陳亞青，夏 亭，鄭思春，馮啟理，劉 琳

斜紋夜蛾視黃酸結(jié)合蛋白(Slcrabp)基因的克隆、表達及功能

陳亞青*，夏 亭*，鄭思春，馮啟理，劉 琳**

(廣州市昆蟲發(fā)育調(diào)控與應(yīng)用重點實驗室，昆蟲科學與技術(shù)研究所，華南師范大學生命科學學院，廣州 510631)

視黃酸結(jié)合蛋白(Cellular retinoic acid binding protein, CRABP)屬于胞內(nèi)脂質(zhì)結(jié)合蛋白超基因家族，參與了許多生理活動，如細胞分化、組織重建和信號轉(zhuǎn)導等，但其在昆蟲中腸的作用尚不明確。研究從斜紋夜蛾Spodopteralitura中腸基因表達序列標簽(EST)文庫中克隆獲得一個編碼Slcrabp的全長cDNA，該cDNA由396個核苷酸組成，編碼132個氨基酸。預測CRABP蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與脂肪酸結(jié)合蛋白非常相似，含一個由10個反平行的β折疊和2個α螺旋形成的配體結(jié)合中心結(jié)構(gòu)域。SlCRABP基因具有4個外顯子，與脊椎動物crabp基因類似。RT-PCR檢測表明，在轉(zhuǎn)錄水平上，Slcrabp在6齡幼蟲中腸的各個時期均有較高表達。Western blot分析結(jié)果顯示，SlCRABP蛋白分布廣泛，在中腸、脂肪體、精巢等組織上大量表達。在中腸，其表達峰值出現(xiàn)在預蛹期。利用熒光標記物質(zhì)8-苯胺基-1-萘磺酸(1,8-ANS)分析了重組SlCRABP蛋白與不同底物的親和力，發(fā)現(xiàn)SlCRABP與不飽和長鏈脂肪酸有較高結(jié)合活性，如花生四烯酸鈉、亞麻酸、油酸鈉和油酸，但與視黃酸、視黃醇的結(jié)合力卻很弱或幾乎不結(jié)合，暗示斜紋夜蛾SlCRABP功能與同家族脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)性質(zhì)相似。對6齡幼蟲進行饑餓處理，結(jié)果顯示經(jīng)過經(jīng)24 h和48 h饑餓處理后，蟲體中腸SlCRABP蛋白質(zhì)的表達量有顯著上升，暗示SlCRABP可能參與了斜紋夜蛾體內(nèi)脂類的轉(zhuǎn)運過程。

視黃酸結(jié)合蛋白；中腸；脂肪酸；視黃酸；斜紋夜蛾

胞內(nèi)脂類結(jié)合蛋白(intracellular lipid binding proteins, iLBPs)是一類超基因家族的低分子量的蛋白質(zhì)(14-16 kDa)，分布廣泛(Bernlohretal., 1997)。這個家族主要包括視黃酸結(jié)合蛋白(Cellular retinoic acid binding protein, CRABP)、脂肪酸結(jié)合蛋白(Fatty acid binding protein, FABP)和視黃醇結(jié)合蛋白(Cellular retinol binding protein, CRBP)三大類(Schaapetal., 2002; Follietal., 2005)。這些結(jié)合蛋白能夠按1∶1的比例與疏水性底物結(jié)合(Bernlohretal., 1997)。iLBPs家族成員之間氨基酸序列相似性為20%-70%(Simpsonetal., 1999)，它們由共同的祖先基因進化而來，從無脊椎動物向脊椎動物進化(Donovanetal., 1995)。

iLBPs作為細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白，廣泛存在于哺乳動物的各種組織，而且在鳥、魚類等脊椎動物的脂類代謝組織中亦有發(fā)現(xiàn)，同時也存在于無脊椎動物中。1980年，首次從沙漠蝗(Schistocerca gregaria)的飛翔肌中分離得到了第一個無脊椎動物的iLBP：SgMFABP(Haunerland and Chisholm, 1990)。隨后在其他無脊椎動物的組織中也相繼發(fā)現(xiàn)了iLBP，例如：煙草天蛾、線蟲、扁形動物等(Esteves and Ehrlich, 2006)。

在哺乳動物中，不同類型的iLBPs基因結(jié)構(gòu)相似，均由3個內(nèi)含子和4個外顯子組成，內(nèi)含子插入的位置相對保守，但是內(nèi)含子大小相差較大(Hohoff and Spener, 1998)。與哺乳動物相比，無脊椎動物iLBPs的基因結(jié)構(gòu)變化較大，一般含有2-4個外顯子，0-4個內(nèi)含子。例如沙漠蝗M-FABP基因由3個外顯子組成(Wuetal., 2001)，細粒棘球絳蟲EgFABP1、EgFABP2分別含有2個外顯子和1個內(nèi)含子(Esteves and Ehrlich, 2006)。除了SlFABP2沒有內(nèi)含子外，其他斜紋夜蛾SlFABPs均由有4個外顯子和3個內(nèi)含子組成(Huangetal., 2010)。

在生物體內(nèi)，iLBPs是細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運疏水性配體最重要的一種蛋白質(zhì)，可以將不同類型的底物運輸?shù)较鄳?yīng)的細胞器中發(fā)揮作用。不同類型的iLBPs家族成員結(jié)合底物的特性不同。脊椎動物CRABPs能與納摩爾級的視黃酸結(jié)合(Dongetal., 1999)，CRABPs與視黃醇、視黃醛有非常高的親和力(Levinetal., 1988; Noeyetal., 1988)，而FABPs結(jié)合底物的種類則相對廣泛，與不同底物結(jié)合的親和性差異較大。此外，iLBPs也可以作為信號分子，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(Schaapetal., 2002)。如CRABP-II，K-FABP和A-FABP能夠分別結(jié)合到相應(yīng)的核受體RARα，PPARβ/δ和PPARγ，激活靶基因，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。由于iLBPs成員屬于同一個超基因家族，它們之間與底物結(jié)合和調(diào)控功能會有重疊，如CRABP-II能夠結(jié)合和轉(zhuǎn)運RA和RAR；在一定條件下FABP5也能將RA或RAR運輸?shù)絇PARβ/δ受體上。結(jié)合底物和受體取決于CRABP-II/FABP5比例，當比值高時，RA調(diào)節(jié)PPARβ/δ受體的代謝途徑；比值低時，RAR被上調(diào)表達，激活相關(guān)基因表達，介導細胞凋亡(Schugetal., 2002)。

視黃酸結(jié)合蛋白是一種低分子量的胞內(nèi)蛋白質(zhì)，分子量約15-16 kDa，含有134-136個氨基酸，屬胞內(nèi)脂類結(jié)合蛋白超基因家族。1985年首次報道了牛CRABP完整的氨基酸序列(Sundelinetal., 1985)。后來研究發(fā)現(xiàn)，脊椎動物細胞中存在兩種不同類型的CRABPs：CRABP I和CRABPII(Wangetal., 1997; Weietal., 1997)。它們的表達模式各不相同，分布具有一定的特異性。在胚胎期，兩種蛋白質(zhì)均廣泛存在，通常它們不在同一細胞中表達。在成體組織中，CRABPII在皮膚﹑子宮﹑卵巢和脈絡(luò)膜中表達，CRABP I的分布相對更加廣泛，幾乎存在于所有的組織。脊椎動物CRABP I和CRABP II通過兩種不同的方式參與視黃酸的代謝。CRABPII能夠轉(zhuǎn)運RA進入細胞核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到靶基因的啟動子區(qū)，激活基因的轉(zhuǎn)錄表達，但CRABPI卻把RRA轉(zhuǎn)運至細胞核，它主要通過提高RA代謝酶(CYP26A1)的產(chǎn)生，協(xié)助RA在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被細胞色素P450酶系降解，防止過量的RA對機體組織造成損傷，負向調(diào)節(jié)RA的活性(Niles, 2004)。無脊椎動物CRABP的研究比脊椎動物起步晚，在無脊椎動物細胞中只存在一種視黃酸結(jié)合蛋白(Goodman, 1981)。1998年Mansfield等首次克隆得到了煙草天蛾CRABP完整的cDNA序列，通過序列的分析和空間結(jié)構(gòu)的預測，認為無脊椎動物體內(nèi)存在可與RA結(jié)合的蛋白；但是Folli否定了這個結(jié)論，他發(fā)現(xiàn)煙草天蛾CRABP并不能結(jié)合RA(Follietal., 2005)，因此，對無脊椎動物CRABP是否結(jié)合RA以及其生理功能到目前為止尚有爭議。

斜紋夜蛾Spodopteralitura是雜食暴發(fā)性食葉害蟲，是全球熱帶和亞熱帶的主要農(nóng)業(yè)害蟲之一，目前以使用化學農(nóng)藥為主的防治措施，已使斜紋夜蛾普遍產(chǎn)生了抗藥性(周曉梅和黃炳球，2002)，因此新型專一殺蟲劑的開發(fā)已勢在必行。中腸是昆蟲對藥物吸收的主要部位，是研究殺蟲劑分子機理、開發(fā)新型生物殺蟲劑的重要靶標。視黃酸結(jié)合蛋白在脊椎動物中主要參與細胞內(nèi)視黃酸的轉(zhuǎn)運、代謝，維持胞內(nèi)視黃酸的穩(wěn)態(tài)平衡，但目前昆蟲對CRABP方面的研究相對較少，缺乏生物學功能的具體研究，對于無脊椎動物CRABP是否具有視黃酸結(jié)合蛋白活性尚未有定論。通過對本實驗室EST文庫分析發(fā)現(xiàn)，視黃酸結(jié)合蛋白在6齡第6天預蛹期(L6D6)的幼蟲中腸中的表達水平高于6齡蛻皮時期(L6D0)和6齡第3天(L6D3)。我們推測視黃酸結(jié)合蛋白在斜紋夜蛾中腸中起著非常重要的作用，尤其是在預蛹期。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試昆蟲

所用的斜紋夜蛾S.litura幼蟲來自中山大學有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，用人工飼料培養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度27±1℃，光周期12 h∶12 h(光∶暗)，相對濕度65%-75%(Huangetal., 2011)。

1.1.2 菌株與載體

所用的大腸桿菌DH5α(E.coliDH5α)、BL21(E.coliBL21)是實驗室保存的菌種。蛋白表達載體pET-28a和pBluescript? II SK (+)及克隆載體pMD18-T DNA購自TAKARA公司。

1.1.3 主要的試劑和試劑盒

Taq酶、dNTP、T4DNA連接酶、DNA限制性內(nèi)切酶、dNTP、低分子量標準蛋白Marker、RT-PCR試劑盒均購自TAKARA公司。質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和DNA Marker(1 kb ladder)購自天根生化科技(北京)有限公司。羊抗兔IgG-SABC-FITC(Strept Avidin-Biotin Complex-fluorescein isothiocyanate)、NBT、BCIP和預染蛋白Marker均購自廣州斯佳生物科技有限公司。蛋白純化試劑盒His Bind Kit購自德國Novagen公司。不同類型脂肪酸、視黃醇和視黃酸購自美國Sigma公司。1,8-ANS購自美國Fluka公司。Western blot中的硝酸纖維素膜購自瑞典Amersham Biosciences HybondTM-C Extra公司。實驗所用其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.4 主要分子生物學軟件

引物設(shè)計采用Primer premier 5.0(PREMIER Biosoft International, 美國)軟件；實驗數(shù)據(jù)分析做圖采用GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software Inc., 美國)；序列組裝和序列比對采用DNAStar(DNASTAR, Inc., 美國)內(nèi)相關(guān)軟件。

1.2 實驗方法

1.2.1Slcrabp基因的克隆

根據(jù)實驗室EST文庫中已有的Slcrabp基因序列，設(shè)計特異性引物(表1)，以斜紋夜蛾6齡中腸cDNA為模板，進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系參考TAKARA Taq酶試劑盒說明書，10 μL的反應(yīng)總體系包括2 μM的上下游引物，0.5 mM dNTP，0.5U Tag酶。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2SlCRABP重組蛋白的表達

構(gòu)建SlCRABP表達載體pET-28a-Slcrabp，經(jīng)PCR、酶切及測序檢測是否正確構(gòu)建。用pET-28a-Slcrabp轉(zhuǎn)化DH5ɑ后，將重組菌種接種到10 mL含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 220 rpm，培養(yǎng)過夜。將活化的重組菌種以1∶100的比例接種到新的含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 rpm培養(yǎng)2 h，至OD600=0.4-0.6時，加入終濃度為0.6 mM的IPTG，在同樣的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4℃，5000 rpm離心3 min棄除上清，收集菌體，對其進行可溶性表達分析以及重組蛋白純化。

為了確定獲得的重組蛋白是否以可溶的形式存在，收集經(jīng)IPTG誘導的菌體后，加入PBS緩沖液，混勻。用超聲波破碎儀在冰上進行超聲波破碎細胞直至溶液變清。12000 g離心10 min，分別收集上清和沉淀。通過12% SDS-PAGE檢測目的蛋白在上清液和沉淀中的分布。獲得的重組蛋白用于體外結(jié)合實驗和抗體制備。

1.2.3 斜紋夜蛾總RNA的提取和RT-PCR

分離斜紋夜蛾各組織材料，具體操作參照TRI Reagent總RNA抽提試劑盒(TaKaRa)的說明書及前期優(yōu)化的提取條件提取總RNA(Huangetal., 2011)。將RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體操作參考Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(TaKaRa)說明書及前期優(yōu)化的提取條件(在10 μL反轉(zhuǎn)錄的終反應(yīng)體系里，包括2 μg總RNA，50 μM Oligo(dT)18Primer，dNTP Mixture各5 mM，RNase Inhibitor 10 U，RNase M-MLV(RNase H-)90U。將反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA用ddH2O稀釋至100 μL。取3 μL cDNA為模板，actin基因為內(nèi)參，進行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件同前。

1.2.4 組織蛋白的提取和檢測

將斜紋夜蛾置于冰上約5 min，使其休克。在裝有PBS的蠟盤里進行解剖，分別提取斜紋夜蛾的中腸、精巢、表皮和脂肪體等組織。按照2.5 mL/g的比例，在樣品中加入適量的蛋白抽提緩沖液(50 mM Tris, 10 mM EDTA, 15%甘油，pH 7.8)，在冰上用研磨棒充分研磨，4℃，12000 g離心15 min，取上清置于新的1.5 ml離心管中，重復上述操作，直到提取的蛋白樣品沒有沉淀，置于-80℃保存?zhèn)溆谩５鞍讟悠焚|(zhì)量檢測：向待檢測的樣品中加入等體積的2×Protein Loading(100 mM Tris-HCl，2% β-巰基乙醇，4% SDS，0.2%溴酚藍，20%甘油，pH 6.8)，混合均勻后，在沸水中加熱5 min，使蛋白變性，接著在冰上放置3 min。然后按常規(guī)的方法進行電泳分析。

1.2.5 Western blot分析

SDS-PAGE電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，按前期優(yōu)化的方法進行western blot(Huangetal., 2011)。按1∶2000加SlCRABP抗體；1∶10000加堿性磷酸酶標記的羊抗兔第二抗體。經(jīng)洗滌，最后加生色底物四氮唑藍(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)的混合物，于室溫平緩搖動進行顯色反應(yīng)。

1.2.6SlCRABP重組蛋白的結(jié)合取代實驗

1.2.6.1 SlCRABP重組蛋白的純化

重組蛋白的純化參照Novagen公司的His Bind Kit說明書。在resin柱中(PD-10, GE, 美國)，依次用無菌水、1×Charge buffer、1×Binding buffer平衡柱子。將在1.2.2中收集的上清液沿柱壁緩慢加入柱中，控制流速3-4滴/min。依次按要求用1×Binding buffer，1×Washing buffer沖洗柱子，最后用1×Elute buffer洗脫蛋白。收集的蛋白用12% SDS-PAGE檢測蛋白純度。

1.2.6.2 蛋白的濃縮

根據(jù)蛋白大小，選擇相應(yīng)孔徑大小的超濾管(Millipore，美國)，將收集的蛋白加到超濾管中，4000 rpm，4℃離心20-30 min；更換2-3次緩沖液，加所需緩沖液至原始體積，4000 rpm，4℃離心20-30 min；通過控制離心時間，離心至所需體積及濃度，收集濃縮后蛋白。

1.2.6.3SlCRABP重組蛋白脫脂

由于SlCRABP蛋白能夠結(jié)合一些游離的疏水性底物，利用原核表達系統(tǒng)表達的重組蛋白SlCRABP可能會結(jié)合細菌體內(nèi)的一些疏水性配基，可能會影響后續(xù)的結(jié)合實驗。因此我們通過萃取反應(yīng)對SlCRABP重組蛋白進行脫脂處理，除去SlCRABP重組蛋白本底結(jié)合的底物，具體的實驗操作參考Folli(2005)的方法：加2倍蛋白體積的乙醚到蛋白液中，充分混勻，冰上放置20 min；去除上層乙醚相，加1.5倍蛋白體積的乙醚到蛋白液中，充分混勻，冰上放置20 min；去除上層乙醚相，真空干燥去除剩余乙醚。

1.2.6.4 SlCRABP重組蛋白摩爾濃度的測定

由比爾-朗伯定律(Beer-Lambert law)公式：A=εlC，可以得出：C=A/εl，其中：C表示蛋白的摩爾濃度(M)，A表示蛋白在280 nm處的吸光值，ε表示蛋白的摩爾消光系數(shù)(M-1.cm-1)，l表示光路長度(cm)。ε的值與蛋白中色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)的含量有關(guān)；ε的值近似等于蛋白中這三種氨基酸在280 nm處吸光值的總和，可以表示為：ε(280)=(aW×5500)+(bY×1490)+(cC×125)，a、b、c表示氨基酸在蛋白中的數(shù)量。

如果知道一種蛋白的氨基酸組成，就可以計算出它的W、Y、C的含量，預測它的ε(280)的值；用分光光度計檢測其在280 nm處的吸光值A(chǔ)；已知l值，根據(jù)公式：C=A/εl，計算出蛋白的摩爾濃度C。

1.2.6.5 SlCRABP重組蛋白與底物的結(jié)合取代反應(yīng)

熒光染料1,8-ANS(8-anilion-1-naphtalenesulfonic acid amm)(Fluka，美國)本身只有很微弱的熒光，可以忽略不計。但當與CRABPs結(jié)合形成復合物后，在藍光的激發(fā)下可以產(chǎn)生強烈的熒光。因此，首先固定SlCRABP蛋白濃度，SlCRABP與1,8-ANS充分結(jié)合形成復合物后，復合物的熒光強度與1,8-ANS濃度有關(guān)，故首先檢測了熒光強度隨1,8-ANS濃度變化的發(fā)射光譜，獲得最佳1,8-ANS濃度。在此基礎(chǔ)上，再加入不同種類的底物進行競爭結(jié)合，通過檢測加入不同底物前后熒光強度的變化量，推斷出SlCRABP與不同種類底物的親和力大小，實驗流程如下：1)結(jié)合熒光檢測：定量的SlCRABP與不同濃度梯度的1,8-ANS，在室溫黑暗條件下，反應(yīng)3 min，檢測反應(yīng)物的熒光強度變化，分析整理數(shù)據(jù)，確定達到飽和時1,8-ANS的濃度；2)競爭結(jié)合熒光檢測：根據(jù)結(jié)合反應(yīng)實驗結(jié)果，采用合適的SlCRABP與1,8-ANS反應(yīng)條件，首先在黑暗室溫條件下，反應(yīng)3 min，再加入濃度梯度的底物，競爭反應(yīng)3 min，檢測反應(yīng)的熒光強度變化情況，從而確定SlCRABP與不同底物的親和力大小。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用凝膠成像系統(tǒng)對Western blot結(jié)果拍照，用Image Quant TL v2005(Amersham Inc., 美國)分析條帶相對亮度值，然后用數(shù)值制作成柱狀圖。所有數(shù)值用mean±SEM表示，顯著性分析使用一元方差分析(One-way ANOVA)法，采用Tukey檢驗進行多個樣本間的多重比較，P<0.01表示存在統(tǒng)計學上的極顯著差異。所有實驗重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的克隆及序列分析

2.1.1 斜紋夜蛾中腸EST文庫Slcrabp基因分析

對實驗室的斜紋夜蛾中腸EST文庫分析發(fā)現(xiàn)，在6齡蛻皮期(L6D0)、進食期(L6D3)和預蛹期(L6D6)三個時期的中腸共有10個SlcrabpcDNA克隆，其中在預蛹期(L6D6)克隆數(shù)最多。通過對所有的克隆進行組裝拼接，獲得了1個全長SlcrabpcDNA序列。SlcrabpcDNA的克隆數(shù)在三個不同時期EST文庫中的分布如表2。

表2 斜紋夜蛾中腸EST文庫Slcrabp克隆數(shù)統(tǒng)計Table 2 Clones of Slcrabp in EST library of Spodoptera litura midgut

在斜紋夜蛾基因組數(shù)據(jù)庫，通過檢查基因注釋及CRABP同源序列比對，發(fā)現(xiàn)SWUSl10005904序列編碼斜紋夜蛾的CRABP。該基因的結(jié)構(gòu)包括了4個外顯子及3個內(nèi)含子(圖1)。

圖1 斜紋夜蛾的視黃酸結(jié)合蛋白(SlCRABP) 基因結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Diagram of the gene structure of SlCRABP

2.1.2SlCRABPcDNA序列分析

SlCRABP全長的cDNA由595個核苷酸組成，具有一個完整的開放閱讀框(ORF)，ORF由396個核苷酸組成，編碼一個由132個氨基酸組成的蛋白，預測分子量為14.8 kDa，等電點(pI)是6.67(圖2)。通過對序列分析發(fā)現(xiàn)，SlCRABP含有三個關(guān)鍵氨基酸，分別是Asp73，Lys79，Asp99(圖2)。這三個氨基酸被認為是底物結(jié)合的關(guān)鍵位點，決定了底物的特異性(Wangetal., 2007)。

圖2 Slcrabp cDNA核苷酸及其編碼的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of Slcrabp cDNA起始密碼子(ATG)用加下橫線標出，終止密碼子(TAA)用星號標出，方框表示三個關(guān)鍵氨基酸，左邊的數(shù)字是cDNA的核苷酸數(shù)，右邊的數(shù)字是編碼的氨基酸數(shù)

2.2SlCRABP重組蛋白的表達及抗體檢測

2.2.1SlCRABP重組蛋白的表達與純化

體外誘導pET-28a-Slcrabp重組細菌，采用15% SDS-PAGE蛋白膠檢測目的蛋白的表達。從SDS-PAGE(圖3)上可以看出，在濃度為0.6 mM的IPTG誘導4 h后，重組蛋白在大腸桿菌中表達。SlCRABP蛋白的理論分子量是14.8 kDa，加上表達載體pET-28a攜帶的6X His標簽蛋白，重組蛋白的表觀分子量大小約31.6 kDa。這個分子量與預期分子量大小相同。超聲波破碎細菌后，分別收集沉淀和上清液分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要以包涵體形式存在。利用目的蛋白N端帶有的6X His標簽，使用His-tag柱子對SlCRABP重組蛋白進行分離純化。目的蛋白SlCRABP能夠被純化出來，并且純化得到的蛋白條帶較單一，可以用于下一步制備多克隆抗體(圖3)。

圖3 15% SDS-PAGE分析SlCRABP重組蛋白Fig.3 Analysis of SlCRABP recombinant protein by 15% SDS-PAGEM：低分子量蛋白；1：誘導前菌液；2：誘導4 h后菌液；3：誘導4 h后經(jīng)超聲波處理的上清液；4：誘導4 h后經(jīng)超聲波處理的沉淀；5：純化的SlCRABP蛋白。M:Marker;1:Bacteria before inducation;2:Bacteria after 4 h inducation;3:Supernatant of induced bacteria;4:Precipitation of induced bacteria;5:Purified SlCRABP protein.

2.2.2SlCRABP重組蛋白抗體的制備與檢測

用上述重組蛋白免疫新西蘭大白兔，三次免疫后，抽取免疫兔子血液，經(jīng)離心分離獲得多克隆抗血清。將制備好的血清儲存于-80℃?zhèn)溆?。利用Western blot檢測制備的SlCRABP多克隆抗體的免疫性與專一性。結(jié)果表明，重組菌總蛋白和純化蛋白，以及中腸組織樣品中均出現(xiàn)特異條帶，而對照的空載體蛋白樣品卻沒有出現(xiàn)特異條帶(圖4)，蛋白條帶的大小與目的蛋白的分子量相符合，表明所制備的抗體的免疫性和專一性較好，可以用于進一步的研究。

圖4 Western blot分析重組蛋白多克隆抗體專一性Fig.4 Western blot analysis of specificity of the anti-SlCRABP antibody1：陰性對照樣品；2：重組菌體總蛋白樣品；3：純化蛋白樣品；4：斜紋夜蛾中腸粗蛋白樣。1:Negative sample;2:Total protein from recombinant bacteria;3:Purified SlCRABP protein;4:Total protein from midgut of cutworm.

2.3Slcrabp基因的時空表達分析

2.3.1SlcrabpmRNA表達分析

用RT-PCR(Reverse transcription PCR)的方法分析Slcrabp基因在不同組織和中腸不同時期的表達情況。分離斜紋夜蛾幼蟲包括中腸(MG midgut)、表皮(EP epidermis)、脂肪體(FB fat body)和精巢(TE testis)等不同組織，提取總RNA；同時提取中腸不同時期(6齡1 d，2 d，3 d，4 d；預蛹和蛹期)總RNA，再反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用RT-PCR分析Slcrabp基因的mRNA表達情況。結(jié)果顯示，Slcrabp在預蛹期的中腸、表皮、脂肪體和精巢各個組織均有轉(zhuǎn)錄，而且其表達量均較高(圖5-A)。SlcrabpmRNA在6齡中腸的各個時期均有表達，其表達量在預蛹期有微弱的上升趨勢(圖5-B)。

圖5 RT-PCR分析Slcrabp基因的表達情況Fig.5 Analysis of expression of Slcrabp gene by RT-PCRA：Slcrabp基因的mRNA在不同組織的表達情況；TE：精巢；MG：中腸；EP：表皮；FB：脂肪體；B：Slcrabp基因的mRNA在6齡不同發(fā)育時期在中腸的表達情況。A:Expression of Slcrabp at different tissues;TE:Testis;MG:Midgut;EP:Epidermis;FB:Fat body;B:Expression of Slcrabp in the midgut at different developmental stages for 6th larvae.

2.3.2SlCRABP蛋白質(zhì)的表達分析

提取斜紋夜蛾預蛹期不同組織(中腸、表皮、脂肪體和精巢)和不同時期(6齡0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h和蛹期0 h、24 h、48 h、72 h)的中腸總蛋白，用25 μg的蛋白量進行12%的SDS-PAGE分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SlCRABP的多克隆抗體能夠識別出斜紋夜蛾蟲體內(nèi)的SlCRABP蛋白，其大小與預測的SlCRABP蛋白分子量14.8 kDa相一致(圖6)。

圖6 Western blot分析SlCRABP蛋白在預蛹期不同組織的表達情況Fig.6 Analysis of expression of SlCRABP protein in different tissues at prepupal stage by Western blotEP：表皮；TE：精巢；FB：脂肪體；MG：中腸。EP:Epidermis;TE:Testis;FB:Fat body;MG:Midgut.

圖7 Western blot分析SlCRABP蛋白在中腸不同時期的表達情況Fig.7 Analysis of expression of SlCRABP protein in the midgut at different developmental stages by Western blot6L：6齡幼蟲6th instar stage；Pupa: pupal stage

SlCRABP蛋白在蟲體預蛹期的脂肪體、精巢和中腸中均有表達，而且表達量較高，但是在表皮中幾乎沒有表達(圖6)。圖5結(jié)果顯示該基因在表皮中有表達，但水平較低。推測Slcrabp基因在表皮中轉(zhuǎn)錄后，可能并未翻譯成蛋白質(zhì)或者只有少量被翻譯成蛋白質(zhì)。

SlCRABP蛋白在6齡幼蟲不同發(fā)育時期的中腸組織中的表達量隨著蟲體的發(fā)育漸漸增加，到預蛹期該蛋白的表達量達到頂峰。但在6齡蛻皮期和蛹期，該蛋白的表達量相對較低(圖7)。這個檢測結(jié)果與斜紋夜蛾中腸EST表達結(jié)果相一致，SlCRABP在預蛹期(L6D6)表達量較高(表2)。

2.4SlCRABP蛋白的體外結(jié)合取代實驗

預蛹期，斜紋夜蛾不再進食，蟲體開始變小，并且在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能上發(fā)生了巨大的變化，例如舊的中腸開始萎縮、解體，新的中腸重新形成，由幼蟲結(jié)構(gòu)向成蟲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。這些活動的發(fā)生需要消耗大量的能量。視黃酸結(jié)合蛋白是胞內(nèi)脂質(zhì)結(jié)合蛋白超家族成員之一，有文獻報道無脊椎動物中的視黃酸結(jié)合蛋白是從脊椎動物的H-FABP進化而來，與H-FABP的親緣關(guān)系更近(Follietal., 2005)。那么，在無脊椎動物中視黃酸結(jié)合蛋白是否具有自己獨特的生理功能呢？為了進一步研究Slcrabp基因的生理功能，我們進行了SlCRABP蛋白的體外結(jié)合取代實驗。通過檢測SlCRABP蛋白在體外與視黃酸和脂肪酸的結(jié)合情況，可以進一步探究與SlCRABP蛋白相互作用的底物。用純化后的重組SlCRABP蛋白先與熒光染料(1,8-ANS)結(jié)合，然后再加入不同的脂肪酸和視黃酸進行競爭結(jié)合，通過檢測反應(yīng)前后熒光強度的變化，最終可以確定視黃酸，視黃醇和脂肪酸與SlCRABP蛋白的結(jié)合能力及其親和力大小。

2.4.1SlCRABP與1,8-ANS的結(jié)合反應(yīng)

ANS-CRABP復合物的最佳激發(fā)波長Ex(Excitation wavelength)在370 nm左右(Follietal., 2005)，為了進一步確定復合物的最佳發(fā)射波長Em(Emission wavelength)及在固定SlCRABP蛋白濃度時，復合物的熒光強度與1,8-ANS濃度的關(guān)系，檢測了熒光強度隨1,8-ANS濃度變化的發(fā)射光譜。檢測的結(jié)果顯示：ANS-SlCRABP復合物的最佳發(fā)射波長Em在466 nm左右；在一定范圍內(nèi)它們發(fā)射光譜的峰值會隨著1,8-ANS濃度的增加而增加(圖8)，說明重組SlCRABP可以結(jié)合1,8-ANS。

圖8 10 μM SlCRABP與不同濃度1,8-ANS結(jié)合后的熒光發(fā)射光譜Fig.8 Fluorescence emission spectra for 10 μM SlCRABP binding with 1,8-ANS at different concentrations

上述結(jié)果顯示，SlCRABP蛋白與不同濃度的1,8-ANS結(jié)合后，熒光強度隨著1,8-ANS濃度的增加而增強。增加到一定的程度后(1,8-ANS濃度為20 μM)，熒光強度增加的幅度變小，說明SlCRABP蛋白在此情況下接近結(jié)合飽和狀態(tài)。ANS-SlCRABP復合物的最佳發(fā)射波長為466 nm，因此，在后續(xù)實驗中選取Ex=370 nm，Em=466 nm時的熒光強度，測定1,8-ANS與SlCRABP的熒光強度曲線。

圖9 SlCRABP與1,8-ANS的熒光滴定曲線Fig.9 SlCRABP binding curve of 1,8-ANS obtained from the fluorescence titrations

熒光強度接近飽和狀態(tài)下，1,8-ANS的濃度為20 μM，以此濃度進行后面的取代實驗，檢測SlCRABP蛋白與1,8-ANS結(jié)合的熒光強度在取代反映前后的變化情況，從而測定SlCRABP與不同底物(FAs和RA)的結(jié)合能力。

2.4.2SlCRABP蛋白的取代反應(yīng)

根據(jù)前面的熒光滴定實驗，選定20 μM 1，8-ANS與10 μMSlCRABP在黑暗室溫條件下先進行結(jié)合反應(yīng)3 min，然后再加入不同濃度的脂肪酸、視黃酸和視黃醇進行取代反應(yīng)3 min，檢測條件是：Ex=370 nm，Em=466 nm，激發(fā)波狹縫寬度為5 nm，發(fā)射波狹縫寬度為10 nm。選用可能與SlCRABP結(jié)合的6種脂肪酸和1種視黃酸和視黃醇進行分析，具體種類如表3。結(jié)果顯示：加入視黃酸、視黃醇和亞油酸后熒光強度沒有明顯變化或者熒光強度下降幅度比較微弱，說明SlCRABP與視黃酸、視黃醇和亞油酸的結(jié)合力很弱或者幾乎不結(jié)合(圖10)。但隨著花生四烯酸鈉、亞麻酸、油酸鈉和油酸濃度的增加，熒光強度急劇下降，說明SlCRABP蛋白更易于結(jié)合花生四烯酸鈉、亞麻酸、油酸鈉和油酸，即與這些不飽和脂肪酸的親和力較大。而加入軟脂酸后，熒光強度下降趨勢不大，遠遠不及花生四烯酸鈉、亞麻酸、油酸鈉和油酸。這些實驗結(jié)果預示了SlCRABP蛋白在體外更趨向于結(jié)合一些不飽和脂肪酸，但與視黃酸、視黃醇和一些飽和脂肪酸的親和性不大。

圖10 脂肪酸、視黃酸和視黃醇的取代反應(yīng)Fig.10 Displacement reaction of fatty acids,retinoic acid and retinol to 1, 8-ANS bound to SlCRABP

每種結(jié)合底物的Kd值如表3所示。Kd值越小說明SlCRABP蛋白與底物的結(jié)合活性越強。SlCRABP蛋白與不飽和的脂肪酸包括花生四烯酸鈉、亞麻酸、油酸鈉、油酸的Kd值比較小，但是與視黃酸、視黃醇的Kd值比較大，說明SlCRABP蛋白在體外可以結(jié)合花生四烯酸鈉、亞麻酸、油酸和鈉油酸，但可能不結(jié)合視黃酸和視黃醇。

2.5SlCRABP蛋白的饑餓誘導表達

為了探究SlCRABP是否參與了脂類代謝的活動，對6齡幼蟲進行了饑餓處理實驗，探究切斷食物，沒有脂肪酸補充時，SlCRABP的表達是否會受誘導表達？選取完成蛻皮進入6齡的幼蟲分別進行處理：饑餓24 h(Starvation 24)(S24)、喂食24 h(Feeding 24)(F24)、先喂食24 h后再饑餓24 h(F24S24)、先饑餓24 h后再喂食24 h(S24R24)、饑餓48 h(S48)、喂食48 h(F48)(圖11)。分別提取各組幼蟲的中腸組織總蛋白，利用Western blot檢測SlCRABP表達的變化情況。

表3 不同底物及其與SlCRABP的結(jié)合常數(shù)Table 3 The substrates and the binding constant of the substrates to SlCRABP

圖11 饑餓處理方法示意圖Fig.11 Schematic diagram to show the way of starvation treatment

結(jié)果如圖12所示：6齡幼蟲經(jīng)過S24或S48處理后，SlCRABP蛋白質(zhì)的表達量均有顯著上升的趨勢。說明饑餓會促進SlCRABP蛋白的表達，結(jié)果與前面SlCRABP蛋白在預蛹期(這時幼蟲停止進食)高表達，體外與脂肪酸有較高的親和力的結(jié)果一致。ha暗示SlCRABP的生理功能可能與蟲體內(nèi)的脂類的吸收、轉(zhuǎn)運與代謝有關(guān)，但可能并不具視黃酸結(jié)合蛋白的生理功能。

圖12 饑餓對中腸SlCRABP蛋白表達的影響Fig.12 Expression profile of SlCRABP in the midgut after starvation treatment

3 結(jié)論與討論

視黃酸是維生素A的中間代謝產(chǎn)物，參與生物體生長、發(fā)育的過程，在從魚到哺乳類的脊椎動物中是生物正常生長發(fā)育所必需的成分，在早期胚胎發(fā)育及細胞增殖分化、成體組織重建中起著重要的作用。視黃酸結(jié)構(gòu)上是疏水性的，它需要與胞內(nèi)的脂肪酸結(jié)合蛋白形成可溶性的復合物，才能被轉(zhuǎn)運至細胞不同部位發(fā)揮其生理作用(Ongetal., 1978)。在脊椎動物中，存在兩類的視黃酸結(jié)合蛋白(CRABP I和CRABP II)參與視黃酸的的轉(zhuǎn)運；而無脊椎動物中僅報道一種類型的CRABP，但是否參與體內(nèi)視黃酸的代謝，具體的生理功能尚不明確。關(guān)于昆蟲CRABP的研究甚少。

分析斜紋夜蛾基因組數(shù)據(jù)得知：Slcrabp基因結(jié)構(gòu)由3個內(nèi)含子和4個外顯子組成，與脊椎動物斑馬魚Zfcrabp1a和Zfcrabp1b(Liuetal., 2005)，小鼠Rtcrabp1和Rtcrabp2，人Hmcrabp1和Hmcrabp2相似。但Slcrabp基因每一個外顯子的氨基酸數(shù)目與上述脊椎動物不同，后者外顯子編碼的氨基酸長度極其相似，第一個外顯子為23-24 aa；第二個外顯子為60 aa；第三個外顯子為38 aa；第四個外顯子為16 aa(Liuetal., 2005)。

本研究利用熒光染料(1,8-ANS)間接檢測了不同底物與SlCRABP蛋白的結(jié)合能力，結(jié)果顯示，SlCRABP重組蛋白更易于結(jié)合長鏈不飽和脂肪酸包括花生四烯酸鈉、亞麻酸、油酸鈉和油酸，但是與視黃酸、視黃醇的結(jié)合力很弱或者幾乎不結(jié)合，該結(jié)果和煙草天蛾CRABP的結(jié)合屬性是一致的。2005年等發(fā)現(xiàn)煙草天蛾CRABP并不能結(jié)合和轉(zhuǎn)運視黃酸，反而與脂肪酸有較高的結(jié)合活性(Mansfieldetal., 1998, Folli,etal., 2005)。這個結(jié)果暗示，SlCRABP可能與蟲體內(nèi)脂類的代謝有關(guān)，并不具備結(jié)合視黃酸的功能，暗示無脊椎動物CRABP可能并未進化成一個視黃酸結(jié)合蛋白，它的存在可能起著補充無脊椎動物FABP的生理功能，但并不參與視黃酸的代謝。而無脊椎動物的視黃酸有可能是通過一些簡單的擴散進入細胞核內(nèi)，發(fā)揮它的生理作用(Wangetal., 2007)，也可能是iLBPs其它成員可彌補CRABP缺失的功能，參與視黃酸的代謝。所以在無脊椎動物中，CRABP在視黃酸信號代謝途徑中并不是不可或缺的，它對于維持細胞內(nèi)視黃酸合適的濃度也不是唯一需要的(Sharmaetal., 2003)。

我們分析了饑餓狀態(tài)對SlCRABP蛋白表達的影響。通過對6齡幼蟲的不同處理，發(fā)現(xiàn)饑餓處理24 h和48 h后，SlCRABP蛋白表達量顯著增加。說明了饑餓可誘導SlCRABP蛋白高表達，結(jié)果與SlCRABP蛋白在預蛹期高表達相吻合，預蛹期幼蟲雖然不再進食，但是這個時期昆蟲內(nèi)主要的脂肪酸，如棕櫚酸、油酸和亞油酸等與幼蟲期相比并沒有明顯的變化(待發(fā)表測定數(shù)據(jù))?；虮磉_譜分析表明，在預蛹期和蛹期的中腸，脂肪酸合成相關(guān)的基因表達都增加了，說明脂肪代謝仍然很活躍(Huangetal., 2012)。這些結(jié)果與前面結(jié)合取代實驗結(jié)果相一致：SlCRABP蛋白與不飽和脂肪酸有較高的結(jié)合性。這些結(jié)果說明SlCRAB的生理功能可能是參與了蟲體內(nèi)脂類的轉(zhuǎn)運與代謝，但沒有視黃酸結(jié)合蛋白的功能。

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The cloning, expression and functional study on cellular retinoic acid binding protein (Slcrabp) inSpodopteralitura

CHEN Ya-Qing*, XIA Ting*, ZHENG Si-Chun, FENG Qi-Li, LIU Lin**

(Guangzhou Key Laboratory of Insect Development Regulation and Applied Research, Institute of Insect Science and Technology, School of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

Cellular retinoic acid binding protein (CRABP) belongs to a superfamily of intracellular lipid binding proteins.CRABP plays an important role in a wide range of physiological processes, including cell differentiation, tissue reconstruction and signal transduction, but its role in the insect midgut remains to be investigated.A full-length cDNA clone namedSlcrabpwas identified from an Expressed Sequence Tag (EST) library of the midgut ofSpodopteralitura.SlcrabpcDNA is consisted of 396 nucleotides and encodes a polypeptide of 132 amino acids.The predicated spatial structure ofSlCRABP is similar to that of a typical fatty acid binding protein of 10-stranded β-barrel folding and 2 α helixes, which forms a cavity where lipophilic ligand resides.Based on the genomic data ofS.litura,Slcrabpgene contains 4 exons, which is similar to the vertebratecrabpgenes.RT-PCR showed thatSlcrabpkept high expression in the midgut throughout all six larval stages.Western blotting analysis results revealed thatSlCRABP protein had abundant expression in the midgut, fat body, and testis.In the midgutSlCRABP attained the highest expression level at the prepupal stage.Binding affinity ofSlCRABP was assessed by displacement assay of a fluorescent marker, 1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid (1,8-ANS).The results showed thatSlCRABP had higher binding affinity with unsaturated long chain fatty acids, including arachidonic acid, sodium acid, linolenic acid, sodium oleate and oleic acid.However,SlCRABP almost did not bind with retinoic acid or retinol.These results indicate thatSlcrabpmay play a role as a fatty acid binding protein.Larvae at the sixth instar stage were starved for 24 h and 48 h, respectively, and the expression ofSlCRABP protein was detected.The results indicated the significant increase in theSlCRABP level in the midgut.This suggested that starvation induced the expression ofSlCRABP, which may play a role in the transport of fatty acids in the midgut ofS.litura.

Cellular retinoic acid binding protein (CRABP); midgut; fatty acid; retinoic acid;Spodopteralitura

陳亞青，夏亭，鄭思春,等.斜紋夜蛾視黃酸結(jié)合蛋白(Slcrabp)基因的克隆、表達及功能[J].環(huán)境昆蟲學報，2017,39(3):493-504.

國家自然科學基金重點項目(31330071)

陳亞青，女，1989年生，博士，研究昆蟲變態(tài)發(fā)育的分子調(diào)控，E-mail：ccyaqing@163.com;*共同第一作者:夏亭，女,1987年生，碩士研究生，研究昆蟲變態(tài)發(fā)育的分子調(diào)控，E-mail:Xia_ting@dakeue.com

**通訊作者Author for correspondence, E-mail: liul@scnu.edu.cn

Received: 2017-05-15; 接受日期Accepted: 2017-06-01

Q963;S433.4

A

1674-0858(2017)03-0493-12