周巧玲，王遠(yuǎn)航，林 泓，汪 彬，石剛剛，鄭付春

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1.藥理學(xué)教研室、2.第一附屬醫(yī)院藥劑科，廣東 汕頭 515041)

鈣拮抗劑調(diào)節(jié)鈣非依賴磷脂酶A2拮抗心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的研究

周巧玲1，王遠(yuǎn)航1，林 泓1，汪 彬1，石剛剛1，鄭付春2

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1.藥理學(xué)教研室、2.第一附屬醫(yī)院藥劑科，廣東 汕頭 515041)

目的 探討經(jīng)典鈣拮抗劑維拉帕米(Ver)、硝苯地平(Nif)、地爾硫(Dil)及本課題組合成的新型鈣拮抗劑-碘化N-正丁基氟哌啶醇(F2)通過調(diào)節(jié)鈣非依賴磷脂酶A2(iPLA2)抗心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMECs)缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷的作用與機(jī)制。方法 培養(yǎng)大鼠原代CMECs,制作H/R模型，在H/R的基礎(chǔ)上，用不同濃度梯度的鈣拮抗劑及F2處理細(xì)胞，比色法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶(LDH)的漏出反映細(xì)胞損傷程度；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定白介素-6(IL-6) 和花生四烯酸(AA)的含量；TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞晚期凋亡水平；Real-time PCR檢測(cè)iPLA2mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)iPLA2蛋白表達(dá)。結(jié)果 鈣拮抗劑F2、Ver和Nif均可量效-依賴性地減少H/R過程中LDH漏出(P<0.05)，降低IL-6和AA含量(P<0.05)，減少細(xì)胞凋亡(P<0.05)，而Dil對(duì)上述指標(biāo)均無作用；同時(shí)，F(xiàn)2和Ver均可量效-依賴性地降低iPLA2mRNA和蛋白表達(dá)水平，Nif和Dil對(duì)H/R過程中iPLA2mRNA和蛋白表達(dá)水平并無影響。結(jié)論 H/R可導(dǎo)致CMECs損傷，鈣拮抗劑F2、Ver、Nif能保護(hù)CMECs抗H/R損傷，Dil無抗H/R損傷的作用；而F2和Ver是部分通過調(diào)節(jié)iPLA2抗H/R損傷作用的。

鈣拮抗劑；碘化N-正丁基氟哌啶醇；鈣非依賴磷脂酶A2；花生四烯酸；心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞；缺氧/復(fù)氧

心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷是臨床常見的病理現(xiàn)象，是指心肌在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后組織損傷反而加重，甚至發(fā)生不可逆損傷的現(xiàn)象。I/R損傷主要表現(xiàn)在生物膜損傷、細(xì)胞器功能改變、炎癥發(fā)生和細(xì)胞凋亡發(fā)生等[1-2]。鈣非依賴磷脂酶A2(iPLA2)是磷脂酶A2(PLA2)家族的一大亞族，其發(fā)揮催化活性不需要鈣離子的參與，可以水解膜磷脂，生成花生四烯酸(AA)和溶血磷脂酰膽堿(LPC)[3]。AA和LPC作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，涉及廣泛的生理病理效應(yīng)，主要包括類花生四烯酸的產(chǎn)生、葡萄糖誘導(dǎo)胰島素分泌、Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞膜代謝融合等，這些都與心肌缺血有密切關(guān)系[4-5]。AA作為iPLA2的主要產(chǎn)物之一，也是生成眾多炎癥因子的一個(gè)關(guān)鍵因子，能激發(fā)下游瀑布式的炎癥反應(yīng)。

鈣拮抗劑(calcium antagonists)，也叫鈣通道阻滯劑(calcium channel blockers，CCB)，主要通過阻斷心肌和血管平滑肌細(xì)胞膜上的L-型鈣離子通道，抑制細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平降低而改善心血管等組織器官功能[6]。碘化N-正丁基氟哌啶醇(N-n-butyl haloperidol iodide, F2)是我們實(shí)驗(yàn)室在氟哌啶醇(haloperidol, Hal)的基礎(chǔ)上改造合成的一種具有心血管活性的新型鈣拮抗劑，通過阻斷心肌細(xì)胞膜鈣通道而拮抗心I/R損傷[7]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，F(xiàn)2無論是對(duì)整體的I/R損傷，還是對(duì)離體的心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)損傷均有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與阻斷心肌細(xì)胞細(xì)胞膜上L-型鈣通道(L-VDCC)，拮抗心肌細(xì)胞鈣超載，抑制早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因-1(early growth response gene-1, Egr-1)過表達(dá)有關(guān)[8-10]。實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染iPLA2質(zhì)粒使iPLA2高表達(dá)后，H/R損傷加重；轉(zhuǎn)染iPLA2-siRNA沉默iPLA2基因，H/R損傷減輕，驗(yàn)證了iPLA2參與心肌細(xì)胞H/R損傷[11]。而關(guān)于iPLA2能否作為鈣拮抗劑的作用靶點(diǎn)介導(dǎo)細(xì)胞抗H/R損傷，成為鈣拮抗劑抗心肌I/R損傷的另一個(gè)機(jī)制，未有文獻(xiàn)報(bào)道。故本研究擬采用I/R損傷中最先受累且參與調(diào)控I/R病理生理進(jìn)程的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMECs)制備H/R模型[12]，選取3種經(jīng)典鈣拮抗劑硝苯地平(Nif)、地爾硫(Dil)、維拉帕米(Ver)及F2，探討其調(diào)節(jié)iPLA2抗H/R損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 新生(1～4 d)SD乳鼠(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)♀♂不限。胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)；肝素鈉注射液(成都市海通藥業(yè)有限公司，中國)；內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑(ECGS)(Merk Millipore公司，德國)；青霉素-鏈霉素溶液(Biosharp公司，中國)；iPLA2兔多克隆抗體(Proteintech，美國)；β-actin小鼠單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG(武漢博士德生物工程有限公司，中國)；TRIzol、PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time、SYBRPrem ExTaqII(TaKaRa公司，日本)；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒 (南京建成生物研究所，中國)；白介素-6(IL-6) ELISA試劑盒(Ebioscience公司，美國)；花生四烯酸(AA) ELISA試劑盒(Cusabio公司，中國)；DeadEndTMFlourumetric TUNEL System(Promega公司，美國)；鹽酸維拉帕米(Ver)注射液(上海禾豐制藥有限公司，中國)；硝苯地平(Nif)、地爾硫(Dil)(Sigma公司，美國)；F2由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥物研究室化學(xué)組合成，實(shí)驗(yàn)前用DMSO配成所需濃度；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國)；CO2培養(yǎng)箱(Sanyo公司，日本)；倒置相差顯微鏡(Nilkon公司，日本)；PB-10 pH酸度計(jì)(Sarotorius公司，德國)；低溫高速離心機(jī)(Heraeus公司，德國)；SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司，美國)；Olympus BX53正置熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)；ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x(ABI公司，美國)；Invivo 2400低氧/厭氧工作站(Ruskinn公司，英國)；Gel-pro圖像分析軟件(Media cybernetics, USA)。

1.2 原代CMECs培養(yǎng) 將出生1～4 d的SD乳鼠經(jīng)75%酒精消毒，仰臥，四肢固定(以下步驟均為無菌操作)。開胸，剝離心臟，取心臟下端1/3心室肌部分，置于預(yù)冷(4℃)PBS中充分清洗，用眼科剪將心肌組織剪成1 mm×1 mm×1 mm組織塊，加入10倍體積的0.1%胰蛋白酶，37℃消化5 min，輕輕吹打，靜置1 min，吸取上清液，余下組織塊加入0.1%胰蛋白酶消化5 min，收集上清液。將2次收集的上清液合并，加入含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基滅活胰酶終止消化，1 000 r·min-1，4℃離心10 min，棄上清，收集細(xì)胞。加入含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基(含有100 kU·L-1青霉素、100 kU·L-1鏈霉素、6 250 U·L-1肝素鈉、15 mg·L-1ECGS)，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，6 h后，更換培養(yǎng)基去除未貼壁細(xì)胞。CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)基，以后每2 d換液1次，至CMECs融合成單層，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至85%～90%可進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。采用3～8代CMECs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及H/R模型建立 將CMECs隨機(jī)分為對(duì)照(Control，簡(jiǎn)稱Ctrl)組、H/R組、H/R+溶劑(DMSO)組、H/R+F2(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組、H/R+Ver(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組、H/R+Nif(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組、H/R+Dil(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組。Ctrl組于實(shí)驗(yàn)前更換為0.5%FBS DMEM培養(yǎng)基(復(fù)氧液)，按正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)4.5 h。其余各組制備缺氧模型，均更換為高純度氮?dú)怙柡?0 min的缺氧液，放入低氧/厭氧工作站中培養(yǎng)4 h。缺氧完成后，更換復(fù)氧液，放入CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)0.5 h，造成CMECs H/R損傷。

1.4 CMECs上清液中LDH活性測(cè)定 將CMECs接種于24孔板中，待細(xì)胞融合率達(dá)到85%～90%，按上述分組。復(fù)氧結(jié)束后，收集細(xì)胞上清復(fù)氧液，按LDH試劑盒說明書操作，比色法測(cè)定LDH活性。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定IL-6和AA濃度 將CMECs接種于24孔板中，待融合率達(dá)到85%～90%時(shí)制備H/R模型。收集細(xì)胞上清復(fù)氧液，按ELISA試劑盒說明書操作，于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各組吸光值，并擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入各組OD值，計(jì)算各組IL-6和AA濃度。

1.6 熒光顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞凋亡水平 首先將75%乙醇消毒過的蓋玻片紫外滅菌30 min后放入24孔板中，接種CMECs，爬片成功后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求分組處理。預(yù)冷PBS洗滌3次，將蓋玻片浸沒在4%甲醛溶液(溶于1×PBS)中固定，室溫孵育15 min。去掉多余液體，每孔加入500 μL 0.3% TritonX-100，室溫孵育15 min。在1×TBS溶液中浸沒清洗樣本3次，輕輕去掉多余液體。滴加100 μL 1×TdT平衡緩沖液(蒸餾水稀釋)，使其全部覆蓋樣本，室溫孵育10 min。吸干樣本周圍的平衡緩沖液，立即滴加50 μL TdT標(biāo)記反應(yīng)混合物(平衡緩沖液 ∶核苷混合物 ∶rTDT=45 ∶5 ∶1)。用Paraflim?封口膜覆蓋樣本，置于濕盒中37℃避光孵育60 min。移走封口膜，并將蓋玻片置于1×TBS溶液中室溫孵育1 min。去掉多余液體，換用新鮮的1×TBS溶液室溫孵育1 min，重復(fù)1次。用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的TBS溶液。逐滴滴加Mounting Media封片劑并蓋上蓋玻片。熒光顯微鏡下觀察，使用DAPI的濾光片觀察樣本中的全體細(xì)胞，使用標(biāo)準(zhǔn)的綠色熒光濾光片觀察凋亡的細(xì)胞。

1.7 Real time-PCR檢測(cè)iPLA2mRNA表達(dá) 將CMECs接種于24孔板中，待細(xì)胞融合率達(dá)到85%～90%，按上述分組。采用TRIzol一步法提取細(xì)胞總RNA，Nano2000測(cè)其RNA濃度。用RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，通過Real time-PCR檢測(cè)iPLA2的表達(dá)。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算 2-ΔΔCT值。

1.8 Western blot檢測(cè)iPLA2蛋白表達(dá) CMECs接種至直徑7 cm的培養(yǎng)皿中，待鋪滿皿底，給予相應(yīng)處理后，每皿加70 μL裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r·min-1、4℃離心收集上清液。BCA法蛋白定量。將蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜；二抗37℃孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光，暗室曝光。Gel-pro圖像分析軟件分析蛋白條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 鈣拮抗劑對(duì)CMECs H/R后LDH漏出的影響 如Fig 1所示，與Ctrl組相比，H/R組與H/R+DMSO組LDH漏出量明顯增加(P<0.05)；與H/R+DMSO組相比，H/R+F2(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組、H/R+Ver(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組、H/R+Nif(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組均能量效依賴性地減少LDH漏出量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而H/R+Dil(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組與H/R+DMSO組相比，有劑量依賴減少LDH漏出量的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig 1 Effect of calcium antagonists on LDH induced by H/R(±s，n=5)

1:Ctrl;2:H/R;3:H/R+DMSO;4:H/R+F2(10.0 μmol·L-1);5:H/R+F2(1.0 μmol·L-1);6:H/R+F2(0.1 μmol·L-1);7:H/R+Ver(10.0 μmol·L-1);8:H/R+Ver(1.0 μmol·L-1);9:H/R+Ver(0.1 μmol·L-1);10:H/R+Nif(10.0 μmol·L-1);11:H/R+Nif(1.0 μmol·L-1);12:H/R+Nif(0.1 μmol·L-1);13:H/R+Dil(10.0 μmol·L-1);14:H/R+Dil(1.0 μmol·L-1);15:H/R+Dil(0.1 μmol·L-1).*P<0.05vsCtrl;#P<0.05vsH/R+DMSO

2.2 鈣拮抗劑對(duì)CMECs H/R后IL-6濃度的影響 如Fig 2所示，與Ctrl組相比，H/R組與H/R+DMSO組IL-6濃度明顯增加(P<0.05)；與H/R+DMSO相比，H/R+F2(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組、H/R+Ver(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組均能量效-依賴性地降低IL-6濃度，H/R+Nif(10.0、1.0 μmol·L-1)組能明顯降低IL-6濃度，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈量效-依賴性；而H/R+Nif(0.1 μmol·L-1)組和H/R+Dil(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組與H/R+DMSO組相比，IL-6濃度差異沒有顯著性。

2.3 鈣拮抗劑對(duì)CMECs H/R后細(xì)胞凋亡的影響 如Fig 3所示，與Ctrl組相比，H/R組與H/R+DMSO組細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.05)；與H/R+DMSO組相比，H/R+F2(1.0 μmol·L-1)組、H/R+Ver(1.0 μmol·L-1)組、H/R+Nif(1.0 μmol·L-1)組均能減少細(xì)胞凋亡，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而H/R+Dil(1.0 μmol·L-1)組與H/R+DMSO組相比，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡減少，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig 2 Effect of calcium antagonists on IL-6 induced by H/R(±s，n=5)

1:Ctrl;2:H/R;3:H/R+DMSO;4:H/R+F2(10.0 μmol·L-1);5:H/R+F2(1.0 μmol·L-1);6:H/R+F2(0.1 μmol·L-1);7:H/R+Ver(10.0 μmol·L-1);8:H/R+Ver(1.0 μmol·L-1);9:H/R+Ver(0.1 μmol·L-1);10:H/R+Nif(10.0 μmol·L-1);11:H/R+Nif(1.0 μmol·L-1);12:H/R+Nif(0.1 μmol·L-1);13:H/R+Dil(10.0 μmol·L-1);14:H/R+Dil(1.0 μmol·L-1);15:H/R+Dil(0.1 μmol·L-1).*P<0.05vsCtrl;#P<0.05vsH/R+DMSO

2.4 鈣拮抗劑對(duì)iPLA2的影響 如Fig 4、5所示，與Ctrl組相比，H/R組與H/R+DMSO組iPLA2表達(dá)明顯增高(P<0.05)；與H/R+DMSO組相比，H/R+F2(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組和H/R+Ver(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組均能量效依賴性地降低iPLA2mRNA和蛋白表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而H/R+Nif(10、1.0、0.1 μmol·L-1)和H/R+Dil(10、1.0、0.1 μmol·L-1)組與H/R+DMSO組相比，未發(fā)現(xiàn)iPLA2mRNA和蛋白表達(dá)的降低，兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.5 鈣拮抗劑對(duì)CMECs H/R后AA濃度的影響 如Fig 6所示，與Ctrl組相比，H/R組與H/R+DMSO組AA濃度明顯增加(P<0.05)；與H/R+DMSO組相比，H/R+F2(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組、H/R+Ver(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組均能量效依賴性地降低AA濃度，H/R+Nif(10.0 、1.0 μmol·L-1)組能明顯降低AA濃度，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而H/R+Nif(0.1 μmol·L-1)組和H/R+Dil(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組與H/R+DMSO組相比，AA濃度沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Fig 3 Effect of calcium antagonists on apoptosis induced by H/R(±s，n=3)

1:Ctrl;2:H/R;3:H/R+DMSO;4:H/R+F2(1.0 μmol·L-1);5:H/R+Ver(1.0 μmol·L-1);6:H/R+Nif(1.0 μmol·L-1);7:H/R+Dil(1.0 μmol·L-1).*P<0.05vsCtrl;#P<0.05vsH/R+DMSO

3 討論

心肌I/R損傷是一個(gè)復(fù)雜的多因素參與的病理過程，損傷的發(fā)生機(jī)制包括氧自由基產(chǎn)生、鈣超載、白細(xì)胞趨化作用、能量代謝障礙和炎癥反應(yīng)等[1-2,13]。缺血前或早期給予鈣拮抗劑可以通過對(duì)細(xì)胞膜L-VDCC的阻斷作用，減少胞內(nèi)的鈣離子，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載，減少心肌的不可逆損傷。然而，近年來有學(xué)者認(rèn)為，鈣拮抗劑也可能通過作用其它環(huán)節(jié)而發(fā)揮效應(yīng)，且多年來對(duì)于鈣拮抗劑減輕I/R損傷的機(jī)制報(bào)道也并非一致[14-16]。有人認(rèn)為是通過其負(fù)性肌力和負(fù)性頻率作用，節(jié)省能量，改善I/R損傷；也有報(bào)道鈣拮抗劑具有抗氧自由基和調(diào)節(jié)NO合酶的作用[17-18]。

Fig 4 Effect of calcium antagonists on expression of iPLA2 mRNA(±s，n=9)

1:Ctrl;2:H/R;3:H/R+DMSO;4:H/R+F2(10.0 μmol·L-1);5:H/R+F2(1.0 μmol·L-1);6:H/R+F2(0.1 μmol·L-1);7:H/R+Ver(10.0 μmol·L-1);8:H/R+Ver(1.0 μmol·L-1);9:H/R+Ver(0.1 μmol·L-1);10:H/R+Nif(10.0 μmol·L-1);11:H/R+Nif(1.0 μmol·L-1);12:H/R+Nif(0.1 μmol·L-1);13:H/R+Dil(10.0 μmol·L-1);14:H/R+Dil(1.0 μmol·L-1);15:H/R+Dil(0.1 μmol·L-1).*P<0.05vsCtrl;#P<0.05vsH/R+DMSO

研究表明，炎性反應(yīng)血管高通透性被認(rèn)為是心肌I/R損傷的中心環(huán)節(jié)，此過程中內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是I/R損傷發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)。內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷后促進(jìn)炎癥因子的釋放，進(jìn)而引起白細(xì)胞聚集、黏附、血管收縮、血栓形成及內(nèi)皮細(xì)胞腫脹造成無復(fù)流現(xiàn)象，加重H/R損傷[12]，再灌注前給予保護(hù)內(nèi)皮功能的藥物可對(duì)抗內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，減少心肌損傷。iPLA2作為磷脂酶超家族的一員，文獻(xiàn)報(bào)道其在心肌中有相對(duì)高的活性。心肌膜由磷脂雙分子層構(gòu)成，能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和運(yùn)輸功能。心肌缺血時(shí)，心肌膜破損，導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂，進(jìn)一步加重心肌損傷，iPLA2在細(xì)胞膜磷脂的維持和修復(fù)程度中發(fā)揮關(guān)鍵作用。iPLA2對(duì)于心肌I/R的病理發(fā)展也具有重要的作用，其水解膜磷脂生成AA和LPC產(chǎn)物，兩個(gè)產(chǎn)物具有多樣性的生物效應(yīng)，介導(dǎo)不同信號(hào)通路產(chǎn)生有害反應(yīng)，參與了一系列炎癥、凋亡等反應(yīng)，從離子通道的調(diào)節(jié)到對(duì)多種信號(hào)通路的作用，尤其是在心肌I/R損傷中發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)室前期研究表明iPLA2參與心肌細(xì)胞H/R損傷[11]，心肌I/R或細(xì)胞H/R情況下，iPLA2高表達(dá)，活性增加，所生成的AA和LPC引起細(xì)胞損傷，鈣拮抗劑對(duì)iPLA2這樣一個(gè)重要的“上游”酶類的調(diào)節(jié)發(fā)揮多方面的效應(yīng)。鈣拮抗劑通過抑制iPLA2高表達(dá)，主要是通過對(duì)產(chǎn)物AA的產(chǎn)生發(fā)揮作用，通過降低心肌I/R情況下AA的產(chǎn)生，從而抑制AA所激發(fā)的下游瀑布式炎癥效應(yīng)，保護(hù)心肌損傷?；诖耍S多學(xué)者認(rèn)為iPLA2很可能成為諸多疾病的藥物作用靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)在前期工作的基礎(chǔ)上，探討在細(xì)胞H/R情況下，鈣拮抗劑是否通過調(diào)控iPLA2異常表達(dá)產(chǎn)生抗損傷作用。

Fig 5 Effect of calcium antagonists on expression of iPLA2 protein(±s，n=3)

Fig 6 Effect of calcium antagonistson AA induced by H/R(±s，n=5)

1:Ctrl;2:H/R;3:H/R+DMSO;4:H/R+F2(10.0 μmol·L-1);5:H/R+F2(1.0 μmol·L-1);6:H/R+F2(0.1 μmol·L-1);7:H/R+Ver(10.0 μmol·L-1);8:H/R+Ver(1.0 μmol·L-1);9:H/R+Ver(0.1 μmol·L-1);10:H/R+Nif(10.0 μmol·L-1);11:H/R+Nif(1.0 μmol·L-1);12:H/R+Nif(0.1 μmol·L-1);13:H/R+Dil(10.0 μmol·L-1);14:H/R+Dil(1.0 μmol·L-1);15:H/R+Dil(0.1 μmol·L-1).*P<0.05vsCtrl;#P<0.05vsH/R+DMSO

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，0.1～10.0 μmol·L-1的鈣拮抗劑F2、Ver及Nif具有抗H/R損傷、保護(hù)CMECs的作用，且F2和Ver是通過抑制iPLA2高表達(dá)抗H/R損傷的，Nif對(duì)iPLA2高表達(dá)無作用。Hempel等[19]發(fā)現(xiàn)，在無L-VDCC的內(nèi)皮細(xì)胞上，Nif可通過直接抑制PKC轉(zhuǎn)位，減少缺血引起的內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，降低內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞缺血損傷。這些研究都表明[11,19]，鈣拮抗劑除了能阻斷鈣通道外，還可能存在非鈣通道阻斷途徑 (如非L-VDCC依賴機(jī)制)。至于Dil與其他3種鈣拮抗劑的不同作用，仍需進(jìn)一步探討。結(jié)果表明，F(xiàn)2和Ver量效依賴地降低了iPLA2的表達(dá)，提示iPLA2可能是鈣拮抗劑F2和Ver抗H/R損傷新的作用靶點(diǎn)，為其臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)是在汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室完成，感謝在實(shí)驗(yàn)過程中給予建議與幫助的老師和同學(xué)。)

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Calcium antagonists protect cardiac microvascular endothelial cells against hypoxia/reoxygenation injury through iPLA2

ZHOU Qiao-ling1，WANG Yuan-hang1，LIN Hong1，WANG Bin1，SHI Gang-gang1，ZHENG Fu-chun2
(1.DeptofPharmacology，ShantouUniversityMedicalCollege，2.DeptofPharmacy,theFirstAffiliatedHospitalofShantouUniversityMedicalCollege，Shantou，Guangdong515041，China)

Aim To investigate the effects of classic calcium antagonists verapamil(Ver), nifedipine(Nif), diltiazem(Dil) and the novel calcium antagonistN-n-butyl haloperidol iodide(F2) which was synthesized by our lab by regulating Ca2+-independent phospholipase A2(iPLA2) on hypoxia / reoxygenation(H/R) injury of cardiac microvascular endothelial cells(CMECs) and the mechanisms.Methods The CMECs were isolated from SD neonatal rats. The H/R model was established, then cells were treated with different concentrations of calcium antagonists and F2.The content of LDH in the cell supernatant was measured by colorimetric method. The levels of IL-6 and AA in cell supernatant were measured by ELISA; and late-stage apoptosis was measured by TUNEL. The mRNA and protein expression levels of iPLA2in CMECs were examined by real time-PCR and Western blot analysis.Results Calcium antagonists except Dil decreased the generation of LDH，IL-6 and AA in a dose-dependent manner(P<0.05), and reduced the apoptosis(P<0.05). F2and Ver decreased the mRNA and protein expression of iPLA2in a dose-dependent manner, while there were no such effects for Nif and Dil.Conclusions Calcium antagonists except Dil have protective effects against H/R injury. F2and Ver protect CMECs against H/R injury partly through iPLA2.

calcium antagonist；N-n-butyl haloperidol iodide；Ca2+-independent phospholipase A2；arachidonic acid; cardiac microvascular endothelial cells；hypoxia/reoxygenation

2017-03-22,

2017-04-23

國家自然科學(xué)基金-廣東聯(lián)合基金資助項(xiàng)目(No U0932005) ；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81473215)；廣東省科技廳公益研究與能力建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(No 2014A020212290)

周巧玲(1991-)，女，碩士，研究方向：心血管藥物研發(fā)，E-mail：qlchou@163.com； 鄭付春(1967-)，女，碩士，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥物研發(fā)、藥物臨床研究，通訊作者，E-mail：zhengfc@stu.edu.cn

時(shí)間：2017-7-7 11:04 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170707.1104.032.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.08.016

A

1001-1978(2017)08-1119-07

R-332；R322.11；R322.12；R542.22；R845.22；R972；R977.3