程培培禹順英○☆

孤獨癥患者小腦中有氧糖酵解酶的表達(dá)☆

程培培*禹順英*○☆

目的研究孤獨癥患者小腦中有氧糖酵解酶表達(dá)水平及其與孤獨癥發(fā)病的關(guān)系。方法用Western Blotting方法定量檢測8例孤獨癥患者和8名年齡相匹配的對照者尸腦小腦組織中有氧糖酵解酶己糖激酶Ⅰ型及Ⅱ型同工酶（hexokinase isozyme，HK-Ⅰ、HK-Ⅱ）、血小板型磷酸果糖激酶（platelet-type phosphofructokinase，PFKP）、丙酮酸激酶M型同工酶（pyruvate kinase M isozyme，PKM1/2）、丙酮酸激酶M2亞型同工酶（pyruvate kinase M2 isoform，PKM2）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）、丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）及乳酸脫氫酶A型同工酶（lactate dehydrogenase A isozyme，LDHA）的表達(dá)水平。結(jié)果孤獨癥患者與對照相比，小腦中PDH表達(dá)減少[（0.715±0.342）vs.（1.028±0.203），P=0.043]，其他7種有氧糖酵解酶的表達(dá)水平組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論孤獨癥患者小腦中有氧糖酵解途徑PDH表達(dá)減少，可能參與孤獨癥的病理過程。

孤獨癥小腦有氧糖酵解丙酮酸脫氫酶

孤獨癥是一種與社會交往缺陷和行為異常有關(guān)的神經(jīng)發(fā)育障礙。據(jù)統(tǒng)計，目前美國孤獨癥患病率為14.6‰（1:68）[1]。解剖學(xué)、臨床及神經(jīng)影像學(xué)的研究表明，小腦具有維持認(rèn)知功能作用，包括語言功能、執(zhí)行功能及情感調(diào)節(jié)，為孤獨癥受影響的主要腦區(qū)之一[2]。語言能力、工作記憶等認(rèn)知功能缺損程度與小腦容量減少相關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)孤獨癥患者小腦中浦肯野細(xì)胞總數(shù)和密度分別減少25%和24%[4]。而且，孤獨癥患者小腦存在糖代謝減低[5]。由于有氧糖酵解在腦發(fā)育早期糖代謝中具有關(guān)鍵作用[6]，糖酵解酶表達(dá)改變可能參與孤獨癥發(fā)病過程。目前，孤獨癥患者小腦中有氧糖酵解酶表達(dá)情況尚不清楚。本研究測定孤獨癥患者和年齡相匹配對照者尸小腦組織中8種有氧糖酵解酶的表達(dá)水平，包括己糖激酶Ⅰ型及Ⅱ型同工酶（hexokinase isozyme，HK-Ⅰ、HK-Ⅱ）、血小板型磷酸果糖激酶（platelet-type phosphofructokinase，PFKP）、丙酮酸激酶M型同工酶（pyruvate kinase M isozyme，PKM1/2）、丙酮酸激酶M2亞型同工酶（pyruvate kinase M2 isoform，PKM2）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）、丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）及乳酸脫氫酶A型同工酶（lactate dehydrogenase A isozyme，LDHA），探索孤獨癥患者小腦中有氧糖酵解酶的表達(dá)及其與孤獨癥發(fā)病的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象孤獨癥組8例和對照組8名樣本均購買于美國發(fā)育障礙腦和組織庫（NICHD Brain and Tissue Bank for Developmental Disorders），為新鮮冰凍腦組織（在死亡后3~27 h內(nèi)完成冰凍）。孤獨癥組入組標(biāo)準(zhǔn)：符合《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,Fourth Edition，DSM-Ⅳ）及修訂的孤獨癥診斷標(biāo)準(zhǔn)（Autism Diagnostic Interview-Revised）。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有脆性X綜合征；②患有強(qiáng)迫癥；③患有情感障礙；④患有其他神經(jīng)精神疾病。對照組入組標(biāo)準(zhǔn)：①與孤獨癥組年齡相匹配的兒童；②不符合孤獨癥診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有脆性X綜合征；②患有強(qiáng)迫癥；③患有情感障礙；④患有其他神經(jīng)精神疾病。孤獨癥組5例男性，3例女性，年齡4~15歲，平均（9.25±3.77）歲；對照組6名男性，2名女性，年齡4~14歲，平均（9.25±3.37）歲。樣本具體信息見表1。兩組年齡（t<0.001，P=1.000）、性別構(gòu)成（P=1.000）及死后解剖時間（t=0.719，P=0.484）差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 研究方法

1.2.1 小腦組織勻漿將購買的兩組新鮮冰凍小腦組織分裝于各試管中，分別按體積與質(zhì)量百分比（10%V/W）加入預(yù)冷的組織勻漿液，勻漿液成分為50 mmol/L Tris-HCl（pH為7.4），8.5%蔗糖，2mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），10mmol/Lβ-巰基乙醇（β-mercaptoethanol），以及蛋白酶抑制劑cocktail（Sigma-Aldrich,St.Louis,MO），勻漿結(jié)束后用二辛可寧酸（bicinchonininc acid，BCA）法測定各樣本的總蛋白濃度。BCA蛋白試劑盒購自Thermo Scientific。

表1 樣本信息

1.2.2 測定8種有氧酵解酶的表達(dá)水平采用蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）分別檢測HK-Ⅰ、HK-Ⅱ、PFKP、PKM1/2、PKM2、GAPDH、PDH、LDHA表達(dá)水平。制備8%~10%分離膠和5%濃縮膠，加樣，電泳，轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜。室溫下封閉1 h，于4℃孵育一抗（anti-HK-Ⅰ1:1500，anti-HK-Ⅱ1:500，anti-PFKP 1:1500，anti-GAPDH 1:2500，anti-PKM1/2 1:1000，anti-PKM2 1:1000，anti-LDHA 1:1000，anti-PDH 1:2000）過夜（抗體均購買自Cell Signaling Technology），室溫孵育二抗（1:2500）1 h，暗室中X光片顯影、定影及洗片。以β-tublin或β-actin作為內(nèi)參對照。使用Image J軟件分析Western Blotting結(jié)果中條帶的灰度值，以反映各種酶表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法統(tǒng)計分析采用SPSS 13.0軟件。兩組有氧酵解酶的表達(dá)水平比較用獨立樣本t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 有氧糖酵解途徑ATP相關(guān)催化酶在孤獨癥尸小腦中表達(dá)兩組尸小腦中HK-Ⅰ、HK-Ⅱ、PFKP、PKM1/2及PKM2表達(dá)情況分析示：與對照組相比，孤獨癥患者尸小腦中HK-Ⅰ（t=0.658，P= 0.521）、HK-Ⅱ（t=-0.903，P=0.382）、PFKP（t=-0.394，P=0.700）、PKM1/2（t=1.515，P=0.152）及PKM2（t=-1.250，P=0.232）表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1、2及表2。

2.2 有氧糖酵解途徑NADH相關(guān)催化酶在孤獨癥尸小腦中表達(dá)兩組尸小腦中GAPDH、PDH及LDHA表達(dá)情況分析示：與對照組相比，孤獨癥組尸小腦中PDH表達(dá)減少（t=2.225，P=0.043），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，兩組尸小腦中GAPDH（t=0.544，P=0.598）及LDHA（t=0.242，P=0.813）表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3及表2。

3 討論

圖1 HK-Ⅰ、HK-Ⅱ及PFKP在孤獨癥組和對照組小腦中的表達(dá)情況

圖2 PKM1/2及PKM2在孤獨癥組和對照組小腦中的表達(dá)情況

圖3 GAPDH、PDH及LDHA在孤獨癥組和對照組小腦中的表達(dá)情況

表2 孤獨癥組和對照組尸小腦中8種有氧糖酵解酶的表達(dá)水平（±s）

表2 孤獨癥組和對照組尸小腦中8種有氧糖酵解酶的表達(dá)水平（±s）

1）與對照組比較，經(jīng)獨立樣本t檢驗，P<0.05

組別孤獨癥組對照組n88 HK-Ⅰ1.086±0.183 1.139±0.136 HK-Ⅱ0.855±0.277 0.747±0.192 PFKP 1.030±0.132 1.002±0.150 PKM1/2 1.197±0.120 1.335±0.229 PKM2 0.996±0.208 0.889±0.122 GAPDH 1.448±0.281 1.508±0.139 PDH 0.715±0.3421)1.028±0.203 LDHA 0.963±0.287 0.993±0.187

為探討有氧糖酵解途徑在孤獨癥病理機(jī)制中的作用，本研究在孤獨癥患者尸小腦中分析有氧糖酵解途徑中與能量產(chǎn)生或消耗相關(guān)的8種酵解酶HK-Ⅰ、HK-Ⅱ、PFKP、PKM1/2、PKM2、GAPDH、PDH及LDHA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，孤獨癥患者PDH表達(dá)顯著減少，其余7種有氧糖酵解酶均未發(fā)現(xiàn)有顯著差異。本研究兩組樣本的年齡、性別構(gòu)成及死后解剖時間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，然而尚不能完全排除其生前使用藥物及死亡原因?qū)Y(jié)果的影響。

由于有氧糖酵解酶在細(xì)胞內(nèi)的分布及結(jié)構(gòu)不同，酶的活性及表達(dá)受多種因素的影響。HK-Ⅰ通過與線粒體結(jié)合，催化6-磷酸葡萄糖生成，使糖代謝轉(zhuǎn)向糖酵解方向[7]。本研究孤獨癥組HK-Ⅰ表達(dá)較對照組無顯著差異，可能與HK-Ⅰ與線粒體外膜緊密結(jié)合有關(guān)。由于HK-Ⅱ可與線粒體結(jié)合或游離存在于細(xì)胞質(zhì)中，狀態(tài)的轉(zhuǎn)變受細(xì)胞內(nèi)葡萄糖、6-磷酸葡萄糖及Akt的調(diào)節(jié)[7]，在氧化應(yīng)激條件下，HK-Ⅱ在Akt磷酸化調(diào)節(jié)下與線粒體結(jié)合發(fā)揮對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用[8]。然而，在氧化應(yīng)激條件下其對神經(jīng)細(xì)胞的作用尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)PFKP沉默不影響HeLa腫瘤細(xì)胞的生存能力及能量產(chǎn)生，包括糖酵解率[9]。PKM2在正常細(xì)胞中以高度活躍的四聚體形式存在，在能量需求改變時，能與不活躍的二聚體間發(fā)生轉(zhuǎn)換[10]。GAPDH能在氧化應(yīng)激條件下發(fā)揮誘導(dǎo)線粒體消除的作用[11]。LDHA催化丙酮酸產(chǎn)生的乳酸，干擾LDHA表達(dá)則導(dǎo)致線粒體活性氧產(chǎn)生增多以及細(xì)胞增殖和活動降低[12]。本研究發(fā)現(xiàn)兩組尸小腦中HK-Ⅰ、HK-Ⅱ、PFKP、PKM1/2、PKM2、GAPDH及LDHA的表達(dá)水平無顯著差異，提示上述酶在患者小腦中的表達(dá)并未受到影響，可能并未參與孤獨癥發(fā)病過程。

PDH是丙酮酸脫氫酶復(fù)合物（pyruvate dehydrogenase complex，PDHc）組成中主要起催化作用的部分，PDHc催化丙酮酸轉(zhuǎn)變成乙酰輔酶A，是糖酵解進(jìn)入三羧酸循環(huán)重要的階段[13]。在對孤獨癥患者外周血淋巴細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，孤獨癥組丙酮酸濃度增加，PDH活性則顯著降低[14]。線粒體功能受損以及腦能量需求不能滿足時，可能引起一系列腦結(jié)構(gòu)和功能改變，導(dǎo)致孤獨癥癥狀的產(chǎn)生[15]。本研究發(fā)現(xiàn)孤獨癥小腦中PDH表達(dá)減少，造成丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)減少，轉(zhuǎn)而乳酸生成增多，可能造成糖代謝能量減低，導(dǎo)致孤獨癥腦結(jié)構(gòu)發(fā)育異常。研究顯示大多數(shù)PDHc缺陷患者是由于X染色體連接的PDHA1基因發(fā)生突變，該基因編碼復(fù)合物中PDH的α亞單位[16]。PDH缺陷導(dǎo)致糖類代謝減弱，可能造成腦細(xì)胞增殖、分化、遷移成神經(jīng)元的過程受損[17]。尸腦研究顯示，PDH缺陷的嬰兒表現(xiàn)出頭小畸形、腦回肥厚、小腦和腦干發(fā)育不全等[13]。動物研究發(fā)現(xiàn)PDH缺陷型雌性小鼠表現(xiàn)出總體細(xì)胞、浦肯野神經(jīng)細(xì)胞樹突及新生細(xì)胞增殖、遷移及分化為神經(jīng)元的數(shù)目減少，缺陷型雄性小鼠則不能存活[17]。另外，既往研究發(fā)現(xiàn)孤獨癥前額葉皮層線粒體中PDH活性降低[15]，本研究結(jié)果與其一致。PDH活性取決于多酶復(fù)合物的完整性，該多酶復(fù)合物包含丙酮酸脫氫酶（E1）、二氫硫辛酰胺乙?；D(zhuǎn)移酶（E2）及二氫硫辛酰胺脫氫酶（E3），同時受丙酮酸脫氫酶激酶及丙酮酸脫氫酶磷酸酶的競爭性調(diào)節(jié)[18],本研究未檢測孤獨癥患者小腦中PDH活性調(diào)節(jié)及PDH在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，仍需更多的實驗進(jìn)一步研究。結(jié)合既往研究與本研究結(jié)果，有氧糖酵解途徑中PDH表達(dá)減少，可能與孤獨癥腦結(jié)構(gòu)發(fā)育異常相關(guān)，提示PDH表達(dá)減少可能是孤獨癥發(fā)病的多種因素之一。

綜上所述，孤獨癥患者小腦中有氧糖酵解途徑PDH表達(dá)減少，可能參與孤獨癥的病理過程。然而，這只是在尸腦樣本中的初步探索，也并未檢測酶的活性及定位。未來研究尚需擴(kuò)大樣本量，并在不同發(fā)育階段動物模型中開展研究，進(jìn)一步探索PDH減少在孤獨癥發(fā)病中的作用與意義。

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The expressions of aerobic glycolytic enzymes in the cerebellums of patients w ith autism.

CHENG Peipei, YU Shunying.Shanghai Mental Health Center,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,600 Wan Ping Nan Road,Shanghai 200030,China.Tel:021-34773299.

Objective To study the expression levels of aerobic glycolytic enzymes in the cerebellums and its correlation with pathogenesis of autism in patients with autism.M ethods The Western blotting was used to quantitatively examine the expression levels of aerobic glycolytic enzymes,including HK-Ⅰ,HK-Ⅱ,PFKP,PKM1/2,PKM2, GAPDH,PDH and LDHA in the cerebellums of eight patients with autism and eight age-matched controls.Results Compared to controls,PDH expression was significantly decreased[（0.715±0.342）vs.（1.028±0.203）,P=0.043],while expression of other seven aerobic glycolytic enzymes remained unchanged（P>0.05）in the cerebellums of patients with autism.Conclusion The present study has revealed a decrease in the expression of PDH in the cerebellums of patients with autism,which may be involved in the pathologic process of autism.

Autism Cerebellum Aerobic glycolysis Pyruvate dehydrogenase

R749.94

A

2017-02-10)

(責(zé)任編輯：肖雅妮)

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.05.006

☆國家自然科學(xué)基金面上項目（編號：81571342）

*上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心上海市重性精神病重點實驗室（上海200030）○☆

（E-mail:yushuny@yahoo.com）