李 娟，沈江振，陳 巍，唐東輝

（1.燕山大學(xué)體育學(xué)院，河北 秦皇島 066004；2.河北科技師范學(xué)院體育系，河北 秦皇島 066004；3.北京師范大學(xué)體育與運(yùn)動(dòng)學(xué)院，北京 100875）

8周跑臺訓(xùn)練對肥胖小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素PI3K/Akt通路的影響

李 娟1，沈江振2，陳 巍2，唐東輝3

（1.燕山大學(xué)體育學(xué)院，河北 秦皇島 066004；2.河北科技師范學(xué)院體育系，河北 秦皇島 066004；3.北京師范大學(xué)體育與運(yùn)動(dòng)學(xué)院，北京 100875）

目的：探討運(yùn)動(dòng)鍛煉對肥胖小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素PIK3/Akt信號通路的影響，揭示運(yùn)動(dòng)鍛煉降低肥胖者心血管病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)生物學(xué)機(jī)制。方法：將雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對照組（CG, n=12）與高脂膳食組（HG, n=33），肥胖模型建立后，HG隨機(jī)分為肥胖組（OG, n=11）與肥胖運(yùn)動(dòng)組（OEG, n=13），OEG小鼠接受8周跑臺訓(xùn)練（12 m/min，60 min/ time，1 time/ d，6 d/w），記錄小鼠體重及能量攝入，免疫組織化學(xué)及western blot檢測小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮IRS1、p-IRS1（Ser307）、Akt及 p-Akt（Thr308）水平的變化。結(jié)果：1）OEG小鼠體重較OG下降（P＜0.01）；2）OEG小鼠胰島素水平及HOMA-IR較OG顯著下降（P＜0.05，P＜0.05）；3）OEG小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮p-IRS1（Ser307）表達(dá)較OG降低（P＜0.05），p-Akt（Thr308）表達(dá)較OG顯著上升（P＜0.05）。結(jié)論：8周跑臺訓(xùn)練可降低肥胖小鼠體重增長，改善胰島素抵抗，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素PI3K/Akt信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。

運(yùn)動(dòng)；肥胖小鼠；胰島素抵抗；血管內(nèi)皮細(xì)胞; PI3K/Akt通路

由于人類生活方式發(fā)生了變化，導(dǎo)致肥胖（obesity）在全球范圍內(nèi)普遍流行，極大促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化、2型糖尿病、冠心病、高血壓等心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[1]。血管內(nèi)皮功能障礙（endothelial dysfunction）是血管病變的啟動(dòng)環(huán)節(jié)，幾乎與所有的心血管疾病存在密切聯(lián)系[2-3]。大量研究證實(shí)，肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗（insulin resistance）在血管內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生過程中具有關(guān)鍵性作用[3]。生理?xiàng)l件下，胰島素可通過作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞上胰島素受體激活經(jīng)磷酸肌醇3激酶（PIK3）/蛋白激酶B（Akt）信號通路，增加一氧化氮（NO）釋放，促進(jìn)血管舒張[4]。但在肥胖狀態(tài)下，多種因素導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞合成NO的能力下降，血管舒張功能減弱，進(jìn)而增加上述心血管疾病罹患風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。越來越多的研究提示，提高身體活動(dòng)水平或規(guī)律的運(yùn)動(dòng)鍛煉可以顯著降低肥胖者心血管疾病的發(fā)病率與死亡率[6-9]，但其中的生物學(xué)機(jī)制并未完全闡明。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究主要探討8周跑臺訓(xùn)練對肥胖小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素信號調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)及其磷酸化水平的影響，揭示運(yùn)動(dòng)鍛煉改善肥胖相關(guān)血管內(nèi)皮功能障礙、降低心血管病風(fēng)險(xiǎn)的生物學(xué)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)對象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象與分組 雄性C57BL/6小鼠（6 weeks，15.62±1.45g，n=45），由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，小鼠在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，明暗交替周期為12h，動(dòng)物房溫度為25℃±2℃，相對濕度為45%±10%。小鼠在動(dòng)物房內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后隨機(jī)分為2組：對照組（CG,n=12）、高脂膳食組（HG，n=33），12周后將肥胖建模成功的小鼠（n=24）再隨機(jī)分為肥胖組（OG，n=11）、肥胖運(yùn)動(dòng)組（OEG，n=13）。

1.2 肥胖小鼠模型的建立 適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，CG小鼠進(jìn)食普通飼料（2.90kcal/g,13%脂肪，64%糖，23%蛋白質(zhì)）；OG與OEG小鼠進(jìn)食高脂飼料（4.20kcal/g，51%脂肪，33%糖，16%蛋白質(zhì)）。喂養(yǎng)12周后，將小鼠體重超過CG小鼠平均體重20%作為肥胖模型成功標(biāo)準(zhǔn)。剔除體重未達(dá)標(biāo)的小鼠，然后，OG與OEG小鼠繼續(xù)采用高脂飼料喂養(yǎng)，OEG開始進(jìn)行為期8周的跑臺運(yùn)動(dòng)干預(yù)，CG與OG小鼠不進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)。

1.3 運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案 運(yùn)動(dòng)干預(yù)采用電動(dòng)跑臺訓(xùn)練（成都泰盟，F(xiàn)T-200），跑臺坡度為0度，恒定跑速為12m/ min，每次訓(xùn)練時(shí)間為60min，每日訓(xùn)練1次，每周連續(xù)訓(xùn)練6天，連續(xù)進(jìn)行6周。

1.4 能量攝入及體重的計(jì)算 實(shí)驗(yàn)期間,每日詳細(xì)記錄小鼠進(jìn)食行為與攝食量，每周計(jì)算1次24h平均能量攝入量及食物消耗量。小鼠24h能量攝入量（kcal/24h）= 食物消耗量（g/24h）×食物的能量密度（kcal/g）。每24h稱量一次小鼠體重（0.1g）。

1.5 樣品采集及處理 最后一次運(yùn)動(dòng)結(jié)束48h后，每組取6只小鼠，用5%的水合氯醛溶液對小鼠腹腔注射（0.5 ml/10g），深度麻醉后，眼球取血，將全血放入離心管，以3500rp/min離心10min后，分離血清，分裝后置4℃環(huán)境待測；打開胸腔，分離主動(dòng)脈，取結(jié)締組織，生理鹽水洗凈，取適當(dāng)長度置4%多聚甲醛溶液中固定，剩余血管組織用液氮冷凍后低溫保存。

1.6 血清生化指標(biāo)檢測 小鼠血糖水平采用血糖儀（OMRON,中國）檢測；胰島素水平采用ELISA法測定，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒（美國R&D公司）說明書進(jìn)行。穩(wěn)態(tài)模型評估胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），HOMAIR=空腹胰島素（mIU/L）×空腹血糖（mmol/L）/ 22.5。

1.7 免疫組織化學(xué) 將甲醛固定后的小鼠主動(dòng)脈進(jìn)行石蠟包埋，休塊后，以5μm的厚度切片，將其附貼于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，37℃過夜，脫蠟，蒸餾水洗3次，5%BSA封閉30min，滴加一抗孵育，4℃過夜。PBS沖洗10min×3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃靜置30min。PBS沖洗2min×3次；滴加試劑SABC，37℃靜置30min，PBS沖洗5min×3次，經(jīng)DAB顯色后采用蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片，采用Image-Pro Plus6.0軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)高倍視野內(nèi)的陽性細(xì)胞的平均光密度值（average optical density, AOD）。

1.8 Western blot檢測 小鼠血管內(nèi)皮組織蛋白表達(dá)采用Western blot法，將適量血管組織進(jìn)行剪切后放置預(yù)冷的勻漿器充分研磨后，加入適量裂解液裂解30min，以12 000r/min離心10min取上清液分裝，BCA法測定蛋白濃度。依次上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入稀釋的單克隆抗體，孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育60min，將ECL工作液加置PVDF膜，室溫下孵育5min后用保鮮膜包好PVDF膜，經(jīng)顯影、曝光、洗膜、封閉。將β-actin單克隆抗體按1∶500稀釋到一抗稀釋液中，室溫下?lián)u動(dòng)60min，按上述方法得到內(nèi)參條帶，將膠片用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。各變量組間均數(shù)的比較采用方差分析（one way ANOVA），顯著性水平均為P＜0.05。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠體重變化 從第6周開始HG小鼠體重顯著高于CG小鼠（P＜0.01）。第12周開始進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)，將HG中符合肥胖標(biāo)準(zhǔn)的小鼠隨機(jī)分為OG與OEG，與OG比較，OEG小鼠從第15周開始體重顯著下降（P＜0.01）（圖1A）。

圖1 小鼠體重與能量攝入變化

2.2 小鼠能量攝入變化 HG小鼠在整個(gè)飼養(yǎng)過程中每日能量攝入顯著高于CG（P＜0.01）；運(yùn)動(dòng)干預(yù)開始后，OEG小鼠每日能量攝入在第13周、第14周均顯著高于OG（P＜0.01），從第15周至第20周每日能量攝入，兩組未見顯著差異（圖1B）。

2.3 小鼠血糖、胰島素及HOMA-IR的比較 與CG比較，OG小鼠血糖水平未見顯著變化，但胰島素水平及HOMA-IR卻顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）；與OG比較，OEG小鼠胰島素水平及HOMA-IR均顯著下降（P＜0.05，P＜0.05）（圖2）。

圖2 小鼠血糖、胰島素及HOMA-IR的比較

2.4 小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的IRS1與Akt表達(dá)及磷酸化水平比較 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，位于血管內(nèi)皮細(xì)胞層的目標(biāo)蛋白的免疫陽性反應(yīng)呈棕黃色染色（圖3）。與CG比較，OG小鼠血管內(nèi)皮IRS1及Akt的蛋白表達(dá)未發(fā)生顯著變化，但p-IRS1的表達(dá)水平非常顯著升高（P＜0.01），而p-Akt的表達(dá)非常顯著降低（P＜0.01）；與OG比較，OEG小鼠血管內(nèi)皮p-IRS1顯著降低（P＜0.05），p-Akt表達(dá)顯著增高（P＜0.05）（圖4）。

圖3 小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞p-IRS-1及p-Akt的定位表達(dá)

圖4 小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞IRS1、Akt的蛋白表達(dá)及磷酸化水平比較

3 討 論

伴隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的快速發(fā)展，肥胖在發(fā)達(dá)與發(fā)展中國家已成為影響人類健康的社會(huì)問題，也成為決定疾病模式變化的重要因素[1]。其中，胰島素抵抗是指胰島素靶組織對正常劑量的胰島素敏感性下降，即生理劑量的胰島素不能夠維持其正常的生理功能，胰島素抵抗是聯(lián)系肥胖與多種代謝異常的重要紐帶。除了經(jīng)典的靶組織，如骨骼肌、脂肪及肝臟組織外，胰島素還可以通過作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性受體，激活胰島素受體底物（IRS），通過PI3K或者絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮源性舒張因子與收縮因子的釋放，調(diào)控血管平滑肌舒張與收縮[4-5]。肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗可通過引起血管內(nèi)皮功能障礙，增加心血管病風(fēng)險(xiǎn)[5]。充分的證據(jù)表明，規(guī)律的運(yùn)動(dòng)鍛煉對降低肥胖者代謝性疾病風(fēng)險(xiǎn)具有重要的意義[6-8]。但相關(guān)生物學(xué)機(jī)制并未完全闡明。

本研究發(fā)現(xiàn)，肥胖小鼠的胰島素抵抗指數(shù)較正常小鼠明顯增加，血管內(nèi)皮p-IRS1（Ser307）水平明顯增加，而p-Akt（Thr308）水平卻顯著下降，這提示肥胖小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素PI3K/Akt信號途徑存在障礙。研究表明，胰島素作用于內(nèi)皮細(xì)胞受體后，可通過IR/IRS/ PI3K/Akt信號通路增加一氧化氮合酶（eNOS）的活性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞合成NO[9-11]。另一方面，胰島素還可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的MAPK通路促進(jìn)內(nèi)皮素（ET-1）的釋放，NO與ET-1是體內(nèi)最重要的舒血管物質(zhì)和縮血管物質(zhì)，這兩種物質(zhì)保持平衡是維持血管張力正常的重要基礎(chǔ)[11]。對于IRS1而言，胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生障礙后，其酪氨酸磷酸化水平會(huì)下降，而絲氨酸磷酸化水平會(huì)增加，進(jìn)而導(dǎo)致PI3K依賴的胰島素信號通路抑制，NO合成降低，但是血管內(nèi)皮細(xì)胞MAPK信號依然正常，這就造成血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1的分泌量相對增加，最終導(dǎo)致血管趨向于收縮[5,12]。血管持續(xù)收縮會(huì)產(chǎn)生許多不良結(jié)果，一方面會(huì)使動(dòng)脈血壓增加；另一方面會(huì)導(dǎo)致胰島素的靶組織血流灌注量降低，增加胰島素抵抗的程度[3,13]。肥胖者血管內(nèi)皮功能障礙主要的原因就是血管內(nèi)皮細(xì)胞NO合成減少所致[3,6]。這可能是胰島素抵抗增加肥胖人群心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的重要原因之一。本研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過8周跑臺訓(xùn)練后，肥胖小鼠體重增長速度與胰島素抵抗指數(shù)均顯著降低。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，8周跑臺訓(xùn)練顯著降低了肥胖小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞p-IRS1（Ser307）水平，而p-Akt（Thr308）水平卻顯著升高。這提示運(yùn)動(dòng)干預(yù)可促進(jìn)肥胖小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，改善胰島素抵抗。

目前，運(yùn)動(dòng)鍛煉改善肥胖相關(guān)胰島素抵抗的機(jī)制已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。本研究結(jié)果提示，運(yùn)動(dòng)干預(yù)可顯著改善肥胖小鼠胰島素抵抗，提高血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這二者之間可能存在密切聯(lián)系。由于胰島素抵抗被認(rèn)為是孕育多種代謝性疾病的“共同土壤”，因此，肥胖者應(yīng)重視通過規(guī)律的運(yùn)動(dòng)鍛煉改善胰島素抵抗與血管內(nèi)皮功能，這可能會(huì)成為肥胖者降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的重要策略。

4 結(jié) 論

8周跑臺訓(xùn)練可以明顯降低肥胖小鼠體重增長，改善胰島素抵抗，同時(shí)還可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素PI3K/ Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。這可能是規(guī)律運(yùn)動(dòng)鍛煉降低肥胖者心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的重要生物學(xué)機(jī)制之一。

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Effects of 8-week Treadmill Training on PI3K/Akt Pathway in Vascular Endothelial Cells of Obese Mice

LI Juan1, SHEN Jiang-zhen2, CHEN Wei2, TANG Dong-hui3
(1. College of Physical Education，Yanshan University，Qinhuangdao 066004，Hebei China；2. Department of Physical Education, Hebei Normal University of Science and Technology, Qinhuangdao 066004, Hebei China；3. P.E. and Sport College, Beijing Normal University, Beijing 100875, China)

The objective of this study is to investigate the effect of treadmill exercise on PI3K/Akt pathway of vascular endothelial cells in obese mice. Methods: male C57BL/6 mice were randomly divided into control group (CG, n=12) and high fat group (HG, n=33). HG were randomly divided into obesity group (OG, n=11) and obesity group (OEG, n=13) after obese model induced by high fat diet, OEG mice were taken treadmill exercise for 8 weeks (12 m/min, 60 min/ time, 1 time/d, 6 d/w); the body weight and energy intake were recorded, the IRS1, p-IRS1(Ser307), Akt and p-Akt (Thr308) in aortic endothelium were detected by immunohistochemistry and western blot. Results: 1) the body weight of OEG mice was lower than CG (P < 0.01). 2) The insulin level and HOMA-IR signif i cantly increased in OG (P < 0.01, P < 0.01); and insulin levels and HOMA-IR signif i cantly decreased in OEG compared with OG (P < 0.05, P < 0.01). 3) The expression of TH in VTA-NAc system was lower in OG than CG (P < 0.01); and was morein OEG than OG (P < 0.05). The expression p-IRS1(Ser307) in OEG was lower than OG (P < 0.05), and the p-Akt (Thr308) expression was more in OEG than OG (P < 0.05). Conclusion: 8-week treadmill training can decrease weight gain, improve insulin resistance, and promote insulin PI3K/Akt signaling pathway in vascular endothelial cells in obese mice.

exercise; obese mice; insulin resistance; endothelial cell; PI3K/Akt signaling

G804.2

A

1004 - 7662(2017)04- 0084- 05

2017-03-03

國家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號：81472992）；燕山大學(xué)青年教師自主研究計(jì)劃課題資助（項(xiàng)目編號：14LGB030）。

李娟，講師，碩士，研究方向：運(yùn)動(dòng)防治肥胖生物學(xué)機(jī)制。