董慶霖,董榮真,邢向英,苗佳旭,李玉寬

(河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院,代謝工程實驗室,天津 300130)

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真菌Simplicilliumlanosoniveum抗生素的分離純化和初步表征

董慶霖,董榮真,邢向英,苗佳旭,李玉寬

(河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院,代謝工程實驗室,天津 300130)

以藍藻的共生真菌Simplicilliumlanosoniveum為研究對象,對其代謝產(chǎn)生的抑制革蘭氏陽性菌的抗生素進行發(fā)酵條件的篩選、分離純化和初步表征。通過單因素實驗確定真菌Simplicilliumlanosoniveum產(chǎn)生抗生素的最佳培養(yǎng)基為改良的沙氏培養(yǎng)基:蔗糖30.0 g/L和蛋白胨12.0 g/L;發(fā)酵曲線表明該抗生素的合成與菌體的生長關(guān)系為生長非偶聯(lián)型;通過樣品液的分離純化以及初步表征確定該抗生素在254 nm處有最大吸收峰,以乙腈:0.02 mol/L的碳酸鹽緩沖溶液(體積比為5∶95)為流動相時,其保留時間為4.1031 min,分子量為163.0182;雙縮脲和茚三酮反應(yīng)均呈陰性。該抗生素的發(fā)現(xiàn)為Simplicillium屬的分類提供了理論依據(jù)。

抗生素,Simplicilliumlanosoniveum,純化,表征

抗生素是生物活性物質(zhì)的主要類別。目前發(fā)現(xiàn)的12 000種抗生素大約有30%來自真菌[1],并且主要集中在絲狀真菌的曲霉屬、青霉屬和頭孢霉屬[2],但是對青霉屬和頭孢屬的近親Simplicillium屬[3]的研究相對較少。

Simplicilliumlanosoniveum作為Simplicillium屬中的一大類,通常以寄生真菌和昆蟲病原真菌的身份出現(xiàn)在人們的視野中[4-5]。有關(guān)Simplicillium屬的研究和報道也主要集中在大豆銹病菌的生物防治方面[6-8],但是對其在抗菌活性方面的研究鮮有報道。目前已發(fā)現(xiàn)的Simplicillium屬中的抑真菌化合物主要有:simplifungin[9]、simplicilliumtides[10]和二酮哌嗪生物堿[11];S.lanosoniveum產(chǎn)生的抗生素主要有:吡咯烷生物堿preussin B[12]和苦參堿[13]。

本文所使用的真菌DT06(Simplicilliumlanosoniveum)[14-15]是從藍藻培養(yǎng)液中分離得到的一株Simplicillium屬的共生真菌。據(jù)研究報道,該菌株代謝產(chǎn)生的抗生素對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌等革蘭氏陽性菌具有較強的抑制作用,而對大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌等革蘭氏陰性菌無抑制作用[15]。因此,本文通過對該抗生素合成條件中最佳碳氮源的篩選和其代謝過程的簡單分析,應(yīng)用大孔樹脂和離子交換樹脂層析對該抗生素進行了分離純化,應(yīng)用紫外可見掃描光譜、高效液相色譜、質(zhì)譜、茚三酮和雙縮脲實驗對該抗生素進行初步表征。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

真菌DT06(Simplicilliumlanosoniveum) 中國科學(xué)院微生物研究所菌物標本館保藏,保藏編號為HMAS 242045(北京,中國);金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) 由河北工業(yè)大學(xué)生物工程系菌種保藏室提供;PDA培養(yǎng)基 土豆200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1000 mL;沙氏培養(yǎng)基 葡萄糖40 g、蛋白胨10 g、蒸餾水1000 mL;LB培養(yǎng)基 蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、蒸餾水1000 mL、pH為7.0;大孔樹脂CT-12和離子交換樹脂 D301T南開合成公司；頭孢菌素C的鋅鹽標樣 Sigma公司(美國);乙腈、乙醇和其他試劑 金海華星生物科技有限公司。

表1 質(zhì)譜條件Table 1 Parameters of mass spectrometric analysis

HZQ-QG型臥式空氣恒溫振蕩器 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;Model 868 pH計 上海Thermo公司;CARy300型紫外光譜分析儀 上海精科儀器廠;Agilent-1200高效液相色譜 美國Agilent公司;Bruker-6310質(zhì)譜儀 Bruker公司。

1.2 發(fā)酵條件

將菌株DT06通過斜面劃線法接種于新鮮的PDA培養(yǎng)基上,于25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。在無菌條件下配成孢子懸浮液后接種于液體沙氏培養(yǎng)基中,于25 ℃、120 r/min條件下在回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖床里培養(yǎng)36 h,制成種子液。

取80 μL種子液接種到含有80 mL液體沙氏培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,25 ℃、120 r/min培養(yǎng)7 d,同時做兩組平行實驗。

1.3 碳源和氮源的篩選實驗

以液體沙氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行最優(yōu)碳源和氮源的篩選實驗。

碳源:葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、淀粉,濃度:40 g/L。

氮源:硝酸鈉、硝酸銨、尿素濃度、酵母膏、蛋白胨,濃度:10 g/L。

篩選出該抑真菌劑的最適碳氮源后,醇沉除去多糖[16],于最適條件下測量真菌DT06液態(tài)發(fā)酵過程中生物量[16]、殘?zhí)荹17]、pH以及抑菌圈大小[18]的變化曲線。

1.4 抗生素的分離與純化

將發(fā)酵液經(jīng)過離心(8000 r/min,10 min,4 ℃)除去菌體,取上清液,加入2倍體積無水乙醇,充分攪拌,靜置2 h,離心,除去析出的雜多糖與雜蛋白,旋蒸除去乙醇。

將預(yù)先經(jīng)過鹽酸、氫氧化鈉和去離子水處理過的大孔樹脂CT-12濕法裝入玻璃柱(2 cm×30 cm)中。使所得的樣品粗提液緩慢流經(jīng)離子交換樹脂進行動態(tài)吸附和解吸實驗:吸附床體積(BV)為31.4 mL,流速為0.8 mL/min,選用體積分數(shù)為50%～100%的乙醇溶液作解吸劑,流速1.0 mL/min。將不同濃度的乙醇洗脫液進行旋蒸,除去乙醇,再將樣品稀釋至初始發(fā)酵液的濃度,進行抑菌性實驗,觀察抑菌圈大小并記錄數(shù)據(jù)。比較抑菌圈直徑的大小,以確定目標產(chǎn)物的回收率R。

式(1)

式(1)中:a為純化液抑菌圈直徑,mm;b為原始發(fā)酵液抑菌圈直徑,mm。

由于真菌DT06發(fā)酵液呈現(xiàn)淡黃色,因此我們采用乙酸預(yù)處理過的弱堿性陰離子交換樹脂D301T靜態(tài)吸附除去樣品液中的色素,并比較去除色素前后樣品液的抑菌活性。

將得到的上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾處理,備用。

1.5 抗生素紫外可見掃描檢測

將經(jīng)過離子交換樹脂層析所得樣品純化液用蒸餾水稀釋,使用紫外可見掃描分光光度計在200～800 nm范圍內(nèi)進行掃描,確定其最佳吸收波長。

1.6 抗生素的液相色譜分析

采用Agilent-1200高效液相色譜儀。

條件參數(shù):C18(Kromasil)色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈和0.02 mol/L碳酸鹽緩沖溶液(pH為7.5),流速為1.0 mL/min;進樣量:20 μL;柱溫:25 ℃。在上述分析條件下確定檢測該抗生素的最佳流動相比例。

建構(gòu)良好國家形象是時代發(fā)展的需要。國家形象是一個國家在人們頭腦中的存在，是大多數(shù)人認識這個國家的起點，這些認識一旦形成普遍共識又會轉(zhuǎn)化為這個國家的國家形象本身。全球化時代，一個國家的發(fā)展是在與越來越多的國家、組織、個人的交往中實現(xiàn)的，而國家形象在很大程度上決定著交往的可能性、廣泛性和合意性。國家形象已經(jīng)成為影響國際關(guān)系和交往的重要因素，成為國家利益的重要內(nèi)容。建構(gòu)良好的國家形象，對于促進國家發(fā)展、維護國家安全、增強綜合國力和國際競爭力意義重大。

1.7 雙縮脲和茚三酮實驗

雙縮脲顯色實驗[19]檢測抗生素是否為多肽類物質(zhì)或者含有酰胺鍵;茚三酮顯色實驗[20]檢測抗生素結(jié)構(gòu)中是否含有-NH2和-COOH。

1.8 抗生素的液質(zhì)聯(lián)用分析

采用Agilent-1200高效液相色譜儀和Bruker-6310質(zhì)譜儀;

液相條件:同1.6;質(zhì)譜條件:見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源和氮源篩選實驗

圖1 碳氮源對真菌DT06生物量和抗生素合成的影響Fig.1 The influence of carbon and nitrogen sources on fungus DT06 biomass and antibiotic synthesis注:A:碳源;B:蔗糖濃度;C:氮源;D:蛋白胨濃度。

如圖1所示,蔗糖是該抗生素合成的最佳碳源,最適濃度為30 g/L。在此條件下,真菌DT06的生物量和抑菌活性均高于其他實驗組,生物量和抑菌圈直徑最大值分別為22.5 mm和8.05 g/L。蛋白胨是該抗生素合成的最佳氮源,當?shù)鞍纂藵舛葹?2 g/L時,抑菌圈直徑和生物量均達到最值,分別為23.5 mm和8.3 g/L。在酵母膏、蛋白胨這兩種有機氮源上真菌DT06生物量較高,但是在無機氮源(硝酸鈉、硝酸銨和尿素)上長勢不好,并且?guī)缀鯔z測不到抗菌活性。因此,有機氮源利于該抗生素的合成,并且可能主要是通過增加菌體的生物量而增加目標產(chǎn)物的產(chǎn)量。

如圖2所示,在發(fā)酵初期真菌DT06處于一個緩慢適應(yīng)環(huán)境的生長遲緩期,碳源消耗緩慢,大約60 h后開始進入指數(shù)期。在110 h左右菌體達到穩(wěn)定期,碳源(蔗糖)耗盡,生物量達到相對穩(wěn)定值?？股卦谥笖?shù)期后期(約100 h)開始合成,并在140 h左右抑菌圈和生物量達到最大值,分別為24 mm和8.3 g/L。由發(fā)酵曲線趨勢可知,該抗生素的合成與菌體的生長關(guān)系為生長非偶聯(lián)型。在整個發(fā)酵過程中,pH雖略有上升,但幾乎保持恒定,最后穩(wěn)定在6.2左右,這說明在菌體的發(fā)酵過程中有機酸的產(chǎn)量很少或幾乎沒有。

圖2 菌株DT06的生物量、還原糖、 抑菌活性以及pH的變化曲線Fig.2 Time courses of biomass,reducing sugar, antibacterial activity and pH of strain DT06

2.3 抗生素的分離與純化

發(fā)酵液經(jīng)大孔樹脂CT-12吸附后,吸附余液抑菌圈直徑為7 mm,如圖3a所示,幾乎檢測不到抑菌活性,說明大孔樹脂CT-12對該抗生素表現(xiàn)出良好的吸附性能。將不同濃度的乙醇洗脫液分別稀釋至初始發(fā)酵液濃度后,95%乙醇的洗脫液抑菌圈直徑最大,為21 mm(圖3b),說明95%的乙醇對該抗生素表現(xiàn)出良好的解析能力。因為初始發(fā)酵液抑菌圈直徑為24 mm,所以,經(jīng)式(1)計算可得大孔樹脂柱層析分離純化得到的抗生素回收率R高達87.5%(圖4)。

圖3 大孔樹脂CT-12吸附實驗結(jié)果Fig.3 The results of absorption on macroporous resins CT-12注:a:大孔樹脂吸附余液抑菌活性; b:95%乙醇洗脫液的抑菌活性。

圖4 乙醇濃度對抗生素回收率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the antibiotic recovery rate

如圖5所示,樣品液經(jīng)離子交換樹脂D301T吸附處理后,淡黃色液體變?yōu)闊o色,可知D301T可以有效去除真菌DT06發(fā)酵液中的淡黃色色素。

圖5 色素去除前后樣品液Fig.5 Solutions before and after removing of pigments注:a:除色素之前的樣品液;b:除色素之后的樣品液,圖6同。

將去除色素前后的樣品液分別進行抑菌性實驗,結(jié)果如圖6所示,可知色素去除前后樣品液的抑菌活性幾乎沒有變化,同時也驗證了真菌DT06代謝產(chǎn)生的淡黃色色素不是抗生素。

圖6 除色素前后的樣品液的抑菌性圖片F(xiàn)ig.6 Antibacterial activity of solutions before and afterremoving of pigments

2.4 抗生素紫外可見掃描檢測分析

抗生素溶液紫外可見掃描結(jié)果如圖7所示,抗生素水溶液在254 nm有特征吸收峰,故高效液相色譜檢測波長采用254 nm。

圖7 抗生素的紫外可見吸收掃描光譜圖Fig.7 Ultraviolet visible spectrum of antibiotic

圖8 抗生素的液相色譜圖Fig.8 HPLC chromatogram of antibiotic

2.5 抗生素的高效液相色譜分析

高效液相色譜分析過程中根據(jù)該物質(zhì)的極性來選擇合適的流動相。通過多次調(diào)整流動相及其組成,最終確定乙腈:0.02 mol/L碳酸鹽緩沖溶液(體積比為5∶95)的分離效果最佳。

如圖8所示,在該色譜圖4.1 min左右出現(xiàn)一個信號強烈的單峰,峰形較好,分離度高,表明該抑菌性物質(zhì)在254 nm處信號較強,在反相C18色譜柱中保留時間較短說明該物質(zhì)極性高。

2.6 雙縮脲和茚三酮實驗

如圖9所示抗生素純化液的雙縮脲實驗結(jié)果呈現(xiàn)陰性,表明該抗生素是非肽類物質(zhì)。

圖9 雙縮脲實驗結(jié)果Fig.9 The results of biuret tests注:a:樣品液;b:低濃度酪蛋白溶液;c:高濃度酪蛋白溶液。

與雙縮脲實驗結(jié)果一致,茚三酮實驗結(jié)果(圖10)呈現(xiàn)陰性,表明該抗生素的結(jié)構(gòu)中缺少-NH2和-COOH。

2.7 抗生素的質(zhì)譜分析

圖11是保留時間為4.1 min化合物的質(zhì)譜圖。在2.5確定的液相條件及正離子電離條件下,質(zhì)譜圖中出現(xiàn)兩個主要的離子峰,m/z分別為150.9696和192.9791,根據(jù)質(zhì)譜系統(tǒng)分析報告(表2)可得該抗生素的[M+H]+為163.0182,

表2 抗生素的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析報告Table 2 Report of antibiotic mass spectra analysis

圖10 茚三酮實驗結(jié)果Fig.10 The results of ninhydrin tests注:a:抗生素樣品液;b:頭孢菌素C鋅鹽標準溶液。

圖11 抗生素的質(zhì)譜分析Fig.11 Mass spectrum of antibiotic

說明該物質(zhì)為小分子化合物。值得注意的是,實驗過程中使用碳酸鹽緩沖溶液不僅可以調(diào)節(jié)流動相的pH,并且使得分析檢測靈敏度高、特異性強。

3 結(jié)論與討論

真菌DT06發(fā)酵液對革蘭氏陽性菌的抑制作用,為Simplicilliumlanosoniveum產(chǎn)生抗生素提供了可能。在本文中,我們得到該抗生素與菌體的關(guān)系為生長非偶聯(lián)型,最適培養(yǎng)基為改良的沙氏培養(yǎng)基(蔗糖30.0 g/L和蛋白胨12.0 g/L),通過大孔樹脂CT-12和95%乙醇對抗生素進行了分離,隨后用酸化的離子交換樹脂D301T除去淡黃色色素。紫外可見光譜分析表明該抗生素在254 nm處有強烈吸收峰。陰性雙縮脲和茚三酮實驗結(jié)果表明該抗生素中缺少-NH2和-COOH。較短的液相保留時間和質(zhì)譜分析說明該抗生素的分子量較小(163.0182),極性較強。因此,初步研究分析和抑菌性實驗結(jié)果表明,該抗生素是一個含有較多不飽和鍵的小型非肽類物質(zhì)。

由于該抗生素的分子量、理化性質(zhì)和生物活性的不同,因此我們認定該抗生素是一個新型抗生素,不同于Simplicillium屬已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的生物活性代謝產(chǎn)物吡咯烷生物堿preussin B,苦參堿和Aogacillins A and B[12-13,21]。由于Simplicilliumlanosoniveum與藍藻共生,它代謝產(chǎn)生的抗生素只對革蘭氏陽性菌有抑制作用,而藍藻屬于革蘭氏陰性菌,因此該抗生素可以保護藍藻不受革蘭氏陽性菌的侵害,并且有助于解釋光能自養(yǎng)型和非自養(yǎng)型微生物在水生生態(tài)系統(tǒng)中的復(fù)雜關(guān)系。Zare等[3]曾提出Simplicilliumlanosoniveum與Cephalosporiumlanosoniveum同種異名,但是Cephalosporium屬和Simplicillium屬的分類仍存在爭議,所以該抗生素的發(fā)現(xiàn)豐富了來自于S.lanosoniveum的天然活性產(chǎn)物,可為Simplicillium屬的分類提供理論依據(jù)。

[1]Pandey A,Kumar S. Antibiotic activity of antimicrobial metabolites produced from soil microorganisms:an overview[J]. International Journal of Pharmaceutical Research & Allied Sciences,2015,4(4):28-32.

[2]Elander RP. Industrial production ofβ-lactam antibiotics[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2003,61(5-6):385-392.

[3]Zare R,Gams W. A revision ofVerticilliumsection Prostrata. IV. The generaLecanicilliumandSimplicilliumgen. nov[J]. Nova Hedwigia,2001,73(1/2):1-50.

[4]Chen RS,Huang CC,Li JC,et al. First report ofSimplicilliumlanosoniveumcausing brown spot onSalviniaauriculataandS.molestain Taiwan[J]. Plant Disease,2008,92(11):1589-1589.

[5]Baiswar P,Ngachan S,Rymbai H,et al.Simplicilliumlanosoniveum,a hyperparasite onAecidiumelaeagni-latifoliae in India[J]. Australasian Plant Disease Notes,2014,9(1):1-5.

[6]Ward N,Robertson C,Chanda A,et al. Effects of Simplicillium lanosoniveum onPhakopsorapachyrhizi,the soybean rust pathogen,and its use as a biological control agent[J]. Phytopathology,2012,102(8):749-760.

[7]Gauthier NW,Maruthachalam K,Subbarao KV,et al. Mycoparasitism ofPhakopsorapachyrhizi,the soybean rust pathogen,bySimplicilliumlanosoniveum[J]. Biological Control,2014,76:87-94.

[8]Shen XY,Zheng DQ,Gao J,et al. Isolation and evaluation of endophytic fungi with antimicrobial ability from Phyllostachys edulis[J]. Bangladesh Journal of Pharmacology,2012,7(4):249-257.

[9]Uchida R. Simplifungin,a new antifungal antibiotic produced bySimplicilliumminatenseFKI-4981,San Diego,January 11-14,2015[C]. Natural Product Discovery & Development in the Post Genomic Era. 2015.

[10]Liang X,Zhang XY,Nong XH,et al. Eight linear peptides from the deep-sea-derivedfungusSimplicilliumobclavatumEIODSF 020[J]. Tetrahedron,2016,72(22):3092-3097.

[11]Yan BF,Fang ST,Li WZ,et al. A new minor diketopiperazine from the sponge-derived fungusSimplicilliumsp. YZ-11[J]. Natural Product Research,2015,29(21):2013-2017.

[12]Fukuda T,Sudoh Y,Tsuchiya Y,et al. Isolation and biosynthesis of preussin B,a pyrrolidine alkaloid fromSimplicilliumlanosoniveum[J]. Journal of Natural Products,2014,77(4):813-817.

[13]余永濤,何生虎,趙清梅. 寧夏苦豆子中產(chǎn)苦參堿內(nèi)生真菌的分離與鑒定[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,46(13):2643-2654.

[14]Dong QL,Lin TY,Xing XY,et al. Identification of a symbiotic fungus from blue-green alga and its extracellular polysaccharide[J]. Letters in Applied Microbiology,2014,58(4):303-310.

[15]董慶霖,陳博,邢向英,等. 一株藍藻內(nèi)生真菌的鑒定及其產(chǎn)物抑菌活性[J]. 化工學(xué)報,2011,62(6):1656-1661.

[16]邢向英,陳敬宇,董慶霖,等. 真菌Simplicilliumlanosoniveum胞外多糖合成條件的優(yōu)化及其動力學(xué)分析[J]. 食品工業(yè)科技,2016,18(37):185-191.

[17]毛善巧,楊鋒,黃永春. 基于高效液相色譜法分析水力空化對蔗糖的影響[J]. 食品工業(yè)科技,2017,38(1):189-192,199.

[18]董慶霖,管瑞靜,邢向英,等. 一種抑菌性色素的分離表征及合成條件的優(yōu)化[J]. 現(xiàn)代化工,2016,36(8):96-100.

[19]Yang QH,Zhao XX,Zhang J,et al. Components of a bioflocculant for treating tannery wastewater[J]. Journal of Residuals Science & Technology,2015,12(2):99-103.

[20]Chen CC,Yu YC,Lee HC,et al. Latent fingerprint development on thermal paper using traditional ninhydrin and 1,2-indanedione[J].Journal of Forensic Sciences,2016,61(1):219-225.

[21]Takata K,Iwatsuki M,Yamamoto T,et al. Aogacillins A and B produced bySimplicilliumsp. FKI-5985:new circumventors of arbekacin resistance in MRSA[J]. Organic Letters,2013,15(18):4678-4681.

Isolation,purification and preliminary characterization ofantibiotic fromSimplicilliumlanosoniveum

DONG Qing-lin,DONG Rong-zhen,XING Xiang-ying,MIAO Jia-xu,LI Yu-kuan

(School of Chemical Engineering and Technology,Hebei University of Technology,Tianjin 300130,China)

The cyanobacterium-symbiotic fungusSimplicilliumlanosoniveumwas used as materials,and the objective of this study was to optimize the culture condition,purify and characterize a novel antibiotic which exhibitied antibacterial activity against the gram-positive bacteria fromSimplicilliumlanosoniveum.The suitable medium for this antibiotic production was the modified sabouraud medium containing sucrose 30 g/L and peptone 12 g/L and antibiotic production ofSimplicilliumlanosoniveumwas non-growth-associated. This antibiotic displayed a characteristic absorption peak at 254 nm.The molecular weight of this antibiotic was 163.0182 with a retention time of 4.1031 min when the mobile phase of this antibiotic was a 0.02 mol/L carbonate buffer(pH7.5)containing 5% acetonitrile.Biuret and ninhydrin tests of this antibiotic were negative.The founding of this antibiotic provide the feasibility for the classification ofSimplicilliumlanosoniveum.

antibiotic;Simplicilliumlanosoniveum;purification;characterization

2017-02-14

董慶霖(1964-)，男，博士，教授，研究方向：代謝工程，E-mail：qldong@hebut.edu.cn。

河北省自然科學(xué)基金項目(B2008000029)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)13-0119-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.022