謝曉梅，廖 敏，黃 宇，葉照金，呂 婷

(浙江大學環(huán)境與資源學院，浙江省亞熱帶土壤與植物營養(yǎng)重點實驗室，杭州310058)

水溶性量子點熒光探針用于水產養(yǎng)殖違禁添加品孔雀石綠殘留量測定

謝曉梅，廖 敏*，黃 宇，葉照金，呂 婷1

(浙江大學環(huán)境與資源學院，浙江省亞熱帶土壤與植物營養(yǎng)重點實驗室，杭州310058)

基于孔雀石綠對水溶性CdTe/ZnS量子點存在熒光猝滅現(xiàn)象,建立了一種用于水產養(yǎng)殖違禁添加孔雀石綠殘留檢測的新方法。在pH 8.0、0.065 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液及1.60×10－4mol/L的CdTe/ZnS量子點優(yōu)化體系中，在0.019 3～1.28 mg/L范圍內，孔雀石綠質量濃度與水溶性量子點CdTe/ZnS的熒光猝滅強度呈良好的線性關系，相關系數(shù)r=0.999，檢出限為0.005 43 mg/L。該方法可成功用于淡水和海水養(yǎng)殖用水以及魚肉組織中違禁添加孔雀石綠殘留的測定，添加回收率為90.4%～100.3%，相對標準偏差為0.37%～1.01%。該方法對水產品和養(yǎng)殖用水的檢測結果與液質聯(lián)用法的檢測結果一致，且假陽性和假陰性率試驗結果也均與真實樣品一致：說明水溶性量子點熒光探針法對孔雀石綠殘留檢測特異性較好。通過紫外-可見吸收光譜及共振光散射技術研究孔雀石綠對水溶性CdTe/ZnS量子點熒光猝滅特征，發(fā)現(xiàn)其熒光猝滅機制是CdTe/ZnS量子點與孔雀石綠相互作用，從而建立起共振能量轉移體系。

水溶性量子點；熒光探針；孔雀石綠；熒光猝滅

Summary Quantum dots have unique physical and chemicalproperties and opticalproperties due to its special structure.In recent years,as a new type of fluorescent probe materials applied in chemical and biological analysis,medical diagnosis and other fields,quantum dots have become the focus of research.At present,some studies have been reported on the detection of heavy metal,veterinary drug and pesticide residues in food by using quantum dots as fluorescent probes.Related research reports showed that the use of quantum dots as a fluorescent probe to analyze the analyte with impact of food safety had advantages ofhigh sensitivity,good selectivity,shortresponse time,and less investment,which indicated the quantum dots as a fluorescent probe had wide application prospects in food safety inspection field.The malachite green had good antibacterial effect and low price,which was often illegally used in aquaculture as insecticides and fungicides.The malachite green had the potential carcinogenic effects,which was clearly listed in Chinese Food Animal Banned Veterinary Drugs and Compounds List in 2002,but in fact,malachite green residue has been detected in aquatic products breeding from time to time due to illegal addition.Malachite green residue detection method has been mainly reported,such as high performance liquid chromatography, surface enhanced Raman scattering spectroscopy,liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS),ultraviolet spectrometry,which were not easy to be applied and popularized at the basic unit,due to lower sensitivity,or longer single sample detection time,or expensive equipment,or complicated operation.Therefore,it was urgent to develop a detection method with high sensitivity,good selectivity,short response time and less input.Quantum dot fluorescent probe method in residue detection had the potential to meet the demand,but the current studies using the method of quantum dots to detect malachite green were rarely reported.

In view ofthis,based on the application prospects ofresidue detection by quantum dotfluorescentprobe method in the field of food safety,the feasibility of detecting malachite green residue with illegal addition in aquaculture was researched in the present study by a water-soluble quantum dot fluorescent probe method,and the purpose was to establish a method to detect trace residues ofmalachite green in actualwater and fish products.

In this study,water-soluble CdTe/ZnS quantum dot fluorescent probe was synthesized under mild conditions with 3-mercaptopropionic acid as a stabilizer.The main influence factors of water-soluble CdTe/ZnS quantum dot fluorescent probe to detect malachite green in the detection system were investigated,including buffer system type,buffer pH,buffer concentration, concentration of quantum dots,reaction time,concentration of malachite green,coexisting ions,etc.The best condition was obtained for the water-soluble CdTe/ZnS quantum dotprobe method to detectmalachite green on the basis ofabove investigation. Under the optimaldetection condition,water-soluble CdTe/ZnS quantum dotfluorescentprobe for quantitative detection oftrace residues ofmalachite green was carried outin water and fish products.Atthe same time,the mechanism ofwater-soluble CdTe/ ZnS quantum dotfluorescentprobe method being used for the detection oftrace residues ofmalachite green was studied by using ultraviolet-visible(UV-Vis)absorption spectroscopy and resonance lightscattering technique.

As a result,a simple,rapid and sensitive approach to quantitative determination ofillegally added malachite green residues in aquaculture was developed based on the fluorescence quenching ofwater-soluble CdTe/ZnS quantum dots by malachite green. Under the optimized conditions,i.e.,pH=8.0,0.065 mol/L Tris-HCland 1.60×10－4mol/L CdTe/ZnS in the detection system,the linear range ofwater-soluble CdTe/ZnS quantum dotfluorescentquenching intensity versus the concentration ofmalachite green from 0.019 3 mg/L to 1.28 mg/L,with a correlation coefficientof r=0.999 and a limitofdetection of0.005 43 mg/L.The proposed method had been applied to quantitative determination of malachite green in muscle tissue of fish and water for freshwater and marine aquaculture successfully,with the recovery percentage of 90.4%-100.3%and relative standard deviations of 0.37%-1.01%for added malachite green.The detection results of aquatic products and aquaculture water were consistent with the results of LC-MS method,while the results of false positive rate and false negative rate test were the same with real samples, which indicated that the water-soluble quantum dot fluorescent probe method of malachite green residue detection was more specific.The fluorescence quenching mechanism was further investigated by using UV-Vis absorption spectra and resonance light scattering.The results indicated that the fluorescence quenching of water-soluble CdTe/ZnS quantum dots by malachite green was due to fluorescence resonance energy transfer system being constructed between CdTe/ZnS quantum dots(donor)and malachite green(acceptor).

量子點是一種納米粒子,其三維尺寸受限于1～100 nm范圍內，主要是由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素組成的半導體納米材料，又稱零維材料或納米晶[1]。量子點因其特殊的結構而具有獨特的物理化學性質和光學特性[2]，近些年作為一類新興的熒光探針材料被應用到化學和生物分析、醫(yī)學診斷等領域，成為研究熱點和焦點[3-6]。目前，已有的一些研究報道以量子點作為熒光探針用于食品中重金屬、獸藥及農藥殘留檢測，如：陳幗敏等[6]利用手性化合物D-青霉胺和L-半胱氨酸包覆CdSe量子點,發(fā)現(xiàn)Hg2+能顯著猝滅量子點的熒光強度，檢測限低至40 mg/L；CAI等[7]構建了超靈敏檢測Pb2+的L-谷胱甘肽包覆ZnSe量子點，發(fā)現(xiàn)Pb2+的檢出限可低至0.147 mg/L；CHEN等[8]基于Zn2+對用L-半胱氨酸修飾的量子點具有熒光增敏作用，建立了用量子點檢測Zn2+的新方法。這些研究表明，用量子點作為熒光探針檢測重金屬離子可明顯提高其檢測靈敏度，且表現(xiàn)出對某些離子的特異性。侯明等[9]以巰基乙酸(thioglycolic acid,TGA)為穩(wěn)定劑合成了CdTe/CdS量子點，建立了牛奶樣品中微量司帕沙星(sparfloxacin,SPFX)殘留檢測的新方法，檢出限低至0.013 99 mg/L。LI等[10]合成了對聚乙烯比咯烷酮(polyvinylpyrrolidine,PVP)穩(wěn)定的CdS量子點，并在量子點表面進行偶聯(lián)，建立了農作物中敵百蟲殘留的快速檢測方法，檢測限低至0.012 mg/L?？梢?，利用量子點作為熒光探針分析影響食品安全的待分析物具有靈敏度高、選擇性好、響應時間短、投入少等優(yōu)點，應用前景廣。

孔雀石綠(malachite green,MG)是一種綠色的帶有金屬光澤的結晶體(結構式見圖1)，易溶于水。由于其具有很好的抗菌效果，且價格低廉，常被作為殺蟲劑和殺菌劑違規(guī)應用于水產養(yǎng)殖業(yè)中?？兹甘G具有潛在的致癌作用[11]，2002年，中國《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》中被明確列入[12]。在中國《無公害食品水產品中漁藥殘留限量》(NY 5070—2002)中也明確指出孔雀石綠為不得檢出[13]，但實際上，在水產品養(yǎng)殖中還不時能檢測到違規(guī)添加的孔雀石綠殘留。目前，已報道的孔雀石綠殘留檢測方法主要有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography,HPLC)[14]、表面增強拉曼散射光譜法（surface enhanced Raman scattering,SERS)[15]、液質聯(lián)用法[16]、紫外光譜法（ultravioletspectrum,UV)[17]、熒光光譜法[18-19]等，這些檢測方法或靈敏度不高，或單個樣品上機檢測時間較長，或儀器昂貴，或操作復雜，不易在基層得到應用與推廣；而量子點熒光探針法殘留檢測技術具有解決孔雀石綠殘留檢測現(xiàn)實需求的潛力，但目前利用量子點檢測孔雀石綠的方法還鮮有報道。

圖1 孔雀石綠化學結構Fig.1 Chemicalstructure ofmalachite green

鑒于此，本研究以巰基丙酸為穩(wěn)定劑，在溫和條件下合成了水溶性的CdTe/ZnS量子點熒光探針，并基于共振能量轉移原理，構建了以CdTe/ZnS量子點為能量供體、孔雀石綠為能量受體的共振能量轉移體系，建立了可應用于實際水樣和魚產品中定量檢測微量孔雀石綠殘留的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

碲粉（99%），Aldrich公司；NaBH4（96%）、CdCl2· 2.5H2O（＞99%）、巰基乙酸（＞99%）、硫化鈉（99%）和硫酸鋅（＞99%），均來自國藥集團化學試劑有限公司；孔雀石綠（98%），Sigma公司。

UV-2450PC雙光束紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；JEM-1200EX透射電鏡（日本JEOL公司）；LS-55熒光/磷光/發(fā)光分光光度計（美國Perkin Elmer公司）；pH計（梅特勒MP120型)。

1.2 水溶性CdTe/ZnS量子點的合成[5,9]

將0.12 g NaBH4和0.03 g碲（Te)粉置于三頸瓶中，在氮氣保護下，加入5 mL超純水，于冰水浴中磁力攪拌下反應3 h，得到淡紫色的NaHTe溶液（前軀體)。在氮氣保護下，將100 mL 0.002 5 mol/L的Cd2+水溶液倒入另一個三頸瓶中，加入0.1 mL巰基乙酸(TGA)，用1 mol/L NaOH調節(jié)至pH值為11。在強磁力攪拌下，快速加入NaHTe溶液，在氮氣保護下，90℃回流1 h，得到CdTe量子點。按V(ZnSO4)∶V(Na2S)=1∶1分別配制ZnSO4和Na2S溶液，在氮氣保護下，以相同速度將ZnSO4和Na2S溶液同時滴加到制備獲得的CdTe量子點溶液中，滴加量按照V(CdTe)∶V(ZnS)=1∶1控制，最后在90℃下繼續(xù)回流1 h，得到淡黃色的CdTe/ZnS量子點。

1.3 CdTe/ZnS量子點及其與孔雀石綠的作用特征分析

1.3.1 熒光分光光度法

配制1.60×10-4mol/L CdTe-QDs（quantum dots，量子點）溶液，準確移取至1 cm厚石英比色池中。以403 nm為激發(fā)波長，記錄在475～650 nm波長范圍內量子點的發(fā)射光譜變化。

1.3.2 紫外分光光度法及共振光散射掃描

分別準確移取3 mL 0.35×10－6mol/L孔雀石綠溶液，3 mL 1.60×10－4mol/L CdTe-QDs溶液及二者的混合溶液3 mL，以二次蒸餾水為空白，在400～700 nm波長范圍內進行紫外掃描，以及在250～700 nm波長范圍內于熒光分光計上按照λex（熒光最大激發(fā)波長）=λem（熒光最大發(fā)射波長）進行共振光散射(resonance lightscattering,RLS)掃描。

1.3.3 透射電子顯微鏡觀察

在附有一層碳膜的銅網(wǎng)上滴加CdTe/ZnS量子點溶液，待干。將制得的樣品進行透射電子顯微鏡（transmission electron microscope,TEM）觀察。

1.4 CdTe/ZnS量子點探針檢測孔雀石綠的條件優(yōu)化與應用

1.4.1 溶液配制

1.4.1.1 孔雀石綠標準溶液

準確稱取孔雀石綠0.018 5 g，用二次蒸餾水溶解并定容至250 mL，得74 mg/L的儲備液，放在冰箱中4℃避光保存，試驗時經蒸餾水梯度稀釋為標準工作溶液。

1.4.1.2 緩沖溶液的標準儲備液

用蒸餾水分別配制0.10 mol/L Tris-HCl、KH2PO4-NaOH、檸檬酸-Na2HPO4、Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液儲備液，試驗時再經蒸餾水稀釋得到不同濃度的工作分散體系。

1.4.2 水溶性CdTe/ZnS量子點檢測體系的最佳條件優(yōu)化與應用

1.4.2.1 緩沖溶液的優(yōu)化

于5 mL比色管中配制含CCdTe/ZnS=1.60×10－4mol/L，pH=8.0和含0.065 mol/L緩沖溶液（Tris-HCl或KH2PO4-NaOH或檸檬酸-Na2HPO4或Na2HPO4-NaH2PO4)的CdTe/ZnS-MG檢測體系，定容后于室溫下穩(wěn)定20 min，之后準確移至1 cm厚的石英比色池中，以403 nm為激發(fā)波長，記錄475～650 nm波長范圍內量子點的發(fā)射光譜變化。

1.4.2.2 緩沖溶液pH及其濃度的優(yōu)化

于系列5 mL比色管中配制含CCdTe/ZnS=1.60×10－4mol/L，CMG=0.128 mg/L和系列不同濃度Tris-HCl（pH固定，即pH=8.0）或系列不同pH（Tris-HCl濃度固定，即CTris-HCl=0.065 mol/L)的Tris-HCl緩沖溶液的檢測體系，定容后于室溫下穩(wěn)定20 min，之后準確移至1 cm厚的石英比色池中，在λex/λem=403 nm/570 nm處測定未加孔雀石綠標準溶液的熒光強度I0和含孔雀石綠的標準溶液系列體系的熒光強度I，并計算相對熒光猝滅強度ΔI。

1.4.2.3 量子點濃度的優(yōu)化

于系列5 mL比色管中配制含CMG=0.128 mg/L，CTris-HCl=0.065 mol/L，pH=8.0和不同濃度CdTe/ZnS量子點的檢測體系，定容后于室溫下穩(wěn)定20 min，之后準確移至1 cm厚的石英比色池中，在λex/λem=403 nm/ 570 nm處測未加孔雀石綠標準溶液的熒光強度I0和含孔雀石綠的標準溶液系列體系的熒光強度I，并計算相對熒光猝滅強度ΔI。

1.4.2.4 反應時間的選擇

于系列5 mL比色管中配制含CMG=0.128 mg/L的檢測體系，定容后于室溫下分別反應5、10、20、30、45、60 min，然后分別將反應不同時間的體系溶液準確移至1 cm厚的石英比色池中，在λex/λem=403 nm/570 nm處測未加孔雀石綠標準溶液的熒光強度I0和含孔雀石綠的標準溶液系列體系的熒光強度I，并計算相對熒光猝滅強度ΔI。

1.4.2.5 CdTe/ZnS量子點探針對漁業(yè)養(yǎng)殖水體中孔雀石綠的檢測

取浙江省杭州市某養(yǎng)魚戶淡水養(yǎng)魚水樣和浙江省象山縣某養(yǎng)魚戶海水養(yǎng)魚水樣各1 L，用0.100 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH值至8.0左右，過濾，將濾液收集于1 000 mL容量瓶中，添加孔雀石綠標準品，配制系列不同濃度孔雀石綠待測水樣，定容。取制備好的水樣各1 mL于5 mL比色管中，加入0.1 mL EDTA（0.05×10－6mol/L)掩蔽劑，配制出含CTris-HCl=0.065 mol/L，pH=8.0和CCdTe/ZnS=1.60×10－4mol/L的待測體系，定容，于室溫下穩(wěn)定20 min之后準確移至1 cm厚的石英比色池中，在λex/λem=403 nm/570 nm處測未加孔雀石綠標準溶液的熒光強度I0和含孔雀石綠的標準溶液系列體系的熒光強度I，并計算相對熒光猝滅強度ΔI。計算待測水樣中孔雀石綠的質量濃度和回收率，試驗重復3次。同時，由于自然水體中常常共存K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Al3+、Ba2+、Cu2+、Zn2+、Cl－、F－、NO3－、NH4+、SO42－、CO32－、Mn2+、Fe3+等陰陽離子，因此配制出系列含上述不同離子（離子濃度依據(jù)自然水體的可能情況確定）、CMG=0.021 9 mg/L、pH=8.0和CCdTe/ZnS=1.60×10－4mol/L的待測體系，按養(yǎng)殖水樣檢測過程進行測定，探究共存離子對水溶性CdTe/ZnS量子點探針檢測孔雀石綠的影響。

1.4.2.6 CdTe/ZnS量子點探針對魚肉組織中孔雀石綠的檢測

取系列空白魚肉組織，每份100 g，加入系列不同濃度孔雀石綠標準溶液，放置至少30 min，使藥物滲入組織，之后準確稱取不同處理的肌肉組織各20 g，加入5 mL對甲苯磺酸溶液，3 mL鹽酸羥胺溶液，20 mL乙酸胺溶液，置于勻漿機中勻漿3 min，然后加入90 mL乙腈充分振蕩均勻，然后再加入堿性氧化鋁20 g混勻，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，置于150 mL燒瓶中。在含魚肉組織渣的離心管內繼續(xù)加入50 mL乙腈，混勻，二次離心，取上清液合并于150 mL燒瓶中。所得液體于30℃水浴中旋轉蒸發(fā)至2 mL左右，然后用中性氧化鋁柱固相萃取，所得2 mL洗脫液置于4℃冰箱中待分析。取處理好的樣品各1 mL于5 mL比色管中，加入0.1 mL EDTA（0.05×10－6mol/L)掩蔽劑，配制出含CTris-HCl=0.065 mol/L，pH= 8.0和CCdTe/ZnS=1.60×10－4mol/L的待測體系，定容，于室溫下穩(wěn)定20 min之后準確移至直徑1 cm的石英比色池中，在λex/λem=403 nm/570 nm處測未加孔雀石綠標準溶液的熒光強度I0和含孔雀石綠的標準溶液系列體系的熒光強度I，并計算相對熒光猝滅強度ΔI。計算待測樣中孔雀石綠的質量分數(shù)和回收率。試驗重復3次。繪制標準曲線及查詢結果。

1.4.2.7 CdTe/ZnS量子點探針對水產養(yǎng)殖違禁添加品孔雀石綠檢測的特異性驗證

選取一定量的孔雀石綠陽性或陰性的草魚、鳙、鯽、鱖、黃鱔、鯰、養(yǎng)殖淡水、養(yǎng)殖海水樣品，采用

1.4.2.5 節(jié)和1.4.2.6節(jié)中的方法及《水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定》[20]，分別采用CdTe/ZnS量子點探針法及液質聯(lián)用（liquid chromatographmass spectrometer，LC-MS)方法檢測孔雀石綠殘留，比對并驗證CdTe/ZnS量子點探針法對水產養(yǎng)殖違禁添加品孔雀石綠檢測的特異性。

2 結果與討論

2.1 水溶性CdTe/ZnS量子點的特性

圖2A和B分別為CdTe/ZnS量子點的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。從中可以看出：量子點的熒光光譜峰較寬，半峰寬約100 nm，具有良好的熒光性能；在403 nm處激發(fā)時，其最佳熒光發(fā)生光譜波長位于570 nm，所獲的量子點熒光光譜峰均勻。表明CdTe/ZnS量子點屬于均一分散的。

圖3是合成得到的CdTe/ZnS量子點的透射電子顯微鏡（TEM)圖。從圖3A中可以看出，透射電鏡所得圖像進一步證明CdTe/ZnS量子點分散性較好，形態(tài)近似球粒，其平均直徑約為5.0 nm。從圖3B中也能看出，添加了孔雀石綠的CdTe/ZnS量子點仍保持單分散。說明CdTe/ZnS量子點的熒光猝滅并不是由于聚集或孔雀石綠誘導量子點變小引起的。

圖2 室溫下CdTe/ZnS量子點光譜圖Fig.2 Spectrogram of CdTe/ZnS quantum dots atroom temperature

圖3 CdTe/ZnS量子點的透射電子顯微鏡圖Fig.3 Transmission electron microscope(TEM)image of CdTe/ZnS quantum dots

2.2 水溶性CdTe/ZnS量子點檢測應用的最佳條件優(yōu)化

2.2.1 體系緩沖溶液的優(yōu)化

在相同濃度、相同pH值條件下，水溶性CdTe/ ZnS量子點在Tris-HCl、KH2PO4-NaOH、檸檬酸-Na2HPO4及Na2HPO4-NaH2PO4這4種緩沖溶液體系中的熒光強度見圖4。結果表明，水溶性CdTe/ZnS量子點在Tris-HCl緩沖溶液體系中的熒光強度最強。因此，試驗選擇Tris-HCl緩沖溶液作為水溶性CdTe/ ZnS量子點的最佳緩沖體系。

圖4 CdTe/ZnS量子點在不同緩沖溶液體系中熒光強度差異Fig.4 Fluorescence intensity of CdTe/ZnS quantum dots in different buffer solution systems

2.2.2 緩沖溶液體系pH及其濃度的優(yōu)化

緩沖溶液的pH是影響量子點發(fā)光特性的重要因素之一，Tris-HCl緩沖溶液的pH值在7.2～9.0范圍內對CdTe/ZnS-MG體系熒光強度變化的影響見圖5。結果表明，緩沖溶液pH為8.0時，CdTe/ZnSMG體系熒光猝滅程度最大。同時，CdTe/ZnS-MG反應體系熒光猝滅程度隨Tris-HCl緩沖溶液濃度變化的結果（圖6）表明，當緩沖溶液濃度為0.065 mol/ L時，CdTe/ZnS-MG反應體系的相對熒光猝滅程度最大。因此，試驗選擇pH 8.0和0.065 mol/L作為Tris-HCl緩沖溶液最佳的介質pH和介質濃度。

圖5 緩沖溶液pH對CdTe/ZnS-MG體系熒光猝滅程度的影響Fig.5 Effects of buffer solution pH on fluorescence quenching intensity of CdTe/ZnS-MG system

圖6 緩沖溶液濃度對CdTe/ZnS-MG體系熒光猝滅程度的影響Fig.6 Effects of buffer solution concentration on fluorescence quenching intensity ofCdTe/ZnS-MG system

2.2.3 水溶性CdTe/ZnS量子點濃度的優(yōu)化

過低或過高的量子點濃度會使得反應不完全或者發(fā)生量子點自身的猝滅效應，這不僅會在一定程度上限制被測物質的線性范圍，而且影響檢測的靈敏度。圖7是水溶性CdTe/ZnS量子點濃度對孔雀石綠反應體系的熒光猝滅程度的影響。從中可知，在0.2×10－4～1.6×10－4mol/L范圍內，體系的相對熒光強度隨著量子點濃度的增大而增加，當量子點濃度約為1.6×10－4mol/L時，CdTe/ZnS-MG體系的熒光猝滅強度達到最大，隨后逐漸降低。因此，試驗選擇1.6×10－4mol/L為CdTe/ZnS-MG反應體系的最佳量子點濃度。

圖7 CdTe/ZnS量子點濃度對CdTe/ZnS-MG體系熒光猝滅程度的影響Fig.7 Effects of CdTe/ZnS quantum dot concentration on fluorescence quenching intensity ofCdTe/ZnS-MG system

2.2.4 反應時間的選擇

反應時間對體系熒光強度的影響見圖8。結果表明：未加入孔雀石綠時，水溶性CdTe/ZnS量子點的熒光強度幾乎不受時間影響；加入孔雀石綠后，體系的熒光強度逐漸猝滅，約20 min后其熒光強度達到最低值，且在1 h內基本保持穩(wěn)定。由此可見，水溶性CdTe/ZnS量子點與孔雀石綠反應較快，產物具有較好的穩(wěn)定性。因此，試驗選擇在反應20 min后測定體系的熒光強度。

圖8 反應時間對CdTe/ZnS-MG體系熒光猝滅程度的影響Fig.8 Effects of reaction time on fluorescence quenching intensity ofCdTe/ZnS-MG system

2.3 孔雀石綠對CdTe/ZnS體系熒光光譜的影響及其檢出限

依據(jù)2.2節(jié)獲得的CdTe/ZnS-MG體系應用的最佳條件，研究了在0.065 mol/L、pH 8.0的Tris-HCl緩沖溶液及1.6×10－4mol/L水溶性CdTe/ZnS量子點濃度體系中，依次加入不同濃度的標準孔雀石綠水溶液，于30℃反應20 min，獲得不同濃度孔雀石綠對反應體系熒光光譜的影響。結果(圖9)表明，CdTe/ ZnS量子點的熒光強度隨著孔雀石綠質量濃度的增加而逐漸降低。當孔雀石綠質量濃度達到1.28 mg/L時，CdTe/ZnS量子點的熒光強度下降到較低點。可見，孔雀石綠的加入對CdTe/ZnS量子點的熒光強度具有明顯猝滅作用。此外，由圖10可知：在加入孔雀石綠質量濃度為0.019 3～1.28 mg/L時，CdTe/ZnS量子點的熒光猝滅強度與孔雀石綠質量濃度存在著良好的線性關系；熒光猝滅強度△I=77.36[C]+ 28.833（[C]為孔雀石綠質量濃度，mg/L)，且相關系數(shù)為r=0.999。對質量濃度分別為0.021 9、0.256、0.640 mg/L孔雀石綠標準溶液平行測定12次，其相對標準偏差分別為0.97%，1.51%，1.89%，孔雀石綠檢出限為0.005 43 mg/L。

圖9 孔雀石綠質量濃度對CdTe/ZnS-MG體系熒光強度的影響Fig.9 Effects of malachite green concentration on fluorescence intensity of CdTe/ZnS-MG system

圖10 孔雀石綠質量濃度與CdTe/ZnS-MG體系熒光猝滅強度的關系Fig.10 Relationship between malachite green concentration and fluo?rescence quenching intensity of CdTe/ZnS-MG system

目前，檢測孔雀石綠的方法主要有高效液相色譜法[14]、液質聯(lián)用法[16]、表面增強拉曼光譜法[15]、化學發(fā)光法[21]、液微萃取-分光光度法[22]及稀土納米粒子-熒光法[19]。其中：液相色譜法的線性范圍為0.050～1.00 mg/L，檢測限為0.010 2 mg/L，雖然較靈敏，但需要有機溶劑，且單個樣品上機檢測時間較長；液質聯(lián)用法的線性范圍為0.001 1～0.011 mg/L，檢測限為0.000 365 mg/L，雖然靈敏度高，但該方法需要有機溶劑，且儀器昂貴和單個樣品上機檢測時間較長；表面增強拉曼光譜法的線性范圍是0.799～5.00 mg/L，檢測限為0.050 1 mg/L，總體而言，靈敏度不高，操作較復雜；化學發(fā)光法的線性范圍是0.029 9～0.986 mg/L，檢測限為0.025 2 mg/L，雖然較靈敏，但易受干擾；液微萃取-分光光度法的線性范圍是0.080～10.00 mg/L，檢測限為0.042 mg/L，雖然較靈敏，但操作復雜；稀土納米粒子-熒光法的線性范圍是0.050 0～5.00 mg/L，檢測限為0.020 2 mg/L，雖然較靈敏，但稀土納米粒子合成步驟較繁瑣。而本研究利用水溶性量子點CdTe/ZnS熒光猝滅法檢測孔雀石綠的檢出限為0.005 43 mg/L，單個樣品上機檢測不超過1 min；因此，與已報道的方法相比，除液質聯(lián)用法外，本方法的檢測靈敏度均顯著高于高效液相色譜法、表面增強拉曼光譜法、化學發(fā)光法、液微萃取-分光光度法和稀土納米粒子-熒光法，總體表現(xiàn)出靈敏度較高、步驟簡單、成本低廉、易于推廣等特點。

2.4 共存離子對水溶性CdTe/ZnS量子點探針檢測孔雀石綠的影響

為了解水溶性CdTe/ZnS量子點探針檢測孔雀石綠的穩(wěn)定性，研究了樣品中潛在的常見陰陽離子對孔雀石綠測定的影響。結果（表1）表明，各種陰陽離子與孔雀石綠共存對孔雀石綠測定結果干擾較小，相對誤差均小于5.00%?？梢?，檢測體系共存成分對水溶性CdTe/ZnS量子點探針檢測孔雀石綠的干擾小，說明水溶性CdTe/ZnS量子點探針檢測孔雀石綠具有較好的選擇性和穩(wěn)定性。

表1 共存離子對水溶性CdTe/ZnS量子點探針定量檢測孔雀石綠的影響Table1 Effects ofcoexisting ions on quantitative determination ofmalachite green in watersamples ofaquaculture using CdTe/ZnS water-soluble quantum dots as fluorescentprobes(CMG=0.021 9 mg/L)

2.5 水溶性CdTe/ZnS量子點探針法對漁業(yè)養(yǎng)殖水體和魚產品中孔雀石綠殘留的檢測

對取自浙江省杭州市某養(yǎng)魚戶淡水養(yǎng)魚水樣和浙江省象山縣某養(yǎng)魚戶海水養(yǎng)魚水樣以及魚肉組織進行加標回收試驗。結果（表2）表明，2個水樣和魚肉組織本底均未檢出孔雀石綠（低于檢出限)，而淡水和海水養(yǎng)殖用水及魚肉組織的9個添加不同水平孔雀石綠樣品的添加回收率為90.4%～100.3%，相對標準偏差為0.37%～1.01%。表明所建立的水溶性CdTe/ZnS量子點探針法對漁業(yè)養(yǎng)殖水體和魚肉組織中孔雀石綠檢測效果較理想，可用于淡水和海水養(yǎng)殖用水和魚產品中違禁添加品孔雀石綠殘留的測定，是一種可批量化快速定量測定養(yǎng)殖水環(huán)境和魚產品中孔雀石綠殘留的有效方法。

2.6 水溶性CdTe/ZnS量子點探針法對水產養(yǎng)殖違禁添加品孔雀石綠檢測的特異性驗證

2.6.1 假陽性率試驗

對40份已經過LC-MS儀器確證（GB/T 20361—2006《水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定》）為陰性的草魚、鳙、鯽、鱖、黃鱔、鯰、養(yǎng)殖淡水和養(yǎng)殖海水8個樣品（每種樣品各5次重復），用水溶性量子點熒光探針法進行孔雀石綠殘留的快速判定。結果（表3）表明，40份陰性草魚、鳙、鯽、鱖、黃鱔、鯰、養(yǎng)殖淡水和養(yǎng)殖海水樣品的檢測結果均為陰性，與真實樣品一致，未出現(xiàn)假陽性結果。可見，水溶性量子點熒光探針法在判定水產品及其養(yǎng)殖水環(huán)境孔雀石綠殘留特征時，抗干擾性較強。

表2 水溶性CdTe/ZnS量子點探針法對漁業(yè)養(yǎng)殖水體和魚產品中孔雀石綠的檢測結果Table2 Results ofquantitative determination ofmalachite green in fish productand watersamples ofaquaculture using CdTe/ZnS water-soluble quantum dots as fluorescentprobes

表3 水溶性CdTe/ZnS量子點探針法檢測水產品和漁業(yè)養(yǎng)殖水體中孔雀石綠的假陽性率試驗Table3 False positive rate testfordetermination ofmalachite green in aquatic productsand aquaculture watersamplesusing CdTe/ZnS water-soluble quantum dots as fluorescentprobes

2.6.2 假陰性率試驗

對40份分別添加孔雀石綠質量濃度為0.010 mg/kg的陽性草魚、鳙、鯽、鱖、黃鱔、鯰、養(yǎng)殖淡水和養(yǎng)殖海水8個樣品（每種樣品各5次重復），用水溶性量子點熒光探針法進行孔雀石綠殘留的快速判定。結果（表4）表明，40份陽性草魚、鳙、鯽、鱖、黃鱔、鯰、養(yǎng)殖淡水和養(yǎng)殖海水樣品的檢測結果均為陽性，與真實樣品一致，未出現(xiàn)假陰性結果。這進一步說明水溶性量子點熒光探針法在判定水產品及其養(yǎng)殖水環(huán)境孔雀石綠殘留特征時，抗干擾性較強。

表4 水溶性CdTe/ZnS量子點探針法檢測水產品和漁業(yè)養(yǎng)殖水體中孔雀石綠的假陰性率試驗Table4 False negative rate testfordetermination ofmalachite green in aquatic products and aquaculture watersamples using CdTe/ZnS water-soluble quantum dots as fluorescentprobes

2.6.3 水溶性量子點熒光探針法和LC-MS法檢測實際樣品的結果比較

隨機選取草魚、鳙、鯽、鱖、黃鱔、鯰、養(yǎng)殖淡水和養(yǎng)殖海水8個樣品(每種樣品各2份)，分別用水溶性量子點熒光探針法和LC-MS儀器方法[20]進行檢測比對。結果（表5）表明，水溶性量子點熒光探針法和LC-MS儀器方法的測定結果一致，符合度達到100%。這再次表明水溶性量子點熒光探針法適用于水產養(yǎng)殖違禁添加品孔雀石綠的檢測，且具有較好的選擇性。

表5 水溶性量子點熒光探針法和LC-MS法檢測實際樣品的結果比較Table5 Comparison ofthe results ofwater-soluble quantum dots as fluorescentprobe and LC-MS methods for the determination ofrealsamples

2.7 CdTe/Zns量子點熒光探針法檢測孔雀石綠的作用機制

從圖11中可知，CdTe/ZnS量子點的最大熒光發(fā)射峰位于570 nm處，而孔雀石綠的最大吸收光譜峰位于618 nm處，兩者有較好的光譜重疊性，具有共振能量轉移的基礎。此外，量子點CdTe/ZnS量子點表面的巰基乙酸含有豐富的羧基，使得其表面帶負電荷，而孔雀石綠是一種三苯甲烷類陽離子染料，帶正電荷，因此，兩者可通過靜電吸引力結合，進而促進共振能量轉移[23]。這一機制在不同質量濃度孔雀石綠對水溶性CdTe/ZnS量子點熒光強度影響的研究中得到了證實（圖9）。由于孔雀石綠是非熒光染料，在共振能量轉移過程中不存在孔雀石綠熒光變化現(xiàn)象，而加入不同質量濃度孔雀石綠溶液后，導致CdTe/ZnS量子點熒光強度隨著孔雀石綠質量濃度的增加而降低。說明CdTe/ZnS量子點所發(fā)射的熒光能量部分被孔雀石綠吸收了，兩者之間發(fā)生了能量的有效傳遞。

圖11 CdTe/ZnS量子點熒光發(fā)射光譜(A)和孔雀石綠紫外-可見吸收光譜(B)Fig.11 Fluorescence spectra of CdTe/ZnS quantum dots(A)and ultraviolet-visible absorption spectra ofmalachite green(B)

圖12 CdTe/ZnS-MG體系的共振光散射光譜Fig.12 Resonance lightscattering spectra of CdTe/ZnS-MG system

此外，通過共振光散射技術（RLS）掃描進一步證實了CdTe/ZnS量子點和孔雀石綠之間發(fā)生了相互作用。從圖12中可知，單獨的CdTe/ZnS量子點和孔雀石綠在250～700 nm范圍內共振光散射強度均很弱；但當CdTe/ZnS量子點與孔雀石綠溶液相互作用后，在同樣波長范圍內，RLS光譜峰峰型發(fā)生顯著改變，特別是在370 nm和568 nm處的共振光強度顯著增強，證明CdTe/ZnS量子點和孔雀石綠之間發(fā)生了相互作用，形成了新的顆粒，從而導致體系共振光強度增強。

3 結論

基于孔雀石綠對水溶性CdTe/ZnS量子點的熒光猝滅特性，建立了一種測定水產養(yǎng)殖中違禁添加孔雀石綠殘留的新方法。在pH 8.0的0.065 mol/L Tris-HCl緩沖溶液及1.6×10－4mol/L CdTe/ZnS量子點體系中，孔雀石綠質量濃度在0.019 3～1.28 mg/L范圍內，與水溶性CdTe/ZnS量子點的熒光猝滅強度呈良好的線性關系，相關系數(shù)為r=0.999，檢出限為0.005 43 mg/L。該方法可成功用于淡水和海水養(yǎng)殖用水以及魚肉組織中違禁添加孔雀石綠殘留的測定，添加回收率為90.4%～100.3%。該方法對水產品和養(yǎng)殖用水檢測結果與LC-MS法結果一致，且假陽性和假陰性率試驗結果也均與真實樣品一致：說明水溶性量子點熒光探針法對孔雀石綠殘留檢測具有較好的特異性，且操作簡單，分析快速，靈敏度高，為孔雀石綠殘留檢測提供了一種新方法。此外，通過紫外-可見吸收光譜及共振光散射技術研究發(fā)現(xiàn)，孔雀石綠對水溶性CdTe/ZnS量子點熒光猝滅機制是量子點與孔雀石綠的相互作用而建立起的共振能量轉移體系。

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XIE Xiaomei,LIAO Min*,HUANG Yu,YE Zhaojin,LüTing
(Zhejiang Provincial Key Laboratory of Subtropical Soil and Plant Nutrition,College of Environmental and Resource Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

water-soluble quantum dots;fluorescentprobe;malachite green;fluorescence quenching

R 917

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2016.10.031

國家自然科學基金（41571226，41371312)；公益性行業(yè)（農業(yè))科研專項（201203045)；浙江省測試基金項目（2015C37079）。

*通信作者(Corresponding author)：廖敏(http://orcid.org/0000-0003-2195-9918)，E-mail:liaomin@zju.edu.cn

謝曉梅(http://orcid.org/0000-0002-4956-4785)，E-mail:xiexiaomei@zju.edu.cn

2016-10-03；接受日期(Accepted)：2016-11-20