王 貴，郭明慧，徐慧慧，黃 晶，呂 爽，趙宏艷，肖 誠

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029；3.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700）

實驗研究

雷公藤甲素對高遷移率族蛋白1誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化的影響

王 貴1，2，郭明慧1，2，徐慧慧1，2，黃 晶1，2，呂 爽1，2，趙宏艷3，肖 誠2?

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029；3.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700）

目的：觀察雷公藤甲素（TP）對高遷移率族蛋白1（HMGB1）誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞（OC）分化及晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）mRNA表達(dá)的影響。方法：取C57BL/6小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)RANKL、M-CSF及不同濃度HMGB1刺激后，采用TRAP染色及活性檢測，觀察OC分化及其功能。再給予TP干預(yù)，觀察其對HMGB1誘導(dǎo)的OC分化情況及RAGE mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果：與HMGB1濃度為0ng/ml組比較，HMGB1濃度500ng/ml及1000ng/ml組TRAP陽性O(shè)C數(shù)目顯著增加，TRAP活性顯著增強(qiáng)（P＜0.01）。與RANKL+HMGB1誘導(dǎo)組比較，TP組TRAP染色陽性O(shè)C數(shù)目顯著減少、TRAP活性顯著降低 （P＜0.01），OC RAGE mRNA表達(dá)明顯降低 （P＜0.05）。結(jié)論：HMGB1能夠促進(jìn)OC分化，TP對HMGB1刺激的OC分化及功能起抑制作用，其機(jī)制可能與下調(diào)OC RAGE基因表達(dá)有關(guān)。

雷公藤甲素；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；破骨細(xì)胞；高遷移率族蛋白1；晚期糖基化終末產(chǎn)物受體

Author’s addressBeijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China

高遷移率族蛋白1（high mobility group protein B1，HMGB1） 在 類 風(fēng) 濕 關(guān) 節(jié) 炎 （rheumatoid arthritis，RA）患者血清及關(guān)節(jié)滑膜組織高表達(dá)，且在伴有骨破壞的病人中，其表達(dá)量顯著增高[1]，其作為炎性因子具有促進(jìn)骨組織吸收的作用[2]，在RA疾病的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[3～5]。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）是 HMGB1 的受體，在破骨前體及成熟的破骨細(xì)胞 （osteoclast，OC）可表達(dá)。HMGB1通過RAGE受體途徑，發(fā)揮趨化作用，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[6]。抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate，resistant alkaline phosphatase，TRAP） 是OC特異性標(biāo)志酶，參與骨吸收過程，可對其特異性染色計數(shù)OC數(shù)目，其活性反映OC功能[7]。有研究顯示，HMGB1參與了膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎 （collage-induced arthritis，CIA）模型大鼠滑膜增生、軟骨及骨質(zhì)破壞的病理過程，而雷公藤多苷片可減輕其病理過程，其機(jī)制與降低HMGB1表達(dá)相關(guān)[8，9]，雷公藤多苷片是臨床治療RA的常用藥，具有很強(qiáng)的抗炎、抗氧化、免疫抑制等作用，在RA的臨床治療中取得了肯定的效果。雷公藤甲素（triptolide，TP）是雷公藤多苷片的主要有效成分之一。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)TP對OC分化及骨吸收作用有明顯的抑制效應(yīng)[10]，本研究旨在通過觀察TP對HMGB1誘導(dǎo)的OC分化、成熟的影響及RAGE mRNA表達(dá)的變化，探討其治療RA骨破壞的作用機(jī)理，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

5～7周齡雄性C57BL/6小鼠，由北京維通利華實驗技術(shù)有限公司提供 （嚙齒動物許可證編號SCXK 2012-0001），飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院基礎(chǔ)理論研究所清潔級實驗動物室 （實驗動物使用許可證號 SYXK（京）2016-0021）。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

雷公藤甲素（TP）購于美國Sigma公司，貨號T3652-1MG；小鼠重組HMGB1蛋白，美國eBioscience公司；α-MEM培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；青霉素、鏈霉素，美國Gibco公司；FBS胎牛血清，美國BioTech公司；小鼠重組核因子κB受體活化因子配基 （RANKL）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF），美國 Peprotech 公司；TRAP 試劑盒，美國Sigma公司；RIPA裂解液，美國Cell Signaling科技公司；引物合成，上海生工；總RNA提取試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMII RT-PCR試劑盒，日本Takara公司。

1.2.2 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱、Varioskan Flash全波長掃描熒光酶標(biāo)儀，美國Thermo Scientific公司；熒光定量PCR儀，美國Applied Biosystems公司；LEICA QWin圖像分析系統(tǒng)，德國LEICA公司。

2 方法

2.1 破骨前體細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

取C57BL/6小鼠，脫頸處死，75％酒精消毒5～10min，分離股骨、脛骨，收集骨髓細(xì)胞懸液用含20ng/ml M-CSF的α-MEM培養(yǎng)液接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，在5％CO2、37℃條件下貼壁過夜。收集未貼壁細(xì)胞，用含20ng/ml M-CSF的α-MEM培養(yǎng)液 （含 10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素）重懸細(xì)胞以 1×105個/孔加入預(yù)置蓋玻片的96孔培養(yǎng)板內(nèi)孔，培養(yǎng)3d后得到破骨前體細(xì)胞。

2.2 HMGB1對破骨前體細(xì)胞分化的影響

得到破骨前體細(xì)胞后，換液為含20ng/ml MCSF、10ng/ml RANKL 及 不 同 濃 度 HMGB1（0、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml）的α-MEM培養(yǎng)液，隔天換液1次。每組設(shè)3個復(fù)孔。

2.2.1 顯微鏡計數(shù)

培養(yǎng)第6d取蓋玻片，TRAP染色后，倒置相差顯微鏡下計數(shù)玻片上TRAP染色陽性 （細(xì)胞核≥3）OC數(shù)目。

2.2.2 OC TRAP活性檢測

細(xì)胞培養(yǎng)至第6d，棄上清，每孔加入50μl RIPA裂解液，冰上震蕩裂解10min，離心后轉(zhuǎn)移每孔上清至新的96孔板中，加入等量TRAP活性反應(yīng)液 （100mmol/L檸檬酸鈉，pH 5.0，50mmol/L酒石酸鈉，5mmol/L磷酸對硝基苯酯），37℃避光孵育1h，加入等量0.1mmol/L NaOH終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀405nm波長處檢測吸光度值。

2.3 TP對HMGB1誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞的干預(yù)

按前述方法得到破骨前體細(xì)胞后，換液為含20ng/ml M-CSF、10ng/ml RANKL、1μg/mlHMGB1，含或不含TP10nM的α-MEM培養(yǎng)液。各組給藥情況如表1示，觀察TP對OC分化及RAGE mRNA表達(dá)的影響。

表1 各組的給藥方法

2.3.1 顯微鏡計數(shù)（方法同前）

2.3.2 TRAP活性檢測（方法同前）

2.3.3 Real-time PCR方法

培養(yǎng)至第6d的各孔細(xì)胞按TaKaRa RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，瓊脂糖電泳法檢測RAGE mRNA基因濃度及完整性。Real-time PCR步驟按TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTmII試劑盒說明書進(jìn)行，擴(kuò)增條件為95℃變性30s，95℃ 5s，60℃ 30s，擴(kuò)增40個循環(huán)，引物序列為：RAGE上游引物TGGAAACTGAACACAGGAAGG，下游引物TGGAAGGAGGAGTGAACCAT。根據(jù)檢測結(jié)果，分析擴(kuò)增曲線和溶解曲線，按照2-△△ct相對定量公式計算各組目的基因相對定量結(jié)果。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗Kruskal-Wallis單因素ANOVA。

3 結(jié)果

3.1 HMGB1對破骨前體細(xì)胞分化的影響

圖1A（見封底）、圖1B示，與對照組相比，HMGB1 濃度 10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml組OC細(xì)胞分化數(shù)目較少，有增加的趨勢，但無顯著性差異。 HMGB1濃度 500ng/ml及1000ng/ml組可見多核巨細(xì)胞狀成熟分化的OC，較對照組顯著增加（均 P＜0.01）。

3.2 不同濃度HMGB1對OC TRAP活性的影響

圖2示，與對照組相比，HMGB1 500ng/ml及1000ng/ml組 TRAP活性顯著增高 （均 P＜0.01），提示HMGB1能促進(jìn)OC的分化。

3.3 TP對HMGB1誘導(dǎo)的OC分化的影響

圖3A（見封底）、圖3B示，與單獨(dú)RANKL誘導(dǎo)組相比，RANKL+HMGB1組OC分化明顯，體積變大，數(shù)目增多（P＜0.01）；加入 TP（10nM）干預(yù)后OC分化受抑制，OC數(shù)目明顯減少（P＜0.01）。

3.4 TP對HMGB1誘導(dǎo)的OC TRAP活性的影響

圖4示，經(jīng)RANKL、HMGB1共同誘導(dǎo)刺激的OC較單獨(dú)RANKL誘導(dǎo)組，TRAP活性顯著升高（P＜0.01）。 TP 給藥組 TRAP 活性較 RANKL+HMGB1誘導(dǎo)組顯著降低（P＜0.01），說明 TP抑制了OC的分化成熟。

3.5 TP對HMGB1誘導(dǎo)的OC RAGE mRNA表達(dá)的影響

圖5示，與單獨(dú) RANKL誘導(dǎo)組相比，經(jīng)RANKL、HMGB1共同誘導(dǎo)刺激后RAGE mRNA表達(dá)量顯著增加（P＜0.01）。與 RANKL+HMGB1 誘導(dǎo)組相比，加入TP后，TP能顯著抑制OCRAGE mRNA 的表達(dá)（P＜0.05）。 結(jié)果表明：TP通過下調(diào)HMGB1的受體RAGE基因的表達(dá)發(fā)揮對HMGB1誘導(dǎo)的OC分化成熟的抑制作用。

圖1 B不同濃度HMGB1對破骨前體細(xì)胞分化的影響

圖2 不同濃度HMGB1對OC TRAP活性的影響

圖3 BTP對HMGB1誘導(dǎo)的OC分化的影響

圖4 TP對HMGB1誘導(dǎo)的OC TRAP活性的影響

圖5 TP對HMGB1誘導(dǎo)OC RAGE mRNA表達(dá)的影響

4 討論

RA是一種炎癥型自身免疫性疾病，以漸進(jìn)性的滑膜炎及骨破壞為主要病理表現(xiàn)，炎癥因子在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起了至關(guān)重要的作用。HMGB1是一種晚期炎癥介質(zhì)，是一種高度保守的非組蛋白DNA結(jié)合蛋白，在真核細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，受到適當(dāng)刺激時可主動或被動釋放到細(xì)胞外[11]，廣泛的參與炎癥反應(yīng)，具有促炎及免疫刺激性，能夠促進(jìn)RA滑膜炎癥反應(yīng)[12]。臨床研究顯示活動期RA患者血清HMGB1水平顯著增加[13]，且在伴有骨破壞的RA患者中水平明顯升高[1]。動物實驗研究亦顯示，HMGB1在CIA大鼠巨噬細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)量升高[14]。給大鼠關(guān)節(jié)腔注射HMGB1后能夠引起關(guān)節(jié)滑膜炎癥，抗體阻斷HMGB1后，滑膜炎癥緩解[15，16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HMGB1濃度 500ng/ml及1000ng/ml組可明顯增加破骨細(xì)胞數(shù)量及TRAP活性，說明HMGB1能增加破骨細(xì)胞骨分化及功能。

本課題組前期實驗研究結(jié)果表明，雷公藤多苷有抗氧化作用，能提高佐劑型關(guān)節(jié)炎的抗氧化能力，能減輕細(xì)胞的過氧化損傷[17]；降低CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)，并降低大鼠關(guān)節(jié)軟骨TNF-α，IL-6，NF-κB和COX-2等炎癥因子的表達(dá)[18]。有研究顯示，HMGB1參與了CIA滑膜增生、軟骨及骨質(zhì)破壞的病理過程，雷公藤多苷治療RA的關(guān)節(jié)腫脹機(jī)制與降低HMGB1表達(dá)相關(guān)[8，9]。

本研究顯示，TP干預(yù)HMGB1誘導(dǎo)的OC后，與RANKL+HMGB1組誘導(dǎo)的OC相比，加入TP（10nM）后，OC 分化受抑制，數(shù)目減少（P＜0.01）。RAGE是HMGB1的受體，HMGB1通過RAGE受體途徑，發(fā)揮趨化作用，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[6]。進(jìn)一步檢測 TP對 OCRAGE mRNA表達(dá)的影響，Real Time-PCR結(jié)果顯示與RANKL+HMGB1誘導(dǎo)組相比，加入TP能顯著抑制OCRAGE mRNA的表達(dá)（P＜0.05）。表明TP可通過下調(diào)HMGB1的受體RAGE基因的表達(dá)發(fā)揮對HMGB1誘導(dǎo)的OC分化成熟的抑制作用。

綜上所述，研究顯示HMGB1能夠誘導(dǎo)刺激破骨前體細(xì)胞分化成熟為 OC，TP能夠抑制HMGB1誘導(dǎo)的OC的分化及成熟，降低OC RAGE基因的表達(dá)，提示TP治療RA骨破壞可能是通過影響炎癥細(xì)胞因子HMGB1受體RAGE的表達(dá)而發(fā)揮作用。

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The effect of triptolide on differentiation of osteoclasts induced by HMGB1

//WANG Gui，GUO Minghui，XU Hui-hui，et al//Journal of China-Japan Friendship Hospital，2017 Apr，31（2）：102-106

Objective：To investigate the effect of triptolide （TP）on the differentiation and expression level of RAGE mRNA of osteoclasts induced by high mobility group protein B1（HMGB1）.Methods：Bone marrow mesenchymal stem cells （BMMs）were isolated from the bilateral tibias and femurs of C57BL/6 mice.BMMs were cultured in the presence of RANKL，M-CSF and different concentrations of HMGB1，and were stained by TRAP and measured by TRAP activity to observe the differentiation and maturation of osteoclasts.The expression levels of RAGE were detected by real time-PCR after BMMs were administered by triptolide.Results：Compared with HMGB1 （0ng/ml）group，the number of TRAP positive multinuclear cells and the TRAP activity of osteoclasts of HMGB1 （500ng/ml，1000ng/ml）were significantly increased （P＜0.01）.Compared with RANKL+HMGB1 treated group，TP could reduce the number and the TRAP activity of osteoclasts （P＜0.01）.The expression levels of RAGE was down-regulated by TP（P＜0.05）.Conclusion：HMGB1 could promote the differentiation of osteoclasts.TP could suppress the differentiation and function of osteoclasts induced by HMGB1.The mechanism might be related on the down-regulating of RAGE gene expression.

triptolide；rheumatoid arthritis；osteoclast；high mobility group protein B1；receptor for advanced glycation end products

R285.5

：A

：1001-0025（2017）02-0102-05

10.3969/j.issn.1001-0025.2017.02.010

國家自然科學(xué)基金（81373773，81673844）；北京市自然基金（7142144）

2*本文通訊作者。

王 貴（1990-），女，碩士研究生。

2017-01-04

2017-02-20