趙立娜段碩楠張華寧郭秀林,*李國良,*

1河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所 / 河北省植物轉(zhuǎn)基因中心重點實驗室, 河北石家莊 050051;2河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河北石家莊 050024

玉米熱激轉(zhuǎn)錄因子基因ZmHsf25的克隆、特性與耐熱性功能分析

趙立娜1,2,**段碩楠1,**張華寧1郭秀林1,*李國良1,*

1河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所 / 河北省植物轉(zhuǎn)基因中心重點實驗室, 河北石家莊 050051;2河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河北石家莊 050024

植物熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factor, Hsf)對下游熱激蛋白基因及耐熱性相關(guān)基因的表達(dá)起關(guān)鍵調(diào)控作用。玉米中至少有30個Hsf家族成員, 其中B族有7個。在前期對玉米A1亞族熱激轉(zhuǎn)錄因子基因ZmHsf06克隆及特性、抗旱耐熱性功能分析的基礎(chǔ)上, 從玉米幼葉中克隆到B族熱激轉(zhuǎn)錄因子基因ZmHsf25的完整編碼序列,序列全長957 bp, 編碼318個氨基酸殘基。蛋白質(zhì)序列含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、核定位信號序列和核輸出信號序列, 同源分析結(jié)果顯示, ZmHsf25與高粱 Sb06g025710的相似性最高, 達(dá) 92%。熒光定量分析表明, 正常生長條件下, ZmHsf25在玉米多個組織器官中表達(dá), 幼嫩花粉中高表達(dá), 幼嫩根系和雌穗中表達(dá)量較低。42℃熱脅迫能顯著上調(diào)根系和葉片ZmHsf25的表達(dá), 葉片中上升幅度高于根系, 處理50 min達(dá)到峰值; 正常條件下, 水楊酸和H2O2處理均使根系和葉片ZmHsf25表達(dá)下調(diào), 而熱激條件下卻表現(xiàn)為顯著上調(diào)。通過在洋蔥表皮細(xì)胞中瞬時表達(dá)并觀察GFP熒光,確定ZmHsf25定位在細(xì)胞核。通過轉(zhuǎn)化酵母并進行熱脅迫處理發(fā)現(xiàn), 熱脅迫同時降低正常和轉(zhuǎn)ZmHsf25酵母的耐熱性, 但與轉(zhuǎn)空載體對照相比, 轉(zhuǎn)基因酵母的耐熱性更強。推測 ZmHsf25參與玉米熱脅迫響應(yīng)和花粉的發(fā)育過程, 可能是水楊酸熱激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游組分。研究結(jié)果為進一步探明玉米熱激轉(zhuǎn)錄因子家族成員的特性與功能提供了依據(jù)。

玉米; 熱激轉(zhuǎn)錄因子基因ZmHsf25; 表達(dá); 亞細(xì)胞定位; 耐熱性

許多研究已表明, 植物熱激蛋白(Hsp, heat shock protein)與植株耐熱性的提高密切相關(guān), 而植物熱激轉(zhuǎn)錄因子(Hsf, heat shock transcription factor)對下游熱激蛋白基因及耐熱性相關(guān)基因的表達(dá)起關(guān)鍵調(diào)控作用, 是植物對高溫脅迫反應(yīng)的關(guān)鍵因子。自 20世紀(jì)80年代后期首次克隆酵母Hsf以來, 相繼獲得動植物多個物種的 Hsf基因[1-3]。熱激轉(zhuǎn)錄因子在植物中普遍存在, 首個植物 Hsf基因來自番茄[4]。與其他生物體相比, 植物中的Hsf基因是一個多基因家族, 依據(jù)結(jié)構(gòu)分為 A、B、C三族, 細(xì)分為多個亞族。Hsf家族基因數(shù)目因作物品種不同差異較大, 果蠅和酵母中只有1個, 而小麥中至少有56個[5], 從數(shù)量上遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于已知的其他生物體。相比于其他植物, 對模式植物番茄和擬南芥Hsf基因功能和調(diào)控機制研究得比較深入, 研究對象主要集中在A1和A2亞族[6-8]。

關(guān)于B族Hsf的研究報道不多, 該族基因因不含激活結(jié)構(gòu)域而不能直接激活下游基因的表達(dá), 早期研究認(rèn)為其作用更多表現(xiàn)為抑制[9-10]。近年來, 越來越多的功能被逐漸報道。擬南芥中有5個B族Hsf,其中HsfB2a和HsfB2b屬于熱誘導(dǎo)型, 主要在熱激反應(yīng)后期起作用, 但其熱激誘導(dǎo)表達(dá)的前提是與HsfA1a和HsfA1b結(jié)合。HsfB1和HsfB2b定位在細(xì)胞核, 正常生長和熱恢復(fù)階段直接抑制熱激轉(zhuǎn)錄因子HsfA2的活性, 進而抑制一系列Hsp基因的表達(dá),從而鈍化熱激反應(yīng)。但在熱激條件下, HsfB1和HsfB2b可能通過抑制某些干擾 HsfA1轉(zhuǎn)位入核的Hsp基因的表達(dá), 從而促進HsfA1入核而激活HsfA1,進而提高獲得耐熱性能力[10], 表現(xiàn)出正向調(diào)控功能。轉(zhuǎn)鷹嘴豆CarHsfB2的擬南芥表現(xiàn)較強的抗旱和耐熱性[11]。HsfB1和HsfB2b還參與pdf1.2的表達(dá)和抗病反應(yīng)[12], 核中過表達(dá) HsfB1可導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13]。HsfB2b組成型表達(dá)可降低節(jié)律相關(guān)基因 Pseudo response regulator 7 (PRR7)的表達(dá), 使得植株延遲開花, 下胚軸伸長, 因此在調(diào)控逆境條件下植株生物鐘變化方面起重要作用[14]。番茄HsfB1作為共激活因子可增強HsfA1a和/或HsfA2的活性, 熱激條件下可保持和恢復(fù)某些重要基因或持家基因的表達(dá)[15-16]。另外, 過表達(dá)擬南芥HsfB4可特異性誘導(dǎo)根系發(fā)育[17],水稻HsfB4b可通過結(jié)合特異HSE而調(diào)控病程防御反應(yīng)[18]?？梢? B族Hsf在植物抗逆、抗病過程中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用, 隨著研究的逐步深入, 越來越多B族Hsf的特性和功能將得以解析。

通過生物信息學(xué)推測, 玉米中至少有30個Hsf成員, B族有7個, 其中4個基因同時含有核定位信號和胞質(zhì)定位信號[3]。這些B族Hsf有什么樣的特性和功能, 目前還沒有相關(guān)報道。本實驗室在研究玉米A1亞族基因的同時, 克隆了B族成員ZmHsf25,擬初步分析其結(jié)構(gòu)、表達(dá)和亞細(xì)胞定位特性, 及其耐熱性調(diào)控功能, 以期為全面深入研究玉米熱激轉(zhuǎn)錄因子家族基因提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

供試材料為玉米(Zea mays L.)自交系H21 (實驗室備)。精選種子, 經(jīng)表面消毒后, 以自來水反復(fù)沖洗, 浸泡吸脹12 h后, 播至Hoagland營養(yǎng)液中, 于28℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。待玉米長到二葉一心時, 進行不同處理, 取樣進行定量表達(dá)分析。

于 2016年 5月上旬田間穴播試材, 常規(guī)種植,于開花盛期取功能葉、雌穗和花粉, 授粉 2周后取幼胚, 以液氮速凍, 用于組織器官中基因定量分析。

1.2 脅迫處理

將生長一致的幼苗分為 5組, 分別將幼苗根部浸入溶液, 進行如下處理, 參照李慧聰?shù)萚19]的方法略加修改。(1)浸入 42℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱的 Hoagland營養(yǎng)液進行熱脅迫處理(HS), 處理時間分別為 10、20、30、40、50、60和240 min; (2)浸入含0.8 mmol L–1水楊酸(SA)的Hoagland溶液, 處理10、30、60、90、120和240 min; (3)浸入含10 mmol L–1H2O2的Hoagland溶液, 處理時間同水楊酸; (4)浸入含 0.8mmol L–1水楊酸(SA)的Hoagland溶液預(yù)處理1.5 h,然后移入新的含有SA的Hoagland溶液于42℃熱處理50 min; (5)浸入含10 mmol L–1H2O2的Hoagland溶液預(yù)處理 1.5 h, 然后移入新的含有 H2O2的Hoagland溶液于42℃熱處理50 min。取樣并以液氮速凍, 同時取28℃下正常生長的幼苗作對照。

1.3 基因克隆與測序

采用上海華舜生物工程公司生產(chǎn)的 RNArose Reagent Systems試劑盒提取總 RNA, 經(jīng) DNaseI (TaKaRa, 大連)處理除去殘留的基因組 DNA, 然后取1 μg合成cDNA第1鏈(反轉(zhuǎn)錄試劑盒, Invitrogen,美國)。依據(jù)玉米 B73基因組信息設(shè)計特異引物(正向引物5′-TCCGTTGCCTGATGGCGTTGCC-3′; 反向引物 5′-TCATTTCAGCCCTAGACTGAGGC-3′),利用高保真酶pyrobest (TaKaRa, 大連)進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系(25 μL)含10×pyrobest buffer 2.5 μL、dNTP mixture (2.5 mmol L–1) 2 μL、1st strand cDNA 2 μL、20 μmol L–1正向引物0.25 μL、20 μmol L–1反向引物 0.25 μL、Pyrobest DNA polymerase 0.25 μL和ddH2O 17.75 μL。反應(yīng)程序為98℃ 10 s, 55℃ 15 s, 72℃ 2 min, 30個循環(huán)。將擴增產(chǎn)物連接T載體后(pEasy-blunt simple cloning kit, TransGen Biotech, 北京), 送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.4 qRT-PCR分析

依據(jù)Lin等[20]對玉米Hsf的分析合成ZmHsf25的特異引物(正向引物 5'-AGTGAAGCCAATGCTG TTCG-3'; 反向引物 5′-CTTGTTCCTCGTCGTTGTC C-3′), 和玉米內(nèi)參基因 β-actin的特異性引物(正向引物5′-TGTCCATCACTTGTGAAGCCTCCT-3′; 反向引物5′-ACGACCTTAGCCAATATCGCACCA-3′)。PCR體系(20 μL)含: SYBR Premix Ex TaqII 10 μL、10 μmol L–1正向引物 0.8 μL、10 μmol L–1反向引物0.8 μL、1st strand cDNA 1 μL和ddH2O 7.4 μL。反應(yīng)在7500 Real-time PCR System (Applied Biosystems, USA)上進行, 反應(yīng)程序: 預(yù)變性95℃ 10 min,變性 95℃ 5 s, 退火/延伸60℃ 1 min, 45個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后, 采用2–ΔΔCt分析數(shù)據(jù)。每組試驗設(shè)3個生物學(xué)樣本, 每個生物學(xué)樣本設(shè) 3次技術(shù)重復(fù)。數(shù)據(jù)為3個生物學(xué)重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, 組織表達(dá)試驗以幼根表達(dá)量為1, 其余設(shè)置0 min的表達(dá)量為1。

1.5 ZmHsf25亞細(xì)胞定位觀察

帶有綠色熒光蛋白(GFP)基因的植物表達(dá)載體pJIT163-hGFP (中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所范仁春博士提供)通過35S啟動子驅(qū)動目的基因和GFP基因的融合表達(dá)[21], 顯示目的蛋白的亞細(xì)胞定位。擴增 ZmHsf25編碼區(qū), 產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hind III和 BamH I消化后, 連接到表達(dá)載體pJIT163-hGFP上。參照李慧聰?shù)萚22]方法進行金粉包埋和基因槍轉(zhuǎn)化。經(jīng)轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮細(xì)胞于22℃暗培養(yǎng)16 h, 然后放入濃度為10 μg mL–1的4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色液中染色3～5 min, 用生理鹽水沖洗干凈, 于激光共聚焦顯微鏡(Zeiss META510)下觀察熒光。

1.6 酵母表達(dá)載體構(gòu)建

酵母表達(dá)載體pYES2 (Invitrogen, 美國)用于釀酒酵母中目的蛋白的表達(dá), 其特點在于 GAL1啟動子能夠在釀酒酵母中被半乳糖高水平誘導(dǎo)從而驅(qū)動目的蛋白表達(dá), 同時能夠被葡萄糖抑制表達(dá), 可利用URA3基因篩選帶有ura3基因型的酵母宿主菌株轉(zhuǎn)化子。結(jié)合ClonExpress II重組反應(yīng)系統(tǒng)(諾唯贊生物科技有限公司)設(shè)計擴增 ZmHsf25特異引物(ZmHsf25-F: 5′-GGGAATATTAAGCTTGGTACCAT GGCGTTGCCGGCGGCG-3′; ZmHsf25-R: 5′-TGAT GGATATCTGCAGAATTCTCATTTCAGCCCTAGAC T-3′), 利用高保真 PCR 聚合酶進行擴增, 獲得ZmHsf25的PCR產(chǎn)物。利用限制性內(nèi)切酶Kpn I和EcoR I (NEB)對載體pYES2進行酶切, 電泳后回收得到線性化載體。將PCR產(chǎn)物與線性化載體按1∶2的摩爾比混合, 利用ClonExpress II快速克隆技術(shù)進行重組反應(yīng)。于冰水浴中配制如下反應(yīng)體系即4 μL 5×ClonExpress II buffer, 50～200 ng線性化載體, 20～200 ng插入片段擴增產(chǎn)物, 2 μL Exnase II, 加無菌水至總體積2 μL?；靹蚋鹘M分后, 于37℃反應(yīng)30 min, 立即置冰浴中冷卻 5 min, 然后利用熱激法將反應(yīng)產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞, 37℃倒置培養(yǎng)過夜。用無菌的牙簽將單個菌落挑至100 μL新鮮的LB培養(yǎng)基中, 混勻, 取2 μL作為模板進行PCR擴增, 根據(jù)電泳條帶大小選擇正確的克隆進行序列測定。

1.7 ZmHsf25在酵母中轉(zhuǎn)化及耐熱性鑒定

參照 Gietz等[23]的方法, 將測序正確的重組載體轉(zhuǎn)化酵母 INVSc1感受態(tài)細(xì)胞, 然后將細(xì)胞均勻涂抹在SC-Glu-Ura-篩選平板上, 30℃培養(yǎng)2～3 d。采用菌落PCR方法鑒定陽性克隆。

分別將重組載體 ZmHsf25-pYES2和空載體pYES2轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞INVSc1, 篩選陽性酵母克隆。分別挑選2個菌系的陽性克隆, 以SC-Glu-Ura-液體培養(yǎng)基振蕩(250轉(zhuǎn) min–1)培養(yǎng)過夜, 檢測OD600值。用 SC-Glu-Ura-液體培養(yǎng)基將酵母菌液稀釋到 0.2,重新振蕩(200轉(zhuǎn) min–1)培養(yǎng) 2～3 h, OD600值達(dá)到0.4～0.8之間即酵母指數(shù)生長期, 離心收集菌體, 無菌水洗滌2遍, 除去培養(yǎng)基, 然后梯度稀釋到0.10、0.05和0.01共3個OD值, 分成2組, 一組作為對照, 另一組用50℃水浴熱激處理45 min。吸取8 μL,分別點在加入半乳糖的 SC-Gal-Ura-固體培養(yǎng)基上, 30℃生長2～3 d, 觀察并照相。另外, 將指數(shù)生長期的酵母細(xì)胞稀釋到SC-Gal-Ura-液體培養(yǎng)基中, 分成2組, 一組作為對照, 另一組用 50℃水浴中熱激處理45 min, 振蕩(200轉(zhuǎn) min–1)培養(yǎng)24 h, 期間每間隔 3 h測定一次 OD600值, 計算生長速率。采用Microsoft Excel分析數(shù)據(jù), 計算標(biāo)準(zhǔn)誤差。采用SPSS統(tǒng)計方法分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米熱激轉(zhuǎn)錄因子基因 ZmHsf25的克隆與結(jié)構(gòu)分析

將二葉一心玉米幼苗于 42℃熱脅迫處理 1 h,提取葉片總 RNA, 以此為模板, 利用特異性引物,擴增獲得ZmHsf25基因的完整編碼序列(圖1), 序列全長957 bp, 編碼318個氨基酸殘基。ZmHsf25蛋白序列包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain, DBD, NCBI網(wǎng)站分析, 下畫線部分)、核定位信號序列(nuclear localization signal, NLS, NucPred軟件分析)和核輸出信號(nuclear export signal, NES, Net-NES軟件分析)序列。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是Hsf的典型結(jié)構(gòu)特征; 根據(jù)核定位信號序列推測ZmHsf25被定位于細(xì)胞核; 核輸出信號序列的存在表明在某些情況下 ZmHsf25可能會穿梭出核發(fā)揮功能。利用DNAMAN軟件分析表明, ZmHsf25蛋白與高粱Sb060g025710 (序列號為 XP_002446950.1)、谷子SiHSFB-2a-like (序列號為 XP_004976526.1)和水稻OSIGBa0103M18.7 (序列號為 CAH66855.1)的相似性分別為92%、81%和77% (圖2)。

2.2 ZmHsf25基因在玉米不同組織器官中的表達(dá)分析

通過分析玉米幼苗期和開花盛期不同組織器官中 ZmHsf25的定量表達(dá)發(fā)現(xiàn), 正常生長條件下, ZmHsf25在玉米根系中表達(dá)最低, 幼嫩花粉中表達(dá)量最高, 顯著高于其他器官, 達(dá)根系的 50倍, 其次是幼胚, 約為根系表達(dá)量的10倍(圖3)。

2.3 不同逆境脅迫對ZmHsf25表達(dá)的影響

圖1 玉米ZmHsf25的核苷酸和氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide and amino acid sequences of ZmHsf25 from maize下畫線部分: Hsf家族保守DNA結(jié)合域; NLS: 核定位信號序列; NES: 核輸出信號序列。Underline: the conserved DNA binding domain of Hsf family; NLS: nuclear localization signal; NES: nuclear export signal.

42℃熱脅迫能顯著上調(diào)玉米幼苗葉片(圖 4-A)和根系(圖4-B) ZmHsf25的表達(dá), 處理50 min時達(dá)到峰值, 之后逐漸降低, 葉片最大值超過根系的2倍。正常生長條件下, 0.8 mmol L–1SA處理下調(diào)玉米根系ZmHsf25的表達(dá)(圖5-B), 對葉片基因表達(dá)影響不大(圖5-A); 10 mmol L–1H2O2處理對根系(圖6-B)和葉片(圖6-A)基因表達(dá)均表現(xiàn)為下調(diào), 根系在240 min時恢復(fù)至初始值; 如果用 0.8 mmol L–1SA或 10 mmol L–1H2O2分別預(yù)處理幼苗1.5 h, 然后熱激50 min, 葉片 ZmHsf25的表達(dá)被大幅度上調(diào)(圖 7)。表明在熱激條件下ZmHsf25可能參與SA和H2O2介導(dǎo)的信號通路。

2.4 玉米ZmHsf25蛋白的亞細(xì)胞定位

構(gòu)建瞬時表達(dá)載體 pJIT163-ZmHsf25-hGFP并轉(zhuǎn)化洋蔥內(nèi)表皮, 通過融合基因表達(dá)顯示目的蛋白的亞細(xì)胞定位。利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光發(fā)現(xiàn), 正常條件下, 觀察到 GFP綠色熒光只分布在細(xì)胞核, 且與核特異染料DAPI熒光完全重合(圖8)。表明ZmHsf25蛋白定位于細(xì)胞核。

圖2 玉米ZmHsf25蛋白與其他蛋白的相似性比較Fig. 2 Alignment of the putative amino acid encoded by ZmHsf25 and other proteins from different species

圖3 正常生長條件下幼苗期和開花期不同組織器官中ZmHsf25的相對表達(dá)水平Fig. 3 Expression levels of ZmHsf25 in different tissues and organs at seedling and anthesis stages under normal growthconditions每個樣本設(shè)3次重復(fù), 數(shù)據(jù)為3個生物學(xué)重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,組織表達(dá)試驗以幼根表達(dá)量為1。There are three replicates for each sample and the data are mean±standard error. The expression level 1 is the expression level in roots.

圖4 42°C熱處理對玉米ZmHsf25表達(dá)的影響Fig. 4 Expression levels of ZmHsf25 in leaves and roots of the maize seedlings subjected to heat shock at 42°CA: ZmHsf25在玉米葉片中的表達(dá); B: ZmHsf25在玉米根系中的表達(dá)。A: ZmHsf25 expression levels in maize leaves; B: ZmHsf25 expression levels in maize roots.

圖5 0.8 mmol L–1水楊酸處理對玉米幼苗ZmHsf25表達(dá)的影響Fig. 5 Expression levels of ZmHsf25 in leaves and roots of maize seedlings treated with 0.8 mmol L–1SAA: ZmHsf25在玉米葉片中的表達(dá); B: ZmHsf25在玉米根系中的表達(dá)。A: ZmHsf25 expression levels in maize leaves; B: ZmHsf25 expression levels in maize roots.

圖6 10 mmol L–1H2O2處理對玉米幼苗ZmHsf25表達(dá)的影響Fig. 6 Expression levels of ZmHsf25 in leaves and roots of the maize seedlings treated with 10 mmol L–1H2O2A: ZmHsf25在玉米葉片中的表達(dá); B: ZmHsf25在玉米根系中的表達(dá)。A: ZmHsf25 expression levels in maize leaves; B: ZmHsf25 expression levels in maize roots.

圖7 熱激條件下水楊酸和H2O2預(yù)處理對玉米葉片ZmHsf25表達(dá)的影響Fig. 7 Expression levels of ZmHsf25 in leaves of maize seedlings under heat shock at 42°C pretreated with 0.8 mmol L–1SA and 10 mmol L–1H2O2, respectively

圖8 玉米ZmHsf25蛋白質(zhì)在洋蔥表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位Fig. 8 Subcellular localization of ZmHsf25 in onion epidermal cells under normal conditionsA: 明場; B: GFP綠色熒光; C: 細(xì)胞核DAPI紅色熒光; D: 疊加圖像。A: bright field; B: green fluorescence of GFP; C: red fluorescence of DAPI; D: merged images.

2.5 玉米ZmHsf25在酵母中耐熱性鑒定

通過將玉米ZmHsf25在酵母中轉(zhuǎn)化并進行熱激處理, 觀察酵母生長發(fā)現(xiàn), 在正常生長條件下, 在半乳糖誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基上, 轉(zhuǎn)化 ZmHsf25與轉(zhuǎn)化空載體pYES2的酵母細(xì)胞的長勢無明顯差異(圖9-A);經(jīng)50℃熱激處理45 min后, 轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞和轉(zhuǎn)化空載體對照的生長速度均受到抑制, 但是前者的受抑制程度明顯小于后者(圖9-B)。酵母細(xì)胞生長速率實驗結(jié)果也充分證明了上述觀察結(jié)果(圖10-A, B)。這表明, ZmHsf25能在酵母細(xì)胞中被誘導(dǎo)表達(dá), 且能顯著提高酵母細(xì)胞的耐熱性。

圖9 50℃熱激處理后轉(zhuǎn)基因酵母耐熱性觀察Fig. 9 Thermotolerances assay of yeast harboring pYES2 or pYES2-ZmHsf25 after heat shock at 50°CA: 正常培養(yǎng); B: 50°C熱激35 min后正常培養(yǎng)。A: culture under normal conditions; B: culture under normal conditions after HS at 50°C for 45 min.

圖10 50°C熱激處理后轉(zhuǎn)基因酵母生長速率比較Fig. 10 Comparison of growth ratios between yeast harboring pYES2 and pYES2-ZmHsf25 after heat shock at 50°CA: 正常培養(yǎng); B: 50°C熱激15 min后正常培養(yǎng)。A: culture under normal conditions; B: culture under normal conditions after HS at 50°C for 45 min.

3 討論

植物熱激轉(zhuǎn)錄因子屬于多基因家族, 2011年, Lin等[20]通過生物信息學(xué)推測, 玉米有25個家族成員, 2016年, 數(shù)目增加為30個[3], 其中B族有7個。關(guān)于玉米個體 Hsf功能研究報道不多。本實驗室在前期研究玉米A1亞族ZmHsf06的基礎(chǔ)上[19,24], 從玉米幼葉中克隆到多個 Hsf, 通過結(jié)構(gòu)分析并與前人推測結(jié)果比對, 其中一個屬于B族, 為ZmHsf25。進一步分析表明, 該基因完整編碼序列為 957個核苷酸, 編碼 318個氨基酸殘基。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)含有完整的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域, 同時含有核定位信號和核輸出信號序列, 但不含激活結(jié)構(gòu)域。同源分析表明, ZmHsf25蛋白與高粱Sb060g025710、谷子SiHSFB-2a-like和水稻 OSIGBa0103M18.7的相似性分別為92%、81%和77%。擬南芥、番茄和大豆HsfB1的C末段均含有一段保守序列, 即11個氨基酸GEGLKLFGVWL的BRD抑制域, 為基因HsfB1抑制熱誘導(dǎo)基因表達(dá)所必需[25-26]。但是, 作為 HsfA1共激活因子, 番茄HsfB1 依賴于 C 末段一段類組氨酸序列(GRGKMMK), 該序列為植物CBP/HAC1的結(jié)合位點[27]。可見, C末段氨基酸序列不同導(dǎo)致基因功能的差異性。比對表明, ZmHsf25與番茄和擬南芥HsfB1相似性較低, C末段既不含11個氨基酸的保守序列,也不含類組氨酸序列。那么, ZmHsf25的功能如何有待深入研究。

因B族Hsf不含激活結(jié)構(gòu)域, 早期研究認(rèn)為其主要起抑制作用[9-10]。隨著研究的深入, 越來越多的研究發(fā)現(xiàn), B族Hsf受多種逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá), 從正反方面, 參與植株耐熱、抗旱和抗病等多種生物和非生物脅迫及生長發(fā)育過程[10-13,28]。非脅迫條件下,擬南芥 HsfB1和 HsfB2b定位在細(xì)胞核, 直接抑制HsfA2、HsfA7a、HsfB1和 HsfB2b的表達(dá)[10]。從本研究基因定位和表達(dá)結(jié)果來看, 正常生長條件下, ZmHsf25定位在細(xì)胞核, ZmHsf25表達(dá)量在多數(shù)組織中不高, 但在幼嫩的花粉中顯著高于在其他組織中。逆境脅迫下, 基因呈現(xiàn)不同表達(dá)譜, 熱脅迫能顯著上調(diào)根系和葉片ZmHsf25的表達(dá), 水楊酸和H2O2處理對根系和葉片ZmHsf25的表達(dá)均表現(xiàn)為下調(diào)。如果水楊酸和H2O2預(yù)處理后再進行熱激, 二者均能顯著上調(diào)ZmHsf25的表達(dá), 表明水楊酸和H2O2在熱激條件下才能誘導(dǎo)ZmHsf25大幅度表達(dá)。前人研究認(rèn)為, 水楊酸介導(dǎo)植物耐熱性尤其是植株獲得耐熱性過程[29-30], 水楊酸可在上游調(diào)控擬南芥 AtHsfA2的表達(dá), 該過程需要借助 H2O2信號途徑, 同時依賴相關(guān)熱激蛋白基因的表達(dá)[31]。這間接表明 ZmHsf25可能是水楊酸熱激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的下游組分之一,初步顯示出ZmHsf25在植株花粉發(fā)育和耐熱過程中的調(diào)控作用。正常條件下, 水楊酸下調(diào)根系ZmHsf25表達(dá), 可能是水楊酸處理濃度較大所致。作為信號分子, 水楊酸在植株體內(nèi)的存在是極其微量的。

自20世紀(jì)80年代后期酵母Hsf被首次克隆以來, 越來越多動植物物種的 Hsf基因被相繼獲得和注釋。酵母中只有1個Hsf, 相對簡單, 以酵母為轉(zhuǎn)化系統(tǒng)來驗證 Hsf的功能越來越得到應(yīng)用[32]。本研究通過轉(zhuǎn)化酵母發(fā)現(xiàn), 正常生長條件下, 轉(zhuǎn)基因酵母和正常對照長勢沒有明顯差異; 經(jīng) 50℃熱激處理45 min后, 轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞和轉(zhuǎn)化空載體對照的生長速度均受到抑制, 但是前者的受抑制程度明顯小于后者, 表明ZmHsf25能在酵母細(xì)胞中被誘導(dǎo)表達(dá),且能顯著提高酵母細(xì)胞的耐熱性, 進一步驗證了ZmHsf25的耐熱性調(diào)控功能。目前正在通過轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對ZmHsf25的耐熱性功能深入研究。

4 結(jié)論

玉米B族熱激轉(zhuǎn)錄因子基因ZmHsf25的完整編碼序列全長957 bp, 編碼318個氨基酸殘基。蛋白質(zhì)序列含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、核定位信號序列和核輸出信號序列。ZmHsf25與高粱Sb06g025710的相似性最高, 達(dá)92%。正常生長條件下, ZmHsf25在玉米多個組織器官中表達(dá), 幼嫩花粉中表達(dá)量最高。42℃熱脅迫能顯著上調(diào)根系和葉片中ZmHsf25的表達(dá); 正常條件下, 水楊酸和 H2O2處理下調(diào)根系和葉片ZmHsf25表達(dá), 而熱激條件下卻表現(xiàn)為顯著上調(diào)。ZmHsf25定位在細(xì)胞核。轉(zhuǎn)ZmHsf25酵母具有較強的耐熱性。ZmHsf25可能主要參與玉米植株花粉發(fā)育和熱脅迫響應(yīng)過程, 推測為水楊酸熱激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游組分之一。

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Cloning, Characteristics and Regulating Role in Thermotolerance of Heat Shock Transcription Factor (ZmHsf25) in Zea mays L.

ZHAO Li-Na1,2,**, DUAN Shuo-Nan1,**, ZHANG Hua-Ning1, GUO Xiu-Lin1,*, and LI Guo-Liang1,*1Institute of Genetics and Physiology, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Plant Genetic Engineering Center of Hebei Province, Shijiazhuang 050051, China;2College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050024, China

Heat shock transcription factors (Hsfs) are key components of signal transduction pathways involved in the activation of genes in response to heat shock (HS) stress in plants. There are at least 30 Hsf members in maize and seven of which belong to class B. In our previous work, we obtained ZmHsf06, which belongs to subclass A1, and investigated the characteristics of expression, subcellular localization, and regulating roles in thermotolerance and drought-stress tolerance of ZmHsf06. In the present study, ZmHsf25 was isolated from maize (Zea mays L.) young leaves treated with at 42°C for one hour using homologous cloning methods. The sequencing analysis showed that the coding sequence (CDS) of ZmHsf25 was 957 bp and encoded a protein of 318 amino acids. The amino acid sequence analysis demonstrated that ZmHsf25 contained a DNA-binding domain (DBD), a nuclear localization signal (NLS) of KRLR peptide and a nuclear export signal (NES) of VLTLSV peptide. The identity of amino acid between ZmHsf25 and Sb060g025710 of sorghum was the highest, which was 92%. ZmHsf25 was expressed in multiple tissuesand organs of maize, and transcription expression level of ZmHsf25 was the highest in pollens compared with root, stem, functional leaf, immature embryo and ear. qRT-PCR results showed that ZmHsf25 was up-regulated by 42°C heat shock in both leaves and roots. Under normal conditions, ZmHsf25 was down-regulated by both salicylic acid CSA and H2O2, but significantly up-regulated by heat stress at 42°C. Through transient reporter assay with onion (Allium cepa L.) epidermal cells, we found that ZmHsf25 was localized in nuclei. ZmHsf25 overexpressed yeast showed stronger thermotolerance than the controls after heat shock (HS), though yeast thermotolerances were also decreased by HS. The results revealed that ZmHsf25 perhaps is one of downstream elements of SA signal pathway to play a key role in regulating the response to heat stress and pollen development. These results provide a theoretical basis for analyzing biological characteristics and functions of maize Hsf members further.

Maize; ZmHsf25; Expression; Subcelullar-localization; Thermotolerance

(

): 2016-11-08; Accepted(接受日期): 2017-03-02; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-03-17.

10.3724/SP.J.1006.2017.01021

本研究由河北省自然科學(xué)基金項目(C2017301065), 河北省博士基金項目(2017039349), 渤海糧倉科技工程項目(F16C14001)和河北省高層次人才項目(A201500130)資助。

This study was supported by the Natural Science Foundation of Hebei Province (C2017301065), the Doctoral Foundation of Hebei Province (2017039349), the Bohai Barn Science and Technology Project (F16C14001) and the High-level Talent Project of Hebei Province (A201500130).

*通訊作者(Corresponding authors): 李國良, E-mail: guolianglili@163.com, Tel: 0311-87652127; 郭秀林, E-mail: myhf2002@163.com, Tel: 0311-87269032

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170317.1938.004.html