馬良，徐延鈞，李丹，郭步平，郭旭霞*

（長治醫(yī)學院附屬和平醫(yī)院1檢驗科，2普外三科，3生殖遺傳中心，長治 046000）

C 20or f54抑制食管癌細胞增殖并促進其凋亡

馬良1，徐延鈞2，李丹3，郭步平1，郭旭霞1*

（長治醫(yī)學院附屬和平醫(yī)院1檢驗科，2普外三科，3生殖遺傳中心，長治 046000）

目的觀察過表達C20orf54對食管癌細胞周期和凋亡的影響，探討C20orf54基因在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法應用免疫組織化學染色方法檢測C20orf54蛋白在食管癌組織和癌旁正常組織中的表達；應用MTT法和流式細胞術(shù)檢測過表達 C20orf54對食管癌細胞系EC9706細胞增殖能力、細胞凋亡與細胞周期的影響。結(jié)果C20orf54在食管癌組織中免疫反應性顯著低于癌旁正常組織。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達C20orf54的EC9706細胞生長明顯受抑制，且G0/G1期細胞積聚，周期阻滯，細胞凋亡增多。結(jié)論C20orf54 基因可能參與食管癌的生長調(diào)控，食管癌的發(fā)生與C20orf54 基因的表達有關(guān)。

食管癌； C20orf54基因；細胞周期；細胞凋亡

C20orf54基因是人類核黃素轉(zhuǎn)移蛋白2基因（human ribofavin transporter 2，hRFT2），也稱為SLC52A3基因，是近幾年新發(fā)現(xiàn)的與食管癌發(fā)病相關(guān)基因。該基因定位于20p13，其mRNA全長2716 bp（NM_033409.3），共有5個外顯子，編碼一個由469個氨基酸組成的開放閱讀框蛋白。C20orf54被認為在人體吸收核黃素過程中起重要作用。最近有研究發(fā)現(xiàn)，C20orf54基因中多個位點的突變會導致一種罕見的神經(jīng)退行性疾病Brown-Vialetto-Van Laere syndrome（BVVLS）的發(fā)生[1-3]，這些突變導致C20orf54對細胞膜轉(zhuǎn)運定位核黃素的能力失敗，進而體內(nèi)核黃素水平下降。在臨床治療中補充核黃素可以對其中一些BVVLS病人起到很好的療效[4]；將核黃素應用于臨床放化療，可有效緩解黏膜炎癥，對黏膜增生惡化有很好的防治作用[5]。C20orf54基因編碼的蛋白含有11 個跨膜區(qū)，可以特異高效將核黃素轉(zhuǎn)運到細胞中，在食管癌高發(fā)區(qū)實施核黃素強化鹽可以顯著增加機體內(nèi)的核黃素水平，延緩和逆轉(zhuǎn)食管癌前病變的發(fā)展進程，降低食管癌發(fā)病風險[6]。然而，C20orf54在腫瘤，特別是在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機制尚不清楚。本研究在檢測食管癌組織中C20orf54表達水平的基礎(chǔ)上，分析了過表達C20orf54對食管癌細胞株EC9706細胞生長、細胞周期及凋亡等細胞生物學行為的影響，初步探討C20orf54在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

材料與方法

1 主要材料和試劑

臨床標本取自2014年1月至2015年3月在長治醫(yī)學院附屬和平醫(yī)院住院期間經(jīng)手術(shù)病理證實、術(shù)前均未經(jīng)放療、化療及其他治療的58例食管癌患者的食管鱗癌組織及癌旁（距腫瘤邊緣＞3cm）的正常食管黏膜組織，其中男性32例，女性26例，年齡45～70歲。食管鱗癌細胞株EC9706購自中科院北京腫瘤細胞庫。

C20orf54基因引物設(shè)計及構(gòu)建過表達載體pCDNA-C20orf54-Flag由上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司提供?？贵w：兔抗人C20orf54多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司； HRP標記的山羊抗兔IgG購自武漢博士德生物公司。Lipofectam ine 2000 轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司。

2 免疫組織化學染色

組織標本經(jīng)4%的多聚甲醛固定液固定、石蠟包埋、切片（厚度4μm），微波修復法進行進行抗原修復，取500 m l枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）于微波盒中，加熱直至沸騰，切片脫蠟入水后置于耐高溫塑料切片架上。放人己沸騰的緩沖液中，微波繼續(xù)處理15m in，取出微波盒冷卻至室溫，取出玻片。先用蒸餾水沖洗2次，隨后，PBS洗2～3次（各5min），3% H2O2室溫靜置10m in，兔抗C20orf54多克隆抗體（1:500）室溫靜置1h，PBS洗2～3次（各5min），HRP標記的山羊抗兔IgG（1:500）37℃孵育1h，PBS洗3次（各5m in），DAB顯色10m in，PBS洗2次各5m in，蘇木素復染2m in后鹽酸酒精分化，自來水沖洗10m in，脫水，透明、封片后鏡檢。觀察10個高倍視野，Image Proplus軟件統(tǒng)計陽性染色標記細胞的平均光密度。

3 細胞轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達C20orf54細胞株的建立

食管癌細胞株EC9706用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，隔日換液，取對數(shù)生長期細胞備用。轉(zhuǎn)染前 24 h 將細胞接種至 6 孔板，接種量1×106個細胞/孔，轉(zhuǎn)染時匯合度達90%以上，載體與脂質(zhì)體比例為1μg:3μl，空白對照組（EC9706）只轉(zhuǎn)染Lipofectam ine 2000試劑，陰性對照組（EC9706/pCDNA）轉(zhuǎn)染空載體pCDNA-Flag，實驗組（EC9706/C20orf54-Flag）轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCDNA-C20orf54-Flag。轉(zhuǎn)染4～6h后，細胞換含10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染24h后更換含G418（200μg/m l）的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)兩周，待對照細胞全部死亡時基本已得到G418抗性細胞的穩(wěn)定克隆。挑選單個細胞的陽性克隆至24孔板繼續(xù)篩選培養(yǎng)，篩選出的穩(wěn)定株分別為陰性對照組EC9706/pCDNA和實驗組EC9706/C20orf54-Flag。

4 M TT法檢測細胞增殖能力

3組穩(wěn)定細胞傳代培養(yǎng)24h后，分別接種于96孔板（1×103細胞/孔），每組12孔，分別于24h，48h，72h 3個時間點加入20μl MTT試劑，37℃、5% CO2繼續(xù)孵育4h，小心吸出培養(yǎng)液，每孔加入100μl DMSO，充分溶解結(jié)晶，429nm波長下檢測吸光OD值。

5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期和細胞凋亡

細胞周期檢測：穩(wěn)定細胞在6孔板內(nèi)培養(yǎng)48h后，用不含EDTA的0.25%胰酶消化細胞，2000 r/m in離心5m in，棄上清。用預冷的1×PBS洗滌收集的細胞3次，2000r/m in，5m in，棄上清，以0.5 m l 1×PBS重懸細胞，快速加入3.5 m l 70%預冷的乙醇，吹打均勻，4℃儲存過夜。 離心乙醇固定過的細胞，棄上清，1×PBS洗滌細胞3次去除殘留的乙醇，用含有0.2mg RNase A的1m l PI/Triton X-100染色液（20 μg PI/0.1% Triton X-100）重懸細胞， 37℃避光孵育15m in后經(jīng)流式細胞儀檢測，每個實驗重復3次。

Annexin-V-FITC 和 PI雙染法檢測凋亡：取穩(wěn)定細胞培養(yǎng)48h、72h兩個時間點的3組細胞，用不含EDTA的0.25%的胰酶消化細胞，2000r/m in離心5m in，棄上清；用1×PBS洗滌細胞2次，2000r/min離心5m in，棄上清；加入500μl Binding Buf er懸浮細胞后，加入5μl Annexin V-EGFP混勻，再加入5 μl PI，混勻；室溫避光10m in，流式細胞儀檢測細胞凋亡，每個實驗重復3次。

6 統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

1 食管癌組織中C20orf54免疫反應性降低

對58例食管癌組織和癌旁正常組織C20orf54進行免疫組織化學檢測顯示， C20orf54免疫反應陽性產(chǎn)物主要定位在食管鱗狀上皮細胞的胞質(zhì)中（圖1）。Image Proplus分析結(jié)果顯示，癌旁組織C20orf54免疫反應產(chǎn)物的平均光密度為0.30±0.04，而食管癌組織C20orf54免疫反應產(chǎn)物的平均光密度為0.15±0.07，食管癌組織中C20orf54免疫反應性明顯降低。

圖1 食管癌組織C20orf54的免疫組織化學檢測。 A，食管癌組織；B，癌旁組織；箭頭示C20orf54免疫反應產(chǎn)物；比例尺，100μm；C，食管癌組織C20orf54免疫反應性的統(tǒng)計學分析；*，與癌旁組織比較，0.01＜P＜0.05Fig. 1 Immunohistochem ical detection for C20orf54 expression in esophageal cancer tissue. A, esophageal cancer tissue; B, adjacent tissue; arrows indicating C20orf54 immunoreactive products; scale bar, 100μm; C, statistical analysis of C20orf54 immunoreactivity in esophageal cancer tissue; *, 0.01＜P＜0.05, compared w ith adjacent tissue

2 過表達C20orf54抑制EC9706細胞增殖

為了明確C20orf54對食管癌細胞生長增殖的影響，用真核細胞表達質(zhì)粒pCDNA-C20orf54-Flag轉(zhuǎn)染食管癌細胞株EC9706細胞，經(jīng)G418篩選后獲得穩(wěn)定表達C20orf54的細胞株。用MTT分析檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株過表達C20orf54對EC9706細胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示：與空白對照組相比，陰性對照組細胞增殖能力無明顯差異，而過表達C20orf54的細胞增殖能力顯著降低（表1），表明C20orf54對食管癌細胞的增殖具有抑制作用。

表1 過表達C20orf54對EC9706細胞增殖的影響Tab. 1 The ef ect of C20orf54 overexpression on EC9706 cell proliferation

3 過表達C20orf54使EC9706細胞周期阻滯在G0/ G1期

為了明確C20orf54是否調(diào)控食管癌的細胞周期，應用流式細胞術(shù)檢測了過表達C20orf54對EC9706細胞周期的影響。結(jié)果顯示：與空白對照組和陰性對照組比較，過表達C20orf54的細胞，其G0/G1期細胞顯著增多，而S期細胞顯著減少，G2/M期無顯著變化（圖2，表2），由此表明，過表達C20orf54使EC9706細胞周期阻滯在G0/G1期，具有明顯抑制細胞增殖作用。

圖2 過表達C20orf54對EC9706細胞周期的影響。A，空白組；B，陰性對照組；C，實驗組Fig. 2 The ef ect of C20orf54 overexpression on EC9706 cell cycle. A, blank control group; B, negative control group; C, experimental group

表2 過表達C20orf54對EC9706細胞周期的影響Tab. 2 The ef ect of C20orf54 overexpression on EC9706 cell cycle

4 過表達C20orf54促進EC9706細胞凋亡

應用流式細胞術(shù)檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染C20orf54的EC9706細胞凋亡情況，結(jié)果顯示：與空白對照組相比，陰性對照組細胞凋亡率無明顯差異，而實驗組細胞凋亡率顯著升高（圖3，表3）。

圖3 過表達C20orf54對EC9706細胞凋亡的影響。A，空白組；B，陰性對照組；C，實驗組Fig. 3 The ef ect of C20orf54 overexpression on EC9706 cell apoptosis. A, blank control group; B, negative control group; C, experimental group

討 論

食管癌在我國高發(fā)，是惡性腫瘤相關(guān)死亡的重要原因，探究其病因十分重要。C20orf54在人小腸粘膜上皮攝取核黃素的過程中發(fā)揮重要作用[6]，核黃素，即維生素B12，一種水溶性維生素，需要從體外攝取。在人體內(nèi)以黃素單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）形式存在，參與體內(nèi)氧化還原反應，調(diào)節(jié)細胞能量代謝，維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，參與體內(nèi)很多調(diào)控細胞生命活動的化學反應，如碳水化合物、氨基酸、脂肪酸的氧化代謝等。核黃素需要從體外攝入，人體自身不能合成，C20orf54負責體內(nèi)核黃素的吸收和轉(zhuǎn)運。

表3 過表達C20orf54對EC9706細胞凋亡的影響（%，±s）Tab. 3 The ef ect of C20orf54 overexpression on EC9706 cell apoptosis (%,±s)

表3 過表達C20orf54對EC9706細胞凋亡的影響（%，±s）Tab. 3 The ef ect of C20orf54 overexpression on EC9706 cell apoptosis (%,±s)

*，與空白組比較，0.01＜P＜0.05；#與陰性對照組比較，0.01＜P＜0.05*, 0.01＜P＜0.05, compared w ith blank；#, 0.01＜P＜0.05, compared w ith negative control

組別Group Apoptotic rate (%) 48 h 72 h空 白 組Blank control group 5.20±0.74 5.82±1.01陰性對照組Negative control group 5.63±0.82 6.27±0.87實 驗 組Experimental group 13.04±1.53*#14.26±1.77*#

在食管癌高發(fā)區(qū)進行的流行病學調(diào)查和實驗研究表明，核黃素代謝異常是食管癌發(fā)生的重要背景，食管癌高發(fā)區(qū)居民膳食中普遍存在缺乏核黃素的現(xiàn)象。核黃素缺乏可引起皮膚、口腔及食道的炎癥，進而引起食管上皮細胞萎縮、增生等病理變化；核黃素缺乏還會增加食管上皮對亞硝胺等致癌物質(zhì)的敏感性，間接促進食管癌的發(fā)生發(fā)展[7,8]。

本實驗觀察到C20orf54在食管鱗癌組織中表達有所下降。MTT實驗發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定過表達C20orf54的食管癌細胞株EC9706細胞生長明顯受抑；流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定過表達C20orf54的EC9706細胞G0/G1期細胞顯著增多，而S期細胞顯著減少，G2/M期沒有顯著變化，且細胞凋亡率明顯增加。本研究結(jié)果進一步提示了 C20orf54 基因可能參與食管癌的生長調(diào)控。C20orf54基因可抑制細胞生長并促進細胞凋亡，在食管癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著抑癌基因的角色。該研究為進一步尋找食管癌致病因素，建立食管癌高危人群篩查和早期診斷的方法，明確食管癌發(fā)生機制提供了科學依據(jù)。

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C20orf54 inhibits the p roliferation of EC9706 cells and induces their apoptosis

Ma Liang1, Xu Yanjun2, Li Dan3, Guo Buping1, Guo Xuxia1*
(1Clinical Laboratory,2General Surgery Clinic Ⅲ,3Reproductive Medicine Center, Peace Hospital of Changzhi Medical College, Changzhi 046000, China)

ObjectiveTo study the ef ect of C20orf54 overexpression on the cell cycle and apoptosis of EC9706 cell line and to investigate the role of C20orf54 in the occurrence and development of esophageal carcinoma.MethodsThe expression of C20orf54 in esophageal cancer tissue and normal esophageal mucosa was detected by immunohistochem ical staining. The ef ect of C20orf54 overexpression on the proliferative ability, apoptosis and cell cycle of esophageal cancer cell line EC9706 was detected by MTT and fow cytometry.ResultsImmunohistochem ical staining results showed that C20orf54 level was lower in esophageal cancer tissue than in adjacent tissue. MTT and fow cytometry results showed that for those EC9706 cells transfected w ith and stably expressing C20orf54, the grow th was signif cantly inhibited, G0/G1 cells accumulated, the cell cycle was arrested, and apoptosis increased.ConclusionsC20orf54 gene may be involved in the regulation of esophageal cancer development. Esophageal carcinogenesis is related to the expression of C20orf54 gene.

Esophageal carcinoma; C20orf54 gene; cell cycle; apoptosis

R361

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850.2017.03.009

2016-12-07

2017-05-22

長治醫(yī)學院科技創(chuàng)新團隊（CX201405）

馬良，女（1985年），回族，主管檢驗師

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：305983534@qq.com