司華哲， 劉晗璐， 南韋肖,2， 金春愛(ài)， 李光玉*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林，長(zhǎng)春 130112； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林，長(zhǎng)春130118)

我國(guó)是產(chǎn)糧大國(guó)，農(nóng)副秸稈資源豐富。稻米作為我國(guó)主要糧食種類(lèi)，全國(guó)種植量大，但由于對(duì)秸稈綜合利用不足導(dǎo)致大量秸稈被堆放在田間后隨意焚燒，對(duì)空氣造成了嚴(yán)重污染。據(jù)文獻(xiàn)記載，稻秸年產(chǎn)量約為1.89億噸，其中我國(guó)主要糧食種植區(qū)之一的東北地區(qū)稻秸產(chǎn)量為3149.15萬(wàn)噸，占全國(guó)總量的14.18%[1]。自然風(fēng)干后的稻秸是一種劣質(zhì)的粗飼料，刈割后的粳稻秸稈水分含量低，適口性差，干物質(zhì)的消化率低，即使反芻動(dòng)物瘤胃微生物也很難加以分解利用，這也是制約稻秸作為動(dòng)物粗飼料的主要因素，而經(jīng)過(guò)加工處理后的秸稈，可提高反芻動(dòng)物的采食量和消化率[2]。

秸稈飼料的加工方式主要有物理、化學(xué)和生物處理3種，其中物理法僅停留在長(zhǎng)度、粗細(xì)等物理狀態(tài)的改變而不能增加飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，化學(xué)處理法通常為堿化、氨化或酸化處理，其加工費(fèi)用較高且處理液處置不當(dāng)易造成環(huán)境污染，生物法因其可較好的保留秸稈營(yíng)養(yǎng)價(jià)值且延長(zhǎng)其保存時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)已在我國(guó)畜牧生產(chǎn)中普遍推廣使用[3]。低水分青貯為特殊青貯的方法之一，適用原料來(lái)源更加廣泛，同時(shí)克服原料水分不足的缺點(diǎn)，因而適用于東北刈割脫粒后的粳稻秸稈。

低水分青貯通常使用外源添加劑促進(jìn)青貯過(guò)程，其中外源添加乳酸菌可克服原料本身附著乳酸菌少和緩沖能高等缺點(diǎn)，加速青貯過(guò)程，提高發(fā)酵品質(zhì)[4]。不同發(fā)酵類(lèi)型乳酸菌發(fā)酵終產(chǎn)物不同，其中同型發(fā)酵乳酸菌可提高青貯的乳酸含量，降低pH值，極大的提高青貯質(zhì)量，而異型發(fā)酵乳酸菌可分解利用乳酸生成乙醇和乙酸，前者有一定的殺菌作用，后者則可抑制真菌的繁殖，這對(duì)青貯過(guò)程中有害細(xì)菌的減少及開(kāi)窖后有氧穩(wěn)定性的提高均有促進(jìn)作用。Guo等研究發(fā)現(xiàn)，添加同型發(fā)酵乳酸菌青貯可提高青貯牛尾草的干物質(zhì)、粗蛋白和乳酸生成量[5]。Kleinschmit等研究發(fā)現(xiàn)，在牧草、玉米與谷類(lèi)秸稈青貯過(guò)程中添加異型發(fā)酵乳酸菌，可以降低青貯的pH，提高乳酸含量，并提高青貯的有氧穩(wěn)定性[6]。因此，本試驗(yàn)采用從吉林地區(qū)青貯狀況良好的玉米青貯飼料中分離得到的同型發(fā)酵乳酸菌植物乳桿菌(Lactobacillusplantraum)S2406和異型發(fā)酵乳酸菌布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)H4001應(yīng)用于低水分青貯稻秸，監(jiān)測(cè)其發(fā)酵后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化，研究上述兩株乳酸菌對(duì)稻秸發(fā)酵品質(zhì)的影響，為更科學(xué)有效地利用分離得到的優(yōu)良乳酸菌及改善稻秸發(fā)酵品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)用菌種來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室自主分離、鑒定、保存的布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)H4001及植物乳桿菌(Lactobacillusplantraum)S2406，使用MRS乳酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液中含活菌數(shù)約為1×1010cfu·mL-1，作為試驗(yàn)用菌株。以吉林省雙陽(yáng)區(qū)種植粳稻副產(chǎn)品稻秸為低水分青貯材料。使用直徑8 cm，高20 cm，壁厚0.1 cm，容積為1 L的螺口樹(shù)脂瓶作為青貯容器。

試驗(yàn)根據(jù)添加物質(zhì)不同。分為4個(gè)處理組：1組噴灑等量的無(wú)菌水(CS)；2組噴灑布氏乳桿菌H4001(HS)，添加量為5×106cfu·g-1FM；3組噴灑植物乳桿菌S2406組(SS)，添加量為5×106cfu·g-1FM；4組噴灑植物乳桿菌與布氏乳桿菌混合菌液(MS)，添加量為(2.5+2.5)×106cfu·g-1FM。

1.2 低水分青貯制作

2016年10月7日，將刈割脫粒后的粳稻秸稈切碎至1～1.5 cm長(zhǎng)短，將植物乳桿菌S2406與布氏乳桿菌H4001新鮮培養(yǎng)液使用無(wú)菌去離子水稀釋后，使用噴壺均勻噴灑于稻秸上，噴灑量為5×106cfu·g-1FM，取950～1 000 g快速壓實(shí)填緊于容積1 L的樹(shù)脂瓶中；對(duì)照組，噴灑等量的無(wú)菌水。制作結(jié)束后，青貯瓶室溫保存，定期檢查瓶口封閉狀態(tài)，如有松動(dòng)及時(shí)旋緊瓶蓋。室溫發(fā)酵，試驗(yàn)期60天。

1.3 樣品采集與分析

取粳稻秸稈500 g，每組3個(gè)重復(fù)，放入鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，65℃下烘干48 h，測(cè)定含水量，粗蛋白質(zhì)(crude protein, CP)，粗脂肪(ether extract, EE)可溶性碳水化合物(water soluable carbohydrate, WSC)，中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF)，酸性洗滌纖維(acid detergent fibre, ADF)和灰分(Ash)含量。

60 d后取樣品30 g，放入500 mL錐形瓶中，加入270 mL無(wú)菌蒸餾水，攪拌均勻后靜置2 h，將混有樣品的蒸餾水用攪拌器(方成 SG260-B，中國(guó))攪拌10 min，攪拌液經(jīng)4層紗布過(guò)濾，測(cè)定該濾液的pH值，揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids, VFAs)，乙醇(ethanol, ETH)，乳酸(lactic acid, LA)，氨態(tài)氮(ammoniacal nitrogen, NH3-N)含量。另取青貯樣品400 g進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的測(cè)定，檢測(cè)干物質(zhì)(dry matter, DM)、CP、EE、WSC、ADF、NDF和Ash含量。

1.4 測(cè)定方法

水分、CP、NDF、ADF采用飼料檢測(cè)技術(shù)測(cè)定[7]；WSC的測(cè)定采用蒽酮比色法進(jìn)行測(cè)定；粗灰分采用灼燒法測(cè)定；pH值使用精密pH測(cè)試儀測(cè)定；NH3-N含量采用蒸餾法測(cè)定；乳酸、乙醇和揮發(fā)性脂肪酸含量使用氣相色譜儀測(cè)定。60天后，將暴露在空氣中的青貯瓶置于相同條件下環(huán)境中，周?chē)h(huán)境保持24℃恒溫，使用針式食品溫度計(jì)在樣本正中插入約10 cm深，保持敞口。每隔12 h記錄一次樣本核心溫度，當(dāng)樣本的溫度超過(guò)室溫2℃時(shí)作為判定標(biāo)準(zhǔn)[8]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，均值采用Duncan氏進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌添加劑粳稻秸稈發(fā)酵pH值的影響

發(fā)酵60 d后，CS、HS、SS和MS的pH值如表1所示。各處理組間差異顯著(P<0.05)，其中，乳酸菌添加組pH均低于4.0，分別為HS>MS>SS，而CS的pH值顯著高于其他3組，這表明，添加乳酸菌具有降低青貯pH值的效果，單獨(dú)添加植物乳桿菌對(duì)青貯pH下降更有利。

表1 青貯后各組pH值Table 1 The pH valve after silage fermentation

注：表中同行不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)

Note：Different letters in the same row indicate significant differenc at the 0.05 level

SS組乳酸生成量大于其他三組但差異不顯著，HS的乙酸和乙醇生成量均顯著大于其他3組(P<0.05)(表2)，3個(gè)處理組戊酸、丁酸含量均顯著小于對(duì)照組(P<0.05),且互相之間差異不顯著，丙酸的生成量為CS>MS>SS>HS。表明添加布氏乳桿菌可以提高低水分青貯乙酸和乙醇的產(chǎn)生，減少丙酸、丁酸和戊酸的生成。植物乳桿菌可以提高乳酸的生成量。添加乳酸菌后，可以減少青貯的丙酸、丁酸和戊酸的生成量。

表2 青貯中乳酸、乙醇、乙酸、丙酸和丁酸含量Table 2 Contents of lactic, ethanol, acetic, propionic acids, butyric acids and valeric acids/μmol·g-1 FM

注：表中同列不同小寫(xiě)字母表示數(shù)值差異顯著(P<0.05)

Note：Different in the same column letters indicate significant differences at the 0.05 level

2.3 添加乳酸菌對(duì)粳稻秸稈發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分的影響

發(fā)酵60 d后，CS、MS、SS和HS同青貯前相比各營(yíng)養(yǎng)成分均有不同程度的變化(表3)。對(duì)比原料，4個(gè)處理組的CP、WSC、ADF、EE和Ash的含量顯著降低(P<0.05)，而青貯前DM含量與SS組差異不顯著但顯著高于其他3組(P<0.05)。

青貯原料含水量以及蛋白含量較低，但其可溶性糖含量較高，可用于青貯。青貯后，處理組與對(duì)照組相比，DM、CP、WSC含量上均有顯著提高(P<0.05)，氨態(tài)氮含量顯著降低(P<0.05)，NDF、ADF、EE和Ash含量無(wú)顯著差異。其中，SS組DM、CP含量，HS組的WSC和ADF含量均顯著高于其他處理組(P<0.05)。這表明，添加植物乳桿菌可以降低青貯干物質(zhì)和粗蛋白的損耗，而添加布氏乳桿菌可以提高青貯的WSC含量。

2.4 添加乳酸菌對(duì)粳稻秸稈發(fā)酵有氧穩(wěn)定性的影響

4組的有氧穩(wěn)定性時(shí)間分別為：CS組56 h，SS組92 h，HS組121 h，MS組100 h。與CS組相比，SS、HS和MS組的有氧穩(wěn)定性分別延長(zhǎng)了36 h、65 h和44 h，即分別提高了64%、116%和78%。由表4可知，添加植物乳桿菌也可以提高青貯的有氧穩(wěn)定性，但添加布氏乳桿菌對(duì)提高青貯的有氧穩(wěn)定性效果更佳。

表3 青貯前后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化Table 3 Chemical composition of the silages

注：表中同列不同小寫(xiě)字母表示數(shù)值差異顯著(P<0.05)

Note：Different letters in the same column indicate significant differnce at the 0.05 level

表4 青貯有氧穩(wěn)定性結(jié)果Table 4 Aerobic stability of silage exposed to air/h

3 討論

3.1 不同乳酸菌添加劑對(duì)粳稻秸稈發(fā)酵pH值、有機(jī)酸及揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

乳酸菌添加劑對(duì)青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：一是加快發(fā)酵速度，二是改變發(fā)酵終產(chǎn)物的含量[9]。本試驗(yàn)中植物乳桿菌組乳酸含量顯著低于其他3組，而布氏乳桿菌組乙醇、乙酸生成量顯著高于其他3組，這與Weinters和Muck的研究結(jié)果一致，同型發(fā)酵乳酸菌發(fā)酵終產(chǎn)物為乳酸，而異型發(fā)酵乳酸菌在厭氧條件下將乳酸分解成乙酸、1,2-丙二醇、CO2和乙醇[10-11]?；旌辖M的乳酸含量低于植物乳桿菌組但高于布氏乳桿菌添加組，其乙醇和乙酸含量則表現(xiàn)出相反結(jié)果，這表明混合添加不同發(fā)酵類(lèi)型乳酸菌，可有效提高低水分青貯稻秸乳酸和乙酸生成量。

丁酸的發(fā)酵程度是鑒定青貯飼料好壞的重要指標(biāo)，丁酸含量越多，青貯料品質(zhì)越差。本試驗(yàn)中，處理組丙酸、丁酸、戊酸生成量均顯著低于對(duì)照組，這是因?yàn)橥庠慈樗峋砑踊钚詮?qiáng)，且壓實(shí)的青貯提供了乳酸菌繁殖所需的厭氧環(huán)境，其大量繁殖生成乳酸，降低了青貯的pH值，酸性環(huán)境與厭氧環(huán)境抑制了其他細(xì)菌的繁殖及對(duì)青貯DM和CP等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損耗，從而提高了青貯的發(fā)酵品質(zhì)[12]。而對(duì)照組青貯pH值、丙酸、丁酸和戊酸顯著高于其他處理組，這可能是因?yàn)樗颈旧砀街娜樗峋鷶?shù)量少，且稻秸中空，壓實(shí)后仍有少量空氣存在，延緩了形成厭氧環(huán)境的時(shí)間，使乳酸菌無(wú)法快速繁殖產(chǎn)酸，并降低青貯的pH值，從而使產(chǎn)丙酸、丁酸和戊酸的好氧細(xì)菌，如丁酸菌等活動(dòng)并大量繁殖，將葡萄糖和乳酸分解成丙酸、丁酸和戊酸等，降低青貯飼料的品質(zhì)。反芻動(dòng)物雖然可以直接利用揮發(fā)性脂肪酸供能，但由于其易揮發(fā)的特點(diǎn)，在開(kāi)窖到飼喂過(guò)程中，可能有大量揮發(fā)性脂肪酸損失。本試驗(yàn)中，60 d后乳酸含量偏低，乙酸含量較高?？赡苁怯捎谠媳旧砀街樗峋酁楫愋桶l(fā)酵乳酸菌[13]，在青貯后期，分解乳酸生成乙酸導(dǎo)致的，其真正原因仍需進(jìn)一步研究。因此，在稻秸青貯過(guò)程中，應(yīng)額外添加乳酸菌或碳水化合物以便提高其發(fā)酵品質(zhì)，降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損耗。

3.2 不同乳酸菌添加劑對(duì)粳稻秸稈發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)成分的影響

青貯后稻秸的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)比青貯前均有一定程度的下降，這是由青貯過(guò)程中微生物的利用導(dǎo)致的。乳酸菌處理組與對(duì)照組相比，DM、CP、ADF和WSC的含量均有顯著提高，這與Vaitiekunas與Francisco等人的試驗(yàn)結(jié)果一致[14,15]。添加乳酸菌可以加快發(fā)酵速度，減少其他細(xì)菌繁殖對(duì)青貯營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，其中添加植物乳桿菌后青貯的DM和CP含量提高效果顯著高于布氏乳桿菌，這可能是因?yàn)椴际先闂U菌作為異型發(fā)酵乳酸菌發(fā)酵的終產(chǎn)物不同引起的。當(dāng)青貯中乳酸過(guò)高時(shí)，布氏乳桿菌可分解乳酸，導(dǎo)致青貯的pH值上升，降低了對(duì)其他細(xì)菌的抑制能力，對(duì)青貯DM和CP的保留能力較植物乳桿菌減弱，但在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)布氏乳桿菌組WSC和ADF含量顯著高于植物乳桿菌，這與Kung的研究結(jié)果并不一致[16]，原因可能是微生物繁殖需利用青貯中的WSC作為發(fā)酵底物，而異型發(fā)酵乳酸菌在實(shí)際青貯過(guò)程中繁殖速度和數(shù)量少于植物乳桿菌，植物乳桿菌大量繁殖的同時(shí)加大了對(duì)青貯WSC消耗[17]。布氏乳桿菌分解乳酸生成乙醇和乙酸，乙醇有殺菌作用，且乙酸可以抑制一些真菌繁殖，加之布氏乳桿菌繁殖速度弱于植物乳桿菌，因此青貯的WSC含量高于其他組。試驗(yàn)中對(duì)照組和植物乳酸菌處理組ADF含量顯著低于原料，可能是由于青貯過(guò)程中水稻秸稈中纖維素被微生物降解利用后生成半纖維素導(dǎo)致的，半纖維素含量的增高導(dǎo)致了酸性洗滌可溶物的增加，減少了ADF的含量，而HS與MS可能由于其乙酸乙醇含量高于其他組抑制了纖維素降解菌的繁殖[18]。NH3-N含量與青貯CP含量密切相關(guān)，其由腐敗微生物消耗CP產(chǎn)生[19]。本試驗(yàn)中，植物乳桿菌組CP含量顯著高于其他組，其N(xiāo)H3-N含量顯著低于其他組。青貯后各組粗脂肪含量顯著低于原料，原因可能是霉菌等微生物大量生長(zhǎng)，從而分解消耗粗脂肪[20]。混合組在青貯過(guò)程中，綜合了兩種乳酸菌對(duì)提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，雖在各項(xiàng)指標(biāo)中均未顯著高于其他3組，但顯著性均介于兩者之間。這表明，單獨(dú)或混合使用不同發(fā)酵類(lèi)型乳酸菌可獲得不同的發(fā)酵品質(zhì)，針對(duì)不同情況，可以自由選擇添加。通過(guò)以上試驗(yàn)結(jié)果可以說(shuō)明，適量使用乳酸菌添加劑可有效提高水稻秸稈的發(fā)酵品質(zhì)，減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損耗。

3.3 添加乳酸菌對(duì)粳稻秸稈發(fā)酵有氧穩(wěn)定性的影響

青貯的有氧穩(wěn)定性定義為青貯飼料在空氣中暴露后其內(nèi)部溫度比外界溫度高出2℃所需要的小時(shí)數(shù)[8]。前人研究發(fā)現(xiàn)異型發(fā)酵乳酸菌可影響青貯有氧穩(wěn)定性，但延長(zhǎng)的時(shí)間并無(wú)統(tǒng)一定論。Danna通過(guò)對(duì)比多種影響青貯有氧穩(wěn)定性的化學(xué)物質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，乙酸可大幅度提高青貯的有氧穩(wěn)定性[21]。本試驗(yàn)中，布氏乳桿菌組乙酸生成量顯著高于其他組，并且其有氧穩(wěn)定性時(shí)間最長(zhǎng)，比對(duì)照組延長(zhǎng)了65 h，這可以說(shuō)明乙酸生成量與有氧穩(wěn)定性成正比。目前同型發(fā)酵乳酸菌對(duì)有氧穩(wěn)定性提高的報(bào)道很少。而在本試驗(yàn)中植物乳桿菌處理組的有氧穩(wěn)定性較對(duì)照組提高了36 h，這可能是因?yàn)槿樗峋哂休^強(qiáng)的耐酸作用，當(dāng)pH下降到4時(shí)，其他細(xì)菌受抑制活性下降，而其中的異型發(fā)酵乳酸菌可在酸性環(huán)境利用乳酸。在青貯后期，即使未添加布氏乳桿菌的處理組，如果青貯原料生長(zhǎng)環(huán)境中存在該菌，則青貯后會(huì)存在一定比例的布氏乳桿菌，而同型發(fā)酵乳酸菌對(duì)青貯有氧穩(wěn)定性的提高仍是由其中布氏乳桿菌存在導(dǎo)致的[16]?；旌辖M的有氧穩(wěn)定性時(shí)間較對(duì)照組提高了44 h，這表明混合添加不同發(fā)酵類(lèi)型乳酸菌在青貯粳稻秸稈開(kāi)窖后對(duì)有氧穩(wěn)定性有延長(zhǎng)作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)中，添加不同發(fā)酵類(lèi)型乳酸菌對(duì)粳稻秸稈發(fā)酵品質(zhì)提高效果不同，針對(duì)生產(chǎn)實(shí)際情況，建議單獨(dú)或混合添加兩種發(fā)酵類(lèi)型乳酸菌，發(fā)揮不同組合的優(yōu)勢(shì)，解決實(shí)際生產(chǎn)中不同問(wèn)題。乳酸菌處理后的粳稻秸稈，不僅對(duì)秸稈資源的合理利用起到重要作用，而且可以緩解北方地區(qū)冬春季青飼料缺乏的問(wèn)題。在未來(lái)的研究中，仍需進(jìn)一步通過(guò)試驗(yàn)評(píng)價(jià)使用添加劑青貯低水分粳稻秸稈對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能的影響。