周儷姍+鄢素琪+熊小麗+黃娟+張領(lǐng)領(lǐng)+湯建橋

[摘要] 探討補骨脂對幼齡小鼠脂肪肝（NAFLD）的防治作用及機制。該實驗采用高脂飲食建立幼齡小鼠NAFLD模型，給予補骨脂顆粒劑（低、高劑量）治療5周后，檢測血糖、血脂（TC，TG，LDL-C，HDL-C）、空腹胰島素、肝功能（ALT，AST）水平，計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），觀察肝組織形態(tài)學改變，檢測肝臟甘油三酯（TG）含量、CD44蛋白表達，同時檢測肝組織核因子κB（NF-κB）p65磷酸化（p-p65）及非磷酸化蛋白（p65）表達及其下游細胞因子（TNF-α，IL-8）水平。結(jié)果顯示與模型組比較，補骨脂組HOMA-IR，ALT，AST，空腹血糖，血脂（TC，TG，LDL-C），肝臟TG含量降低（P<0.01，P<0.05），HDL-C水平升高（P<0.01，P<0.05），肝細胞脂肪變性減輕，匯管區(qū)纖維組織增生及炎細胞浸潤改善，肝臟CD44蛋白表達減少，肝組織TNF-α，IL-8水平、p-p65/p65明顯下降（P<0.01）。高劑量組療效優(yōu)于低劑量組（P<0.01，P<0.05）。結(jié)果表明補骨脂對幼齡小鼠脂肪肝具有防治作用，還可調(diào)節(jié)其糖脂代謝紊亂、改善肝纖維化。其機制可能與下調(diào)NF-κB的活性抑制炎癥反應有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 非酒精性脂肪性肝??；補骨脂；炎癥；核因子κB；幼齡小鼠

[Abstract] To investigate the mechanism and effect of Psoralea corylifolia（PC） in the treatment of NAFLD in juvenal mice. The NAFLD model in juvenal mice was established by feeding high-fat diet. Then PC herbal granules （at low and high dose） were administered for 5 weeks. Blood glucose （FBG， PG-1 h/2 h）， blood lipid （TC， TG， HDL-C， LDL-C）， fasting insulin， liver function （ALT， AST） were examined. HOMA-IR was calculated. Hepatic histological changes were observed. The content of TG， inflammatory factor （TNF-α， IL-8） and protein expressions of CD44， NF-κB p65， p-NF-κB p65 in hepatic tissues were determined. The ratio of p-NF-κB p65 to NF-κB p65 （p-p65/p65） was calculated. The result showed that compared with the model group， both PC treatment groups showed reduction in hepatic steatosis， inflammatory cell infiltration and fibroplasia in portal area. HOMA-IR， ALT， AST， FBG， PG-2 h， TC， TG， LDL-C concentrations and hepatic TG content were also significantly decreased， with the reduction of TNF-α， IL-8 contents， CD44 expression and p-p65/p65 ratio in hepatic tissues （P<0.01）. High-dose PC group had a better effect than low-dose group （P<0.01， P<0.05）. In conclusion， PC is effective in treating hepatic injury， glucolipid metabolism disturbances and fibrosis in juvenal NAFLD mice. The mechanism may be related to inhibition of inflammation and down-regulation of the activation of hepatic NF-κB.

[Key words] NAFLD；Psoralea corylifolia；inflammation；NF-κB；juvenal mouse

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）呈現(xiàn)全球化、低齡化流行趨勢，是兒童就診消化?？苹蚋尾？频氖滓∫騕1-3]。肥胖與脂肪肝關(guān)系密切，我國兒童肥胖癥的流行已是客觀事實[4-5]，肥胖兒童NAFLD患病率高達68.2%[2-3]。起源于兒童期的NAFLD更是成人肝硬化、代謝綜合征相關(guān)疾病的主要后備人群[6]。隨著我國城市化進程、中產(chǎn)家庭崛起及“二胎”政策的全面開放，NAFLD迅速蔓延，已取代慢性病毒性肝炎，成為威脅我國兒童健康的重大問題。

然而，目前臨床尚缺乏針對兒童NAFLD的有效治療藥物[6-7]。近年來，“核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）”相關(guān)炎癥通路在NAFLD發(fā)病機制中的重要地位被不斷證實[8-9]。中藥補骨脂（Psoralea corylifolia L.，PC）是兒科的傳統(tǒng)常用藥，具有溫脾補腎壯陽的藥用特點。該藥的現(xiàn)代藥理學研究主要與成人疾病相關(guān)，除抗腫瘤和改善骨質(zhì)疏松等功效外，其肝臟保護及抗炎功效亦受到關(guān)注[10-11]。但是，PC對兒童脂肪肝的治療作用及其機制研究未見報道，因此，本課題組通過建立幼齡小鼠脂肪肝動物模型，進一步探討PC的抗脂肪肝作用及對肝組織NF-κB炎癥通路的影響。

1 材料

1.1 動物 SPF級雄性C57BL/6J小鼠（3周齡）40只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司（實驗動物質(zhì)量合格證號11401300041293）。動物飼養(yǎng)于華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心屏障系統(tǒng)（實驗設施使用證明號00141016）。動物倫理符合《湖北省實驗動物管理條例》和《華中科技大學實驗動物倫理委員會章程》，經(jīng)華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬婦女兒童醫(yī)療保健中心實驗動物倫理委員會審核通過。

1.2 飼料 D12451高脂飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司，配方為：45%kcal脂肪，20%kcal蛋白質(zhì)，35%kcal碳水化合物。普通飼料由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供，配方為：35%面粉，20%大豆粉，20%玉米粉，15.5%麩子，0.5%豆油，5%魚粉，2.5%骨頭粉，1%酵母粉，0.5%鹽。

1.3 藥物 補骨脂配方顆粒由華潤三九醫(yī)藥股份有限公司提供（批號1407001W）。維生素E軟膠囊購自浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠（批號140638）。

1.4 試劑 血糖（BG）試紙（批號460752）、Cocktail蛋白酶抑制劑（貨號04693159001）均購自瑞士Roche公司。葡萄糖測定試劑盒（貨號G022）購自上海名典生物工程有限公司?？偰懝檀迹═C）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測試盒（貨號A111-1，A110-1，A112-1，A113-1）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒（貨號C009-2，C0010-2）；小鼠白細胞介素-8（IL-8）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（貨號H008）均購自南京建成科技有限公司。小鼠胰島素（INS）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（貨號E-EL-M2614c）、小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（貨號E-EL-M0049c）均購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。EDTA修復液（貨號AS1016）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號AS1086）、RIPA總蛋白裂解液（貨號AS1004）、PMSF（貨號AS1006）、磷酸化蛋白酶抑制劑（貨號AS1008）均購自武漢ASPEN生物技術(shù)有限公司。DAB顯色試劑盒（貨號ZLI-9033）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。兔抗小鼠CD44單克隆抗體（貨號ab41478）、GAPDH多克隆抗體（貨號ab37168）、磷酸化NF-κB p65（磷酸化位點S276）多克隆抗體（貨號ab106129）均購自Abcam公司。兔抗小鼠NF-κB p65單克隆抗體（貨號#8242）購自CST公司。山羊抗兔多克隆二抗（貨號074-1506）購自KPL公司。

2 方法

2.1 模型制備、分組及處理 小鼠適應性喂養(yǎng)3 d。隨機抽取8只小鼠編為正常組，繼續(xù)正常飼料喂養(yǎng)。其余32只小鼠隨機編為4組：模型組、補骨脂（低、高劑量）組、維生素E組，每組8只小鼠，換用D12451高脂飼料喂養(yǎng)。3 d后，正常及模型組給予0.02 mL·g^-1生理鹽水灌胃；補骨脂（低劑量）組給予1.125 mg·g^-1補骨脂配方顆粒溶液灌胃；補骨脂（高劑量）組給予2.25 mg·g^-1補骨脂配方顆粒溶液灌胃；維生素E組給予0.01 mg·g^-1維生素E軟膠囊混懸液灌胃。各組灌胃給藥至10周齡。處死前禁食12 h，摘除眼球法采集血液標本，采血量2～3 mL，3 000 r·min^-1條件下離心30 min，分離血清，-80 ℃保存；取肝臟組織：肝左外葉、左中葉裝入凍存管，-80 ℃保存，備用；肝右中葉、右上葉和右下葉予4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，用于蘇木精-伊紅（HE）及免疫組化檢測。

2.2 口服葡萄糖耐量試驗（OGTT） 處死前3 d行OGTT實驗。禁食12 h，剪尾取血法采集血液標本，用羅氏血糖儀檢測空腹血糖（FBG）值，之后予50%葡萄糖2 g·kg^-1灌胃，然后再次剪尾取血，血糖儀分別測定灌胃后1，2 h血糖（PG-1 h，PG-2 h）值。

2.3 計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR） 葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖（FBG），ELISA方法測定空腹胰島素（FINS）。根據(jù)公式：FBG （mmol·L^-1）×FINS（mIU·L^-1）/22.5計算HOMA-IR。

2.4 蘇木精-伊紅（HE）染色 取石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，去離子水沖洗，蘇木精染色1～5 min，去離子水沖洗2 min，1%鹽酸乙醇分化15 s，去離子水沖洗1 min，1%氨水泛藍30 s，去離子水沖洗1 min，伊紅染色30 s，去離子水沖洗30 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，干燥后中性樹膠封片，于光學顯微鏡觀察。

2.5 生化指標及炎癥指標檢測 酶法測定血TC，TG，HDL-C，LDL-C，ALT，AST及肝組織TG含量。ELISA方法測定肝組織TNF-α，IL-8水平。

2.6 免疫組化方法測定肝組織CD44蛋白表達 將石蠟切片置于65 ℃烘箱中烘片2 h，脫蠟、水化。用PBS洗滌后，將切片置于EDTA緩沖液中微波修復，自然冷卻后用PBS洗滌。再將切片置于3%過氧化氫溶液中，室溫下避光孵育10 min。PBS洗滌甩干后5%牛血清蛋白封閉20 min。去除封閉液，每張切片加入約50 μL稀釋的（比例為1∶150）兔抗小鼠CD44單克隆抗體覆蓋組織，4 ℃過夜。用PBS洗滌后，37 ℃下每張切片孵育二抗50 min。PBS洗滌后，每張切片加新鮮配制DAB溶液顯色。顯色完全后，蒸餾水或自來水沖洗，蘇木素復染，1%鹽酸乙醇分化，自來水沖洗，氨水返藍，流水沖洗。切片經(jīng)過梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

2.7 Western blot方法測定肝組織NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65蛋白表達 提取肝組織總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，-80 ℃保存。取40 μg蛋白，變性后用10%SDS-PAGE分離膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉（非磷酸化蛋白）或0.5%牛血清蛋白（磷酸化蛋白）封閉，4 ℃孵育一抗（GAPDH稀釋比例為1∶1萬；NF-κB p65稀釋比例為1∶2 000；磷酸化NF-κB p65稀釋比例為1∶1 000）搖床過夜，TBST洗膜后，孵育二抗30 min，TBST洗膜后，化學發(fā)光法檢測PVDF膜，用AlphaEaseFC軟件進行分析灰度值。

2.8 統(tǒng)計學方法 運用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以±s表示，各組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），多樣本均數(shù)間的兩兩比較根據(jù)方差齊同性檢驗結(jié)果，選擇結(jié)果判讀標準“LSD-t”或者“Games-Howell”，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 補骨脂對幼齡脂肪肝小鼠OGTT及HOMA-IR的影響 與正常組比較，模型小鼠血清FBG，PG-2 h，HOMA-IR均有升高（P<0.01）；與模型組比較，補骨脂各劑量組、維生素E組血清PG-2 h水平無統(tǒng)計學差異，但FBG，HOMA-IR有不同程度降低（P<0.01，P<0.05），其中補骨脂高劑量組降幅最大（P<0.01），HOMA-IR較低劑量組有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。各組小鼠血清PG-1 h水平未見明顯差異，見表1。

3.2 補骨脂對幼齡脂肪肝小鼠血脂的影響 與正常組比較，模型小鼠出現(xiàn)血脂代謝紊亂，血清TG，TC及LDL-C均顯著升高（P<0.01），且血清HDL-C水平明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，補骨脂各劑量組、維生素E組各血脂單項水平均有不同程度改善（P<0.01，P<0.05），其中補骨脂高劑量組改善幅度最明顯（P<0.01），差異較低劑量組有統(tǒng)計學意義（P<0.01，P<0.05），見表2。

3.3 補骨脂對幼齡脂肪肝小鼠肝臟形態(tài)學的影響 正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)可見，肝細胞索及肝血竇排列正常。與正常組比較，模型組肝細胞明顯水腫、變性，肝細胞明顯脂肪變性，匯管區(qū)纖維組織及小膽管增生，較多炎性細胞浸潤。與模型組比較，各治療組肝臟病理改變均有改善，補骨脂高劑量組病變最輕。鏡下具體情況為：補骨脂低劑量組肝細胞水腫，其內(nèi)見散在脂滴空泡，匯管區(qū)纖維組織輕度增生，炎性細胞浸潤；補骨脂高劑量組部分肝細胞輕度脂肪變性，匯管區(qū)少許炎性細胞浸潤；維生素E組匯管區(qū)炎性細胞浸潤，肝細胞內(nèi)見散在脂滴空泡，見圖1。

3.4 補骨脂對幼齡脂肪肝小鼠肝功能及肝臟TG含量的影響 與正常組比較，模型小鼠血清ALT，AST均有升高（P<0.01），肝臟TG含量升高（P<0.01）；與模型組比較，補骨脂各劑量組、維生素E組血清ALT，AST均降低（P<0.01），肝臟TG含量降低（P<0.01），其中補骨脂高劑量組較低劑量降幅明顯（P<0.01，P<0.05），見表3。

3.5 補骨脂對幼齡脂肪肝小鼠肝組織CD44蛋白表達的影響 正常組小鼠肝組織匯管區(qū)淋巴細胞呈陰性表達CD44。與正常組比較，模型組小鼠匯管區(qū)淋巴細胞呈強陽性表達CD44。與模型組比較，各治療組CD44表達均有減少：補骨脂低劑量小鼠匯管區(qū)部分淋巴細胞表達CD44；補骨脂高劑量組及維生素E組小鼠匯管區(qū)部分淋巴細胞弱表達CD44，見圖2。

3.6 補骨脂對幼齡脂肪肝小鼠肝組織炎癥因子的影響 與正常組比較，模型小鼠肝組織TNF-α，IL-8均有升高（P<0.01）；與模型組比較，補骨脂各劑量組、維生素E組肝組織TNF-α，IL-8均降低（P<0.01），其中補骨脂高劑量組較低劑量降幅明顯（P<0.01），見表4。

3.7 補骨脂對幼齡脂肪肝小鼠肝組織NF-κB的活性的影響 以p-p65/p65表示NF-κB的活性。與正常組比較，模型小鼠肝組織p-p65/p65顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，補骨脂各劑量組、維生素E組肝組織p-p65/p65均明顯降低（P<0.01），其中補骨脂高劑量組較低劑量降幅明顯（P<0.05），見圖3。

4 討論

傳統(tǒng)中藥材補骨脂（PC），是現(xiàn)代藥理研究的熱點[10-11]。現(xiàn)如今，PC的多重藥理活性逐漸被發(fā)現(xiàn)，特別是在治療骨質(zhì)疏松和性激素樣作用方面的研究已取得了較多成績[12]。但是，補骨脂對代謝性疾病，尤其是脂肪肝的治療作用，尚未見報道。

采用高脂飲食喂養(yǎng)的方法，可成功建立幼齡小鼠脂肪肝模型[13]。本研究模型小鼠在體成熟（10周齡）前進行了取材[14]，成年前出現(xiàn)了胰島素抵抗、肝功能受損（ALT>AST）、肝臟TG含量增高、肝臟組織學顯示脂肪變性和炎細胞浸潤等表現(xiàn)，具備NAFLD典型特征[7]。給予補骨脂顆粒灌胃后，模型小鼠HOMA-IR降低、ALT及AST水平降低、肝臟TG含量減少，高劑量組優(yōu)于低劑量組。進一步對比肝臟病理學改變顯示PC治療后肝細胞脂肪變性減輕、炎細胞浸潤減少，且高劑量組優(yōu)于低劑量組。說明PC可改善幼齡小鼠脂肪肝，療效呈劑量依賴性。

此外，為進一步評估肝纖維化情況，除觀察各組小鼠肝臟HE染色匯管區(qū)纖維增生情況外，還檢測了肝組織CD44蛋白表達。CD44是I型跨膜蛋白，是細胞表面受體，通常表達在肝臟Kupffer細胞和浸潤淋巴細胞表面。當肝臟出現(xiàn)纖維變性時，可與過表達的細胞外基質(zhì)產(chǎn)物透明質(zhì)酸特異性結(jié)合。因此，CD44可視為是評估早期肝纖維化的間接指標[15]。模型小鼠肝臟HE染色見匯管區(qū)纖維組織增生，且匯管區(qū)淋巴細胞CD44蛋白表達呈強陽性，均提示肝纖維化存在。經(jīng)PC治療后，觀察肝臟HE染色，低劑量組小鼠匯管區(qū)纖維增生減輕，高劑量組消失；肝組織CD44蛋白表達下降，高劑量組較低劑量組下降更明顯。說明PC可改善幼齡脂肪肝小鼠早期肝纖維化，療效亦呈劑量依賴性。

NAFLD的發(fā)病涉及氧化應激、胰島素抵抗和炎癥等多個機制[16]，且各機制之間互相影響互相促進。慢性炎癥反應不僅在上述關(guān)聯(lián)中扮演重要角色，還推進肝纖維化進程[17]。NF-κB炎癥信號通路激活在眾多有關(guān)NAFLD的臨床和實驗室研究中被證實[18-21]，本研究亦顯示模型小鼠肝組織磷酸化與非磷酸化NF-κB p65蛋白表達比值明顯升高，并伴隨NF-κB下游炎癥因子肝組織TNF-α，IL-8表達增多。進一步檢測PC治療組，發(fā)現(xiàn)：模型小鼠經(jīng)PC治療后，肝組織磷酸化與非磷酸化NF-κB p65蛋白表達比值明顯下降，且肝組織TNF-α，IL-8水平也明顯減少。說明PC改善脂肪肝的療效可能是通過抑制NF-κB炎癥通路活化來實現(xiàn)的。同時，高劑量組的下調(diào)強度較低劑量組明顯。

綜上所述，本研究證實了補骨脂的防治幼齡小鼠脂肪肝、肝纖維化的功效，并進一步探討了其改善肝臟慢性炎癥的能力，抑制NF-κB的活化是補骨脂發(fā)揮抑制炎癥反應的可能機制之一。

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[責任編輯 張寧寧]