(jié)果Table 2 The results of bacteria strains from the 4th instar larvae gut of Phthorimaea operculella(Zeller)between the database of typical strains

在種水平上，菌株HZD10、LZN8、LZN14與瓊氏不動桿菌(Acinetobacterjunii strain ATCC 17908)的相似性為99%。菌株HZN10、LZN6與松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuristrain DSM 20345)的相似性分別為99%和98%。菌株LZN2、LZN10與腐生葡萄球菌(StaphylococcussaprophyticusstrainRGN1.1)相似性為99%。菌株HZN8與普通變形桿菌(Proteusvulgarisstrain ATCC 29905)的相似性為99%。菌株HZN9與煙草節(jié)桿菌(Arthrobacternicotianaestrain DSM 20123)的相似性為99%。LZN13與阿氏節(jié)桿菌(Arthrobacterarilaitensis)RE117相似性為100%。菌株LZD10與Sphingobacteriumginsenosidimutansstrain THG 07的相似性為99%。菌株LZD5與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophiliastrain ATCC 13637)的相似性為99%。菌株LZD6與耐酪氨酸冢村氏菌(Tsukamurellatyrosinosolvensstrain DSM 44234)的相似性為100%。LZN7與產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytocastrain JCM1665)的相似性為99%。

從系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)可以看出，系統(tǒng)樹分為3大支6小支。其中一大支由變形菌門的菌株組成，隸屬腸桿菌目的變形桿菌屬的菌株HZN8與其他已公布的變形桿菌屬的菌株首先聚為一支，后與克雷伯氏桿菌屬的菌LZN7聚為一小支，說明兩者之間親緣關(guān)系較近。不動桿菌屬的菌株LZN8、HZD10和 LZN14與不動桿菌屬的已知的其他菌株單獨聚為一小支。寡養(yǎng)單胞菌屬的菌株LZD5與寡養(yǎng)單胞菌屬的已知的其他菌株也單獨聚為一小支，這三小分支構(gòu)成了變形菌門這一大支；在系統(tǒng)樹中的另一大支由厚壁菌門和放線菌門的菌株組成，首先厚壁菌門葡萄球菌屬的菌株HZN10、LZN6與已公布的松鼠葡萄球菌菌株具為一小支，然而與LZN2、LZN10以及腐生葡萄球菌其他已公布的菌株聚為一支，再與放線菌門Glutamicibacter菌屬的菌株HZN9和LZN13以及束村氏菌屬的菌株LZD6聚為一大支；而擬桿菌門鞘氨醇桿菌屬的菌株LZD10與鞘氨醇桿菌屬的其他已公布的菌株單獨聚為一大支。

2.3 對大分子物質(zhì)的降解作用結(jié)果

采用透明圈法測定分離至馬鈴薯塊莖蛾腸道內(nèi)的不動桿菌屬、葡萄球菌屬、腸桿菌屬、節(jié)細(xì)菌屬、鞘氨醇桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、束村氏菌屬和克雷白氏桿菌屬菌株對淀粉、纖維素、木聚糖和果膠的降解作用，結(jié)果表明，只有鞘氨醇桿菌屬菌株LZD10、阿氏節(jié)桿菌屬菌株LZN13、煙草節(jié)桿菌屬菌株HZN9對淀粉具有明顯的降解作用，但對纖維素、木聚糖和果膠無明顯的降解作用，其余菌株對4種大分子物質(zhì)均無降解作用。

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，從馬鈴薯塊莖蛾腸道分離得到的14個菌株分別屬于變形菌門Proteobacteria、厚壁菌門Firmicutes、擬桿菌門Bacteroidetes和放線菌門Actinobacteria，其中6株屬于變形菌門，4株屬于厚壁菌門，表明變形菌門Proteobacteria和厚壁菌門Firmicutes是馬鈴薯塊莖蛾腸道細(xì)菌的優(yōu)勢門。該結(jié)果與其他昆蟲腸道細(xì)菌優(yōu)勢類群結(jié)果相似(Colmanetal.，2012；Yunetal.，2014)。因此，變形菌門Proteobacteria和厚壁菌門Firmicutes可能是昆蟲長期協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果。此外，Sevim等(2015)將馬鈴薯塊莖蛾整頭幼蟲研磨制備成菌懸浮液，運用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分離得到7屬8個菌株分別是芽孢桿菌屬Bacillussp.、松鼠葡萄球菌Staphylococcussciuri、蒙氏腸球菌Enterococcusmundtii、酪黃腸球菌E.casseliflavus、糞產(chǎn)堿桿菌Alcaligenesfaecalis、腸桿菌屬Enterobactersp.、成團(tuán)泛菌Pantoeaagglomerans和熒光假單胞菌Pseudomonasfluorescens。而本研究分離到8屬10個種的菌株，在屬水平上，腸桿菌屬和葡萄球菌屬與Sevim的分離結(jié)果相同，而其他菌株則均不相同。造成這種差異可能與馬鈴薯塊莖蛾蟲源，分離所用的組織部位和所用培養(yǎng)基不一樣所致。在種水平上，僅葡萄球菌屬的松鼠葡萄球菌與Sevim等人分離結(jié)果相同，Leroy等人(2011)研究發(fā)現(xiàn)，從豌豆長管蚜蜜露中分離到的松鼠葡萄球菌能分泌化學(xué)信息素，吸引昆蟲天敵。但對于馬鈴薯塊莖蛾腸道中含有的松鼠葡萄球菌，是否具有吸引天敵的作用，值得進(jìn)一步研究和探索。

不同種類昆蟲體內(nèi)細(xì)菌，其具有不同的生理功能，如葡萄球菌屬能產(chǎn)生化學(xué)信息素吸引昆蟲天敵、調(diào)控昆蟲的免疫信號通路(Douglas，2015)；不動桿菌屬的菌株具有氮素轉(zhuǎn)化功能(Nalcacietal.，2011)；腸桿菌屬Enterobacter能介導(dǎo)昆蟲對B.thuringiensis的敏感性(Brodericketal.，2006)和幫助昆蟲降解碳水化合物(Potrikus and Breznak， 1977；Anandetal.，2010；Xiaetal.，2013)；克雷白氏桿菌屬Klebsiella的菌能產(chǎn)生昆蟲聚集信息素(Engel and Moran，2013)；寡養(yǎng)單胞菌能產(chǎn)生淀粉酶(羅立華等，2016)；而對于馬鈴薯塊莖蛾腸道中的這些細(xì)菌是否同樣具有這些生理功能，還有待得進(jìn)一步研究。尤其是對于束村氏菌屬、鞘氨醇桿菌屬和節(jié)桿菌屬細(xì)菌，其對昆蟲的生理功能還不見報道，而本研究發(fā)現(xiàn)這三個屬細(xì)菌存在于馬鈴薯塊莖蛾腸道中，因此對于這三個屬細(xì)菌對馬鈴薯塊莖蛾的生理功能亦值得進(jìn)一步探索。

圖1 基于16S rDNA的序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

本研究發(fā)現(xiàn)，從馬鈴薯塊莖蛾腸道中分離獲得的鞘氨醇桿菌屬菌LZD10、煙草節(jié)桿菌屬菌株HZN9和阿氏節(jié)桿菌菌屬菌株LZN13具有降解淀粉的功能，該降解淀粉的功能還未在昆蟲腸道微生物中有報道還未見報道。因此，鞘氨醇桿菌屬、煙草節(jié)桿菌屬和阿氏節(jié)桿菌菌屬可能是馬鈴薯塊莖蛾為適應(yīng)高淀粉食物而形成的特有菌屬，也是馬鈴薯塊莖蛾在高含量淀粉馬鈴薯塊莖上生長發(fā)育和繁殖能力較好的重要原因。

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Isolation and identification of bacteria from larval gut of the potato tuberworm,Phthorimaeaoperculella(Zeller) and the degradation for plant-based macromolecular compounds

ZHENG Ya-Qiang1, DU Guang-Zu1, LI Yi-Fei1, CHEN Bin1, LI Zheng-Yue1, XIAO Guang-Li2*

(1.College of Plant Protection, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2.College of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201,China)

In order to study the cultural bacteria community structure in the larval gut of potato tuber moth, and its relationship with the feeding characteristics.The bacteria in the 4thinstar larve gut of the potato tuber moth was isolated on the beef peptone medium, bacteria were identified using the 16S rDNA sequence, the biodegradation activity for plant based macromolecular compounds including amylum, fibre, xylan and pectin was evaluated using the enzyme assay culture techniques.The results showed that ten species of bacteria belonging to seven genera were isolated form the gut of the 4thinstar larvae ofPhthorimaeaoperculella(Zeller), those bacteria wereAcinetobacte,Staphylococcus,Enterobacter,Arthrobacter,Sphingobacterium,Klebsiella,TsukamurellaandStenotrophomonas.TheSphingobacteriumstrain LZD10,Staphylococcusstrain LZN13 andArthrobacterstrain HZN9 can degrading the amylum, but the macromolecular of cellulose, xylan and pectin can’t be degraded by those gut bacteria.Other 7 strains can’t degrade the amylum, fibre, xylan and pectin.The study showed that there were the amylum degrading bacteria in the 4thinstar larval gut of the potato tuber moth, this study will provide a theoretical base for the further study on feeding potato tuber feeing mechanisms of potato tuber moth.

Phthorimaeaoperculella(Zeller); gut bacteria; degradation effect

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云南省教育廳科學(xué)研究基金重大專項(ZD2015006); 云南省政府特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)專項 (云財農(nóng)[2013]364號)；國家自然科學(xué)基金項目(31660537)；云南省煙草公司科技計劃項目(2015YN24)資助；2015年地方高校國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201510676008)

鄭亞強，男，1987年生，貴州遵義人，博士研究生，研究方向為昆蟲腸道微生物多樣性及其功能，E-mail：736364746@qq.com

*通訊作者Author for correspondence： E-mail: chbins@163.com；E-mail: glxiao9@163.com

Received: 2017-01-05; 接受日期Accepted: 2017-05-08

Q968.1

A

1674-0858(2017)03-0525-08