陸新浩，劉 鴻，任祖伊

(浙江省余姚禽畜病防治研究所,浙江余姚 315400)

體外抗鴨坦布蘇病毒的藥物篩選試驗

陸新浩，劉 鴻，任祖伊

(浙江省余姚禽畜病防治研究所,浙江余姚 315400)

為了探討抗病毒藥物對鴨坦布蘇病毒的作用，選用5種常用的抗病毒藥物(金剛乙胺、脫氧若卡素鈉、病毒靈、利巴韋林、阿昔洛韋)進行體外抗鴨坦布蘇病毒的藥物篩選試驗。結(jié)果表明，利巴韋林藥物濃度為0.156 mg/mL～0.625 mg/mL時，在DF-1細胞中能抑制鴨坦布蘇病毒的增殖、利巴韋林在體外對鴨坦布蘇病毒具有抗病毒作用；而阿昔洛韋、金剛乙胺、脫氧若卡素鈉、病毒靈等4種藥物對鴨坦布蘇病毒無明顯抗病毒作用。

鴨坦布蘇病毒；藥物篩選；鴨

鴨坦布蘇病毒是2010年4月在我國最早報道的一種新型病毒[1]，主要引起種(蛋)鴨產(chǎn)蛋性能急劇下降，一般產(chǎn)蛋率可由產(chǎn)蛋高峰的90%～95%迅速下降到5%～10%，甚至停產(chǎn)，可給養(yǎng)鴨業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失[2]。病原學研究表明，該病毒為單股正鏈RNA病毒，系有囊膜的球形病毒粒子，大小約45～50nm，屬于黃病毒科黃病毒屬的一種新型病毒[3-4]。自2010年4月開始發(fā)現(xiàn)以后，半年內(nèi)該病毒迅速傳遍我國主要養(yǎng)鴨地區(qū)，鴨場一旦感染，鴨群幾乎100%發(fā)病。該病毒傳播極其迅速、感染力強，目前對其傳播媒介、傳播途徑等流行病學情況尚未完全了解，也未見有效的商品化疫苗與抗體可防控該病[5-6]。

目前，因尚無有效防控鴨坦布蘇病毒的高免血清和卵黃抗體，在治療該病時，養(yǎng)殖戶多使用廣譜抗病毒藥與復方抗病毒中草藥進行治療，同時使用抗生素防控細菌繼發(fā)感染。為研究抗病毒藥物對鴨坦布蘇病毒是否具有有效的防控作用，筆者進行了體外抗鴨坦布蘇病毒的藥物篩選試驗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 鴨坦布蘇病毒DF-1細胞適應株C01株[6]，DF-1細胞由浙江大學農(nóng)業(yè)部動物疫病病原學與免疫控制重點開放實驗室提供。DMEM培養(yǎng)液購自Invitrogen公司；胎牛血清購自PAA 公司；FITC 標記的羊抗雞IgG 購自KPL 公司；脫脂奶購自上海光明乳業(yè)；分析純甲醇液體和丙酮液體購自醫(yī)藥公司。DF-1細胞的生長液為加10%胎牛血清的DMEM，維持液為2%胎牛血清DMEM。

1.2 供試藥物 利巴韋林注射液購自江蘇某生物股份有限公司；阿昔洛韋片購自浙江某藥業(yè)股份有限公司；金剛乙胺、脫氧若卡素鈉、病毒靈(嗎啉胍)由浙江義烏某動物藥業(yè)有限公司提供。

1.3 試驗方法

1.3.1 鴨坦布蘇病毒TCID50測定 將生長旺盛的DF-1細胞消化后接種至96孔細胞培養(yǎng)板，置37 ℃，體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待DF-1細胞長成單層后，棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次后加入用細胞維持液10倍系列稀釋的病毒液，其稀釋度分別為10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6；0.1 mL/孔，4孔/每個稀釋度，置培養(yǎng)箱中孵育1 h后棄病毒液，用PBS清洗2次后加入維持液。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4d后觀察細胞病變，記錄細胞病變數(shù)。按Reed-Muench方法計算病毒TCID50。

1.3.2 藥物的細胞毒性測定 待DF-1細胞在96孔細胞培養(yǎng)板上長成單層后，棄培養(yǎng)液后，用PBS洗滌2次，將藥物先用PBS稀釋為5mg/mL，再用細胞維持液倍比稀釋至21～25，將混有藥物的維持液加入細胞培養(yǎng)板中，0.1 mL/孔，每個稀釋度2孔，同時設無藥物對照孔。每d觀察2次，連續(xù)觀察4 d。記錄細胞病變情況，判定對細胞無毒性作用的藥物濃度。

1.3.3 藥物體外抗鴨坦布蘇病毒試驗 待DF-1細胞在96孔板上長成單層后，棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次后，每孔接種100 TCID50的鴨坦布蘇病毒液0.1 mL，37 ℃吸附1 h后棄病毒液，用PBS液洗滌2次，加入從最大無毒濃度開始用細胞維持液倍比稀釋的藥物，每種藥物稀釋為20、21、22、23、24、256種濃度梯度，0.1 mL/孔，每種稀釋度重復4孔。同時設立正常細胞對照，100 TCID50病毒接種細胞對照。將培養(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每d觀察細胞病變，連續(xù)觀察5 d，記錄細胞病變情況。判定藥物對病毒的作用。

1.3.4 間接免疫熒光抗體檢測試驗 按照1.3.3操作步驟獲得的病毒感染細胞，加入含不同濃度利巴韋林的維持培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,傾棄96孔板中培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，每孔加甲醇丙酮等體積混合液150 μL，置-20 ℃冰箱固定20min。傾棄固定液，風機風干， 每孔用200 μL 5%脫脂奶37℃搖床封閉1 h；PBS清洗2次后，加用5%脫脂奶1∶200稀釋雞血清，37℃搖床反應2 h；PBS清洗3次，每孔加5%脫脂奶1∶200稀釋的FITC 羊抗雞IgG 100 μL，37℃搖床反應1 h；PBS清洗5次，加50 μL PBS，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 TCID50測定結(jié)果 按Reed-Muench方法計算鴨坦布蘇病毒C01株第7代的TCID50為10-3.3/0.1 mL。

2.2 藥物的細胞毒性測定結(jié)果 詳見表1。

表1 5種藥物的細胞毒性測定

注：細胞75%以上病變記為+++， 50%病變記為++，25%病變記為+，無病變記為-。

由表1可見，將不同稀釋度的藥物加于細胞維持培養(yǎng)液中與細胞一起培養(yǎng)，連續(xù)觀察4 d，記錄細胞病變情況，5種藥物的最大無毒濃度分別為：阿昔洛韋0.625 mg/mL，利巴韋林0.625 mg/mL，病毒靈0.625 mg/mL，脫氧卡若素鈉0.312 mg/mL，金剛乙胺0.078 mg/mL。

2.3 藥物體外抗病毒試驗結(jié)果 詳見表2。

表2 體外抗病毒試驗

注：細胞病變記為++，無病變記為-。

由表2可見，鴨坦布蘇病毒感染DF-1細胞后加入含不同濃度抗病毒藥的維持培養(yǎng)基，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每d觀察細胞病變情況，5 d后判斷結(jié)果。利巴韋林濃度為0.625 mg/mL～0.156 mg/mL時，細胞未出現(xiàn)病變，與未接毒的細胞對照基本一致(詳見圖1)，加有阿昔洛韋、金剛乙胺、脫氧若卡素鈉、病毒靈的細胞與病毒對照則無明顯差異，細胞圓縮、融合、脫落。結(jié)果表明，利巴韋林濃度為0.156 mg/mL～0.625 mg/mL時，在DF-1細胞上對鴨坦布蘇病毒具抑制病毒生長的作用，而阿昔洛韋、金剛乙胺、脫氧若卡素鈉、病毒靈對鴨坦布蘇病毒無明顯抗病毒作用。

2.4 間接免疫熒光抗體檢測試驗結(jié)果 詳見圖2。

圖1 1利巴韋林處理的感染細胞，2病毒感染的細胞，3 未感染的正常細胞

A：病毒感染后用正常維持培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后；B：病毒感染后用濃度為0.156 mg/mL利巴韋林的維持培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后；C：未感染的正常細胞。圖2 間接免疫熒光檢測利巴韋林處理的細胞

由圖2可見，將含不同濃度利巴韋林的維持液與鴨坦布蘇病毒感染的DF-1細胞一起培養(yǎng)48 h后進行間接熒光抗體檢測，在熒光顯微鏡下可見鴨坦布蘇病毒感染的細胞發(fā)出很強的綠色熒光，而在不同濃度利巴韋林培養(yǎng)基中的感染細胞和正常對照細胞基本未見熒光，其中利巴韋林的最小有效濃度為0.156 mg/mL。結(jié)果表明，利巴韋林能有效抑制鴨坦布蘇病毒在細胞中增殖。

4 小結(jié)與討論

鴨坦布蘇病毒是引起種(蛋)鴨產(chǎn)蛋量迅速下降的一種新型病毒，對該病目前尚無有效的防控措施。為探討5種常用抗病毒藥物對鴨坦布蘇病毒的防控作用，筆者通過體外抗病毒試驗，研究了金剛乙胺、脫氧若卡素鈉、病毒靈、利巴韋林、阿昔洛韋等5種藥物對鴨坦布蘇病毒的抗病毒作用。結(jié)果表明，利巴韋林能有效抑制鴨坦布蘇病毒引起的細胞病變。為了進一步驗證結(jié)果的可靠性，筆者進行了間接免疫熒光檢測，在熒光顯微鏡下明顯可見鴨坦布蘇病毒感染的細胞中含有大量病毒抗原蛋白，而與利巴韋林相互作用的細胞中病毒抗原蛋白表達量很小，利巴韋林確能有效抑制鴨坦布蘇病毒在細胞中增殖。

利巴韋林(Ribavirin)又名病毒唑，是一種廣譜抗病毒藥物，對多種DNA和RNA病毒均有抗病毒作用，通過與RNA聚合酶作用而抑制病毒復制[7]。曾有體外研究報道表明，利巴韋林對黃病毒屬的日本乙型腦炎病毒、登革熱病毒、黃熱病毒及西尼羅病毒具有良好的抗病毒作用[8-10]。也有動物實驗研究表明，利巴韋林對沙粒病毒和裂谷熱病毒感染的小鼠、裂谷熱病毒感染的恒河猴、漢坦病毒感染的乳鼠體內(nèi)具有高度的抗病毒作用[11]。利巴韋林在體內(nèi)對鴨坦布蘇病毒是否具有抗病毒活性還需作進一步的體內(nèi)抗病毒研究試驗。

另外，筆者的試驗結(jié)果表明病毒靈、金剛乙胺、脫氧若卡素鈉、阿昔洛韋等4種藥物對鴨坦布蘇病毒沒有抗病毒活性。

據(jù)此，筆者建議廣大養(yǎng)殖戶及臨床獸醫(yī)在治療鴨坦布蘇病毒病時，不宜使用病毒靈、金剛乙胺、脫氧若卡素鈉、阿昔洛韋這類抗病毒藥物進行治療，以免造成抗病毒藥物的濫用而又達不到治療效果。

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農(nóng)業(yè)部要求大力推進畜牧業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革，推動畜牧業(yè)轉(zhuǎn)型升級，加快建設現(xiàn)代畜牧業(yè)

最近，2017年全國農(nóng)牧漁業(yè)大縣局長輪訓第2期培訓班，生豬調(diào)出大縣畜牧局長班在北京舉辦。農(nóng)業(yè)部領導在開班式上強調(diào)，要深刻認識農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革的重大意義，準確把握農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革目標任務，以大力推進畜牧業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革為主線，以綠色發(fā)展為導向，以結(jié)構(gòu)調(diào)整為重點，培育發(fā)展新動能，協(xié)調(diào)推進保供給、保安全、保生態(tài)各項工作，推動畜牧業(yè)轉(zhuǎn)型升級，加快建設現(xiàn)代畜牧業(yè)。

農(nóng)業(yè)部領導指出，2017年是全面落實“十三五”規(guī)劃的關鍵一年，也是推進畜牧業(yè)發(fā)展結(jié)構(gòu)調(diào)整、轉(zhuǎn)型升級的關鍵一年。推進畜牧業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革，要突出抓好九方面工作：一是加大糧改飼試點力度，調(diào)整優(yōu)化生豬區(qū)域布局，大力發(fā)展現(xiàn)代草牧業(yè)，做大做強優(yōu)勢特色畜牧業(yè)，推進結(jié)構(gòu)調(diào)整。二是抓好畜禽糞污處理和資源化利用，深入開展畜牧業(yè)綠色發(fā)展示范縣創(chuàng)建，積極推廣種養(yǎng)結(jié)合循環(huán)發(fā)展模式，持續(xù)加強草原生態(tài)保護建設，推進綠色發(fā)展。三是進一步研究落實草原改革任務，健全完善以綠色生態(tài)為導向的政策支持體系，加強畜牧業(yè)法制建設，加強政風行風建設，推進支撐保障體系建設。四是大力發(fā)展畜禽標準化規(guī)模養(yǎng)殖，加快奶業(yè)振興發(fā)展，促進飼料工業(yè)轉(zhuǎn)型發(fā)展，建設現(xiàn)代畜禽牧草種業(yè)，強化產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新推廣，推動一二三產(chǎn)融合發(fā)展，提升產(chǎn)業(yè)競爭力。五是強化飼料質(zhì)量安全監(jiān)管，加強飼料質(zhì)量安全風險監(jiān)測，嚴格生鮮乳質(zhì)量安全監(jiān)管，全面推進安全生產(chǎn)，提升質(zhì)量安全水平。六是加強產(chǎn)業(yè)監(jiān)測預警，建立健全草原管理數(shù)據(jù)體系，加強行業(yè)數(shù)據(jù)管理和共享，加強產(chǎn)業(yè)發(fā)展跟蹤研究，提升行業(yè)精準管理水平。七是堅決不放松對高致病性禽流感等重大動物疫病的防控，強化動物防疫監(jiān)督執(zhí)法，維護養(yǎng)殖業(yè)安全。八是加大對人畜共患病防控力度，維護公共衛(wèi)生安全。九是重視做好動物源性食品安全保障工作，維護食品安全。

農(nóng)業(yè)部領導強調(diào)，加快推進畜禽養(yǎng)殖廢棄物資源化處理，是當前推進畜牧業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革和畜牧業(yè)綠色發(fā)展的一項要務。要總結(jié)經(jīng)驗，明確目標，突出重點，切實貫徹綠色發(fā)展新理念，加快補齊現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展的環(huán)境短板，推動現(xiàn)代種業(yè)結(jié)合農(nóng)牧循環(huán)發(fā)展，推進糧飼兼顧、農(nóng)牧結(jié)合、循環(huán)發(fā)展的新型種養(yǎng)結(jié)構(gòu)。

《浙牧》訊

2017-03-17

陸新浩，E-mail：yylxh68@126.com

S858.32

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1005-7307(2017)04-0005-004