盧昱希+程搏幸+郭巧生+劉飛+史紅專+勾玲

[摘要] 研究了不同水溫（18，22，26，30，34，38 ℃），不同養(yǎng)殖密度（30，60，120，180，240條/L），不同投喂周期（2，5，10，20 d）對水蛭生長、攝食、存活的影響。結果表明，特定增長率與溫度之間存在顯著二次函數關系（P<0.05），且回歸方程為y=-0.016 5x²+0.836 9x-6.847 5（R²=0.990 8）?；貧w分析顯示當溫度為25.36 ℃時，水蛭特定增長率最大，達到3.76。當溫度高于30 ℃時，隨著溫度升高，存活率急劇下降。水蛭的特定增長率隨著密度的增大而減小。隨著密度增加，存活率呈現顯著下降趨勢（P<0.05）。投喂周期與特定增長率之間存在著顯著負相關關系（P<0.05），且線性方程為y=-0.094 1x+3.832 9（R²=0.992 7）。經過實驗研究可推測，30～120條/L為適合水蛭生長的密度，22～26 ℃為水蛭最適生長溫度，投喂周期越小越好。

[關鍵詞] 溫度；養(yǎng)殖密度；投喂周期；特定增長率；餌料系數

[Abstract] Effects of different water temperature， stocking density and feeding cycle on growth， feeding and survival of Hirudo nipponica have been studied， six temperature gradients were set： 18， 22， 26， 30， 34 and 38 ℃， five stocking density gradients were set： 30， 60， 120， 180 and 240 leech/L， four feeding cycle gradients were set： 2， 5， 10 and 20 d， respectively. The results showed that there exists a significant regression relationship between water temperature and specific growth rate： y=-0.016 5x²+0.836 9x-6.847 5（R²=0.990 8）（P<0.05）， a regression analysis indicated that specific growth rate reached the maximum （3.76） at 25.36 ℃. When water temperature was beyond 30 ℃， the survival rate significantly decreased as water temperature increased （P<0.05）. The specific growth rate and survival rate decreased as stocking density increased. A linear relationship exists between the feeding cycle and the SGR： y=-0.094 1x+3.832 9（R²=0.992 7）. From this study， it can be concluded that the optimal water temperature and stocking density for the growth of H. nipponica is 22-26 ℃ and 30-120 leech/L， respectively.

[Key words] temperature；stocking density；feeding cycle；specific growth rate；feed conversion rate

水蛭Hirudo nipponica，是《中國藥典》2015年版動物藥材水蛭的基原動物之一，《中國動物志》稱日本醫(yī)蛭，常年棲息于水田及其與之相通的溝渠中 [1]。作為一種吸血蛭類，水蛭具有較好的抗凝血酶活性[2-3]，已廣泛用于除瘀血、膿血、毒血等傳統(tǒng)中醫(yī)治療及顯微外科手術、心腦血管疾病等治療[4-6]。但由于水蛭棲息環(huán)境的惡化及過度捕撈，水蛭的野外種群數量急劇減少，無法滿足日益增長的市場需求[7]。因此，研究水蛭的相關生物學特性已迫在眉睫。目前，關于水蛭的研究主要集中在活性成分、遺傳學等方面[8-10]，對水蛭生長、攝食的研究還相對較少。本試驗將考察溫度、密度、投喂周期對水蛭的生長性能、攝食性能的影響，以期為以后的人工飼養(yǎng)提供科學的理論依據。

1 材料

實驗用水蛭采集于遼寧大連地區(qū)，經中國科學院水生生物研究所動物學專家楊潼鑒定為無吻蛭目醫(yī)蛭科動物日本醫(yī)蛭H.nipponia。實驗用水使用前已經過曝氣處理，實驗期間所有水蛭均用新鮮牛血投喂。

FPG3型三溫區(qū)可編程光照培養(yǎng)箱（寧波萊福科技有限公司），奧克丹多參數水質分析儀（奧克丹科技有限公司），WT-1002高精度電子天平（杭州萬特衡器有限公司），高精度溫度計。

2 方法

2.1 溫度對水蛭生長、攝食、存活的影響 選取0.19 g、活性較好、表面無傷痕的水蛭，共設置6個溫度組，溫度分別為18，22，26，30，34，38 ℃。密度為50條/L，投喂間隔為5 d，每個實驗組3個重復。將放有水蛭的塑料瓶放入可調節(jié)溫度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱置于有自然光散射的房間內。初始溫度均設置成22 ℃，待水蛭適應5 d后，按照2 ℃·d^-1的速率將各瓶子水體溫度升高或降低到實驗設置溫度。

2.2 密度對水蛭生長，攝食，存活的影響 選取0.15 g，活性較好，表面無傷痕的水蛭，共設置5個密度組，分別為30，60，120，180，240條/L。實驗在室溫下進行，水溫變化為17.6～23.5 ℃，光照為自然光，投喂間隔為5 d。每個實驗組3個重復。

2.3 投喂周期對水蛭生長、攝食、存活的影響 選取0.18 g、活性較好、表面無傷痕的水蛭，共設置4個投喂周期組，投喂周期分別為2，5，10，20 d。密度為50條/L，實驗在室溫下進行，水溫變化范圍為17.6～23.5 ℃，光照為自然光，每個實驗組3個重復。

2.4 抗凝血酶活性測定 實驗結束后的第8天，從各試驗組中隨機挑選適量的水蛭，置于陽光下曬干。根據《中國藥典》2015年版中的方法進行測量[11]。

將水蛭干品磨成粉，過3號篩。精確稱量1 g粉末放入燒杯中，在燒杯中加入5 mL，濃度為0.9%的氯化鈉溶液。靜置30 min，期間每隔10 min用玻璃棒將混合物攪拌1次；將上清液倒入試管中（8 mm×38 mm），離心10 min。離心后將100 μL上清液和200 μL 包含0.5%纖維蛋白原（以固體計算）的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液（需要時再配置）精確加入玻璃試管中，搖勻，水浴5 min。水浴后將凝血酶溶液（40 U· mL^-1）逐滴加入玻璃試管中，每分鐘加1次，每次加5 μL，整個過程始終保持在水浴箱（37±5） ℃中進行；邊滴加邊輕輕搖勻，直至玻璃管內的溶液凝固。記錄消耗的凝血酶溶液體積，并計算水蛭抗凝血酶活性（U）。

式中，U代表每1 g水蛭抗凝血酶活性；C₁代表凝血酶溶液濃度（U·mL^-1）；C₂代表樣品溶液濃度（g·mL^-1）；V₁代表凝固狀態(tài)時消耗的凝血酶溶液體積（μL）；V₂代表加入到試管中的樣品溶液體積（μL）。

2.5 日常管理 所有水蛭均投放于塑料瓶中，用膠圈將80目的過濾網套在瓶口上，以防止水蛭逃跑。實驗周期為60 d，每天清洗瓶子并換水，以保證水體清潔。需要注意的是，溫度實驗中換水時需將溫差控制在±1 ℃。每次投喂足夠量的新鮮牛血，每次喂食后記錄喂食數據；每天巡查各塑料瓶，發(fā)現死亡的水蛭及時移到瓶外，并記錄存活率；最后一次投喂后的第5 天稱末體重。

2.6 參數計算 本研究從增重率（weight gain rate）、特定增長率（specific growth rate）、單條進食總量（total weight of food consumed）、餌料系數（feed conversion rate）、存活率（survival rate）等5個方面來考察溫度、密度、投喂周期對水蛭生長和攝食的影響。

增重率（WGR） =（末體重-初始體重）/初始體重×100%

特定增長率（SGR）=（L_n末體重-L_n初始體重）/試驗周期×100%

單條進食總量（TWFC）= 水蛭進食總量/水蛭條數

餌料系數（FCR）=單條進食總量/（末體重-初始體重）

存活率（SR）=試驗結束時剩余條數/投放條數×100%

實驗結果均采用SPSS 19.0 進行單因素方差分析，不同組間采用Duncan法比較差異，顯著性水平設置為P<0.05。

3 結果

3.1 溫度對水蛭生長、攝食、存活及抗凝血酶活性的影響 當溫度在18～26 ℃時，水蛭末體重、增重率、特定增長率均隨著溫度的升高而升高，當溫度超過26 ℃后，又隨著溫度的升高而降低。當溫度為26 ℃時，末體重、增重率、特定增長率顯著高于其他溫度試驗組（P<0.05）（表1）?；貧w分析表明，特定增長率與溫度之間存在顯著二次函數關系（P<0.05），且回歸方程為y=-0.016 5x²+0.836 9x-6.847 5（R²=0.990 8）。從回歸方程可知，當溫度為25.36 ℃時，水蛭特定增長率最大，達到3.76。

餌料系數先隨著溫度的升高而降低，當溫度超過26 ℃時，隨著溫度升高，餌料系數呈上升趨勢（表1）。當溫度介于22～30 ℃，水蛭單條進食總量無差異，且顯著高于18，34 ℃實驗組（P<0.05）。

當溫度介于18～30 ℃時，存活率較高，均達到85%以上，且相互之間無顯著差異（P<0.05）。當溫度高于30 ℃時，隨著溫度升高，存活率急劇下降，當溫度為38 ℃時，水蛭在實驗過程中全部死亡。當溫度為34 ℃時，抗凝血酶活性最大，顯著高于18，22，26，30 ℃（P<0.05）

3.2 密度對水蛭生長、攝食、存活及抗凝血酶活性的影響 水蛭的末體重、增重率、特定增長率均隨著密度的增大而減小，且低密度組（30，60條/L）的末體重、增重率、特定增長率顯著高于高密度組（120，180，240條/L）（P<0.05）。當密度為30條/L時，水蛭的特定增長率達到最大值，為3.65（表2）。

餌料系數隨著密度的增加而增大，低密度組（30條/L）的存活率能達到90%以上，且顯著高于其他試驗組（P<0.05）。240條/L密度組抗凝血酶活性最大，達到131.05 U·g^-1，與180條/L無顯著差異（P<0.05），且顯著高于30，60，120條/L密度組（P<0.05）。

3.3 投喂周期對水蛭生長、攝食、存活及抗凝血酶活性的影響 末體重、增重率、特定增長率均隨著投喂周期的增大而呈現下降的趨勢（表3），且相互之間差異顯著（P<0.05）?；貧w分析表明，投喂周期與特定增長率之間存在著顯著負相關關系（P<0.05），且線性方程為：y=-0.094 1x+3.832 9（R²=0.992 7）。單條進食總量隨著投喂周期的增大而呈現下降趨勢，投喂周期對水蛭存活率無影響?？鼓富钚噪S著投喂周期的增加而增加，投喂周期為20 d時，抗凝活性最大，顯著高于其他試驗組（P<0.05）。

4 討論

4.1 溫度對水蛭的影響 水體溫度作為一個重要的環(huán)境因子，對水生動物的生長、發(fā)育、存活具有重要影響[12-13]。不同水溫會導致水生生物在代謝率、生理活動方面存在差異[14-15]，進而影響其生長、攝食及蛋白質合成等。本研究中，在18～26 ℃，水蛭末體重、增重率、特定增長率均隨著溫度的升高而升高，當溫度超過26 ℃后，水蛭末體重、增重率、特定增長率均隨著溫度的升高而呈現出降低的趨勢。劉鑒毅等[16]在研究中指出，水生動物生長和溫度之間通常存在多元回歸方程關系?；貧w分析表明，水蛭特定增長率與溫度之間呈二次函數關系，經計算可知，當溫度為25.36 ℃時，水蛭的特定增長率最大，達到3.76。當溫度介于22～26 ℃時，水蛭的單條進食總量較高；當溫度超過26 ℃時，單條進食總量隨著溫度的升高而降低。實驗期間可觀察到，當溫度介于22～26 ℃時，水蛭活性較好，當水體溫度為18 ℃時，水蛭大多沉于瓶底、行動緩慢，耗能較少，且食欲較低。當水體溫度達到34 ℃時，水蛭活動過于頻繁，可能處于不適狀態(tài)，該溫度可能超出水蛭最適生長溫度，從而導致攝食率降低[17]。

餌料系數，即餌料用量與體重增量的比值，比值越低，說明增加單位體重所用餌料的量越小。本研究中，餌料系數隨著溫度的升高呈現先降低后升高的趨勢，并在26 ℃達到最低。有研究表明，在一定溫度范圍內，水生動物的消化酶活性隨著溫度升高而上升，當溫度超過最適溫度后，呈下降趨勢[18-19]；因此可推測水蛭在26 ℃時酶活性較好使得消化速度加快、食物轉換效率較高，從而導致在進食量無差異的情況下，水蛭在26 ℃時的生長較22，30 ℃好。關于溫度對水蛭消化系統(tǒng)酶活性的影響還需進一步研究。

本研究中，溫度對存活率的影響較為顯著，當溫度超過30 ℃時，水蛭的存活率顯著下降。溫度為34 ℃時，60 d后水蛭存活率不足一半，僅為46.67%；當溫度達到38 ℃時，水蛭在實驗過程中全部死亡。說明此溫度段已超出水蛭能耐受的高溫范圍。楊潼[1]在《動物志》一書中記載，水蛭耐高溫能力較差，高溫暴曬即可致死。與本研究結果相符。18～30 ℃，水蛭存活率無顯著差異，均達到85%以上。據野外考察所知，水蛭在我國分布較廣，北起東北各省南至兩廣地區(qū)均有發(fā)現，因此水蛭對低溫耐受力較強，關于其耐受低溫還需進一步研究。

在適宜生長溫度范圍內，水生動物的生長率會隨著溫度的升高而升高，當環(huán)境溫度超過最適生長溫度范圍后，水生動物生長逐漸減緩、甚至停滯[20]。本研究中，當溫度介于22～26 ℃時，水蛭生長相對較快、增重相對較大、存活率較高，同時在該溫度范圍內，水蛭抗凝血酶活性達到《中國藥典》2015年版標準。綜上所述，22～26 ℃為最適生長溫度。此研究結果與溫度對螞蟥生長影響研究的結果基本一致[21]。

4.2 密度對水蛭的影響 養(yǎng)殖密度對水生動物的生長發(fā)育、生存有著重要的影響[22-23]。虹鱒魚在高密度下呈現出較低的生長率[24]；同樣地，隨著密度的增加，雜交鱘幼魚生長減緩[25]。本研究中水蛭生長率隨著養(yǎng)殖密度的增大而減小，與上述研究結果一致。在高密度環(huán)境下，水生動物的生長影響機制較為復雜[26]。本研究中，隨著養(yǎng)殖密度的增加，水蛭的餌料系數也隨之增加。說明在高密度環(huán)境下，水蛭的食物轉換效率較低，從而影響其生長。分析原因可能為：密度對水生動物的生理生化有較大的影響[27]，由于密度過高而發(fā)生的競爭行為會引起機體生理活動加強[28]，所以高密度環(huán)境下的水蛭會消耗更多能量來產生一系列生理生化的變化來適應脅迫壓力，從而生長緩慢。另外，在高密度環(huán)境下，種群內會形成一種“社會階層”，階層的形成會導致處于低階層的個體進食受到影響，進而影響生長[29]。

當密度高于臨界養(yǎng)殖密度時，隨著密度的增大，會產生個體間相互殘殺、疾病的發(fā)生等消極影響[27，30]。本研究高密度組中，不定期會發(fā)現有個體較大的水蛭撕咬個體較小的水蛭，分析原因可能為高密度環(huán)境下“種群脅迫”加劇，個體間相互攻擊的機會增加。當密度為30條/L時，水蛭存活率最大，當密度大于120條/L時，水蛭存活率顯著下降，各密度條件下水蛭抗凝血酶活性均能達到《中國藥典》2015年版標準。因此可推測30～120條/L的密度較適合水蛭生長發(fā)育。

4.3 投喂周期對水蛭的影響 已有研究表明，投喂周期可以顯著影響魚類的生長發(fā)育和餌料利用[31]。星斑川鰈幼魚、銀鯽的生長率均隨著投喂周期的增大而減小[32-33]。本研究中，投喂周期與特定增長率之間存在著顯著負相關關系，隨著投喂周期增大，特定增長率呈下降趨勢。當投喂周期為2～10 d時，各組間餌料系數、存活率無顯著差異，單條進食總量隨投喂周期增大而呈現下降的趨勢，說明攝食不足是引起低投喂頻率組水蛭生長緩慢的主要原因。水蛭耐饑能力較強，其用于消化的盲囊向體兩側伸展占據了大部分體積，食物能在體內存儲。而且水蛭消化道內的消化酶較少，這導致了水蛭的消化與吸收是個緩慢過程，所以水蛭飽食1次能維持生命較長時間[1]，所以各組間存活率無顯著差異。本研究中，隨著投喂周期增大，水蛭抗凝血酶活性隨之增大，且各投喂周期條件下抗凝血酶活性均達到《中國藥典》2015年版標準。因此，生產上建議每隔2～5 d投喂1次水蛭，確保藥材品質的同時，水蛭生長更好。

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[責任編輯 呂冬梅]