陳丹丹，彭 成，萬 峰，劉 莟，敖 慧，謝曉芳

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；2. 雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)檢驗系，四川 雅安 625000；3. 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137；4. 成都第一制藥有限公司，四川 成都 610031)

氫溴酸樟柳堿對抗大鼠急性腦缺血/再灌注損傷的作用機制研究

陳丹丹1, 2，彭 成1, 3，萬 峰4，劉 莟1，敖 慧1，謝曉芳1, 3

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；2. 雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)檢驗系，四川 雅安 625000；3. 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137；4. 成都第一制藥有限公司，四川 成都 610031)

目的 探討氫溴酸樟柳堿對抗大鼠急性腦缺血/再灌注損傷的作用機制。方法 體內(nèi)實驗采用線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)致腦缺血/再灌注損傷模型，氫溴酸樟柳堿尾靜脈注射進行干預(yù)。HE染色評價腦組織一般病理學(xué)情況；尼氏染色評價腦組織健存神經(jīng)元情況；檢測腦組織勻漿過氧化氫酶(CAT)活性、脂質(zhì)過氧化物(LPO)含量、乳酸脫氫酶(LDH)活性；采用Western blot技術(shù)檢測腦組織Bax、Bcl-2、caspase-3、p-Akt等蛋白的表達。體外實驗采用PC12細胞氧糖剝奪再灌注損傷模型(OGD-R)， 采用Western blot技術(shù)檢測細胞內(nèi)Bax、Bcl-2、caspase-3、p-Akt等蛋白的表達情況，對氫溴酸樟柳堿作用的信號通路進行確認。結(jié)果 氫溴酸樟柳堿0.15 mg·kg-1能明顯降低MCAO模型大鼠一般病理學(xué)評分，提高存活神經(jīng)元數(shù)目；氫溴酸樟柳堿0.3、0.15 mg·kg-1能明顯提高腦組織CAT活性，氫溴酸樟柳堿0.3 mg·kg-1能明顯降低LPO含量；氫溴酸樟柳堿1.2 mg·kg-1明顯降低LDH活性；各劑量組均能明顯降低促凋亡蛋白Bax的表達，提高Bcl-2/Bax比值，促進p-Akt表達，明顯提高p-Akt/Akt比值，除氫溴酸樟柳堿0.15 mg·kg-1劑量外，其余劑量均能明顯提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。體外實驗結(jié)果顯示，氫溴酸樟柳堿在25～100 μmol·L-1時能明顯提高Bcl-2蛋白的表達，提高Bcl-2/Bax比值，在50 μmol·L-1劑量下能明顯提高p-Akt/Akt的比值。結(jié)論 氫溴酸樟柳堿對抗急性腦缺血/再灌注損傷大鼠的作用機制與抗氧化損傷及提高p-Akt的表達有關(guān)。

氫溴酸樟柳堿；腦缺血/再灌注；HE染色；尼氏染色；氧化應(yīng)激；p-Akt

缺血性腦卒中是最常見的卒中類型，是由于腦部血液供應(yīng)障礙，缺血、缺氧引起的局限性腦組織的缺血性壞死或腦軟化。臨床上該病具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高等特點。藥物治療是目前腦卒中的主要治療方式之一，而其中溶栓治療又是缺血性腦卒中急性期采取的最有效的措施之一。但是，由于溶栓治療時間窗的限制(如病人就診較晚、診斷延遲、或者醫(yī)生未當機立斷等)導(dǎo)致目前急性缺血性腦卒中作溶栓治療的比例還很低。因此，需要積極探索更多行之有效的治療腦卒中的藥物。

近年來，莨菪烷類生物堿對抗腦缺血/再灌注的研究比較活躍[1-2]，但是其抗缺血性腦卒中的分子機制尚未見報道。樟柳堿是從茄科植物唐古特山莨菪的根中所提取出的一種莨菪烷類生物堿，氫溴酸樟柳堿(anisodine hydrobromide，AH)為其氫溴酸鹽。20世紀90年代，Xu等[3]就對其抗大鼠腦缺血/再灌注損傷進行了研究，結(jié)果顯示，樟柳堿可使急性腦缺血/再灌注大鼠異常升高的前腦鈣含量和伊文思藍含量明顯降低，減少腦組織水腫?；谀壳暗难芯楷F(xiàn)狀，本研究采用線栓法建立大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)致腦缺血/再灌注損傷模型，擬從一般病理學(xué)形態(tài)、神經(jīng)元存活情況、生化指標以及PI3K/Akt信號通路等方面來探索AH抗缺血性腦卒中的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物與細胞 SD大鼠，SPF級，♂，體質(zhì)量(300±20)g，購自四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實驗動物中心，質(zhì)量合格證號：SCXK(川)2013-19。大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(pheochromocytoma cells，PC12 cells)購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 藥品與試劑 原料藥AH由成都第一藥業(yè)有限公司提供，生產(chǎn)批號140903，使用時超純水充分溶解并過0.22 μm微孔濾膜備用。尼莫地平(nimodipine，Nim)注射液，由拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司生產(chǎn)，批號BXGVZ71；丁苯酞(n-butylphthalide，NBP)氯化鈉注射液，石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司，批號：618160320；DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM無糖培養(yǎng)基(Gibco公司)；小牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；連二亞硫酸鈉(分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；水合氯醛(成都市科龍化工試劑廠，批號2015090602)；脂質(zhì)過氧化物(lipid peroxidation，LPO)測試盒(批號：20160413)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)測定試劑盒(批號：20160413)、過氧化氫酶(catalase，CAT)測試盒(批號：20160414)、蛋白定量測試盒(批號：20160407)，均購自南京建成生物工程研究所；兔抗Bcl-2抗體、Bax抗體、Akt抗體(Abcam公司)；兔抗p-Akt抗體、caspase-3 抗體(Cell Signaling公司)；兔抗GAPDH抗體(博士德生物公司)；鼠抗β-actin抗體、HRP標記山羊抗兔IgG、HRP標記山羊抗鼠IgG，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 Enspire多標記微孔板檢測儀(珀金埃爾默新加坡有限公司)；TDZ4A-WS臺式低速離心機(湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司)；FA2004B型電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；EPED-E2-30TJ實驗室級超純水器(南京易普達科技發(fā)展有限公司)；1384 型超凈工作臺、3111型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；BA400Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)；GS-900校準型光密度計、電泳槽/電轉(zhuǎn)移槽/電源(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 大鼠MCAO模型的復(fù)制 采用線栓法制備急性大鼠腦缺血/再灌注模型，具體方法在參考文獻[4]方法的基礎(chǔ)上加以改進：術(shù)前大鼠禁食12 h，自由飲水，手術(shù)過程中用10%水合氯醛0.3 g·kg-1腹腔注射麻醉。待大鼠翻正反射消失后，取仰臥位固定，剪去頸部被毛，消毒，正中切口。于氣管左側(cè)找到頸總動脈(common carotid artery，CCA)，結(jié)扎CCA近心端、遠心端被線，再分離頸外動脈(external carotid artery，ECA)和頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)，結(jié)扎ECA，在ICA遠端放置動脈夾，CCA切口，近心端距分叉處 4 mm切口插入直徑為 0.285 mm、頭端打磨光滑的魚線，直視下進入頸內(nèi)動脈，插入長度約為 20 mm，完全阻斷其對大腦中動脈的供血，固定栓線。缺血2 h后再灌注時，輕柔回抽魚線約10 mm。術(shù)中和術(shù)后保持室溫 25℃左右，同時白熾燈照動物使其肛溫維持在(37±1)℃，直到動物恢復(fù)活動。假手術(shù)組動物除不插入魚線外，其余操作同模型動物。

2.2 動物分組與給藥 手術(shù)動物術(shù)后按照Longa等[4]的5分制評分標準進行分級評分：0分，無明顯神經(jīng)損傷癥狀；1分，不能完全伸展對側(cè)前爪；2分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。評分為1～3分者入選本次實驗，其余評分動物剔除。本次實驗造模成功率約50%，將復(fù)制成功的模型動物隨機分為MCAO模型組，Nim組和AH 1.2、0.6、0.3、0.15 mg·kg-14個劑量組。再灌注時假手術(shù)組注射生理鹽水，Nim組注射尼莫地平注射液1 mg·kg-1，AH各劑量組對應(yīng)尾靜脈注射AH 1.2、0.6、0.3、0.15 mg·kg-1，再灌注6 h同法進行第2次給藥，共計給藥2次。

2.3 PC12細胞的培養(yǎng)及氧糖剝奪再灌注(oxygen and glucose deprivation -reperfusion, OGD-R)模型的復(fù)制 PC12 細胞用含10%小牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。當顯微鏡下觀察到細胞覆蓋瓶底約達70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化離心，完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)節(jié)細胞濃度為2×108·L-1接種于60 cm培養(yǎng)皿中，設(shè)空白對照組(control group，control)、OGD-R組、NBP陽性對照組、AH 100、50、25 μmol·L-1組。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄上清，用PBS 清洗2次；除空白對照組加入無血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液2 mL外，其余各組加入含有8 mmol·L-1連二亞硫酸鈉的無糖DMEM培養(yǎng)液2 mL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，棄原液，用PBS清洗2次?？瞻讓φ战M和模型組分別加入含10%小牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液2 mL，AH各組及陽性對照組分別加入培養(yǎng)基含終濃度分別為100、50、25 μmol·L-1AH及130 μmol·L-1NBP，復(fù)糖復(fù)氧2 h[5]。

2.4 大鼠腦組織蘇木精伊紅(HE)染色和尼氏染色 實驗結(jié)束后水合氯醛麻醉動物，斷頭處死，迅速選取缺血側(cè)視交叉附近約1 mm厚度冠狀切片腦組織，10%甲醛溶液固定，按照常規(guī)HE和尼氏染色實驗步驟進行染色。HE染色腦組織病理評分按以下標準進行量化：光鏡下未見病變評分為0分； 光鏡下若見小灶性灰、白質(zhì)輕度水腫，細胞溶解，灶性少許細胞增生(增生細胞主要為膠質(zhì)細胞)，少許炎細胞浸潤，輕度灰質(zhì)萎縮等病理表現(xiàn)評分為1分；光鏡下若見多灶性灰、白質(zhì)水腫，細胞溶解、變性、壞死，灶性較多細胞增生(增生細胞主要為膠質(zhì)細胞)，較多炎細胞浸潤等病理表現(xiàn)評分為2分；光鏡下若見彌漫性灰、白質(zhì)水腫，細胞溶解、變性、壞死，灶性大量細胞增生(增生細胞主要為膠質(zhì)細胞)，大量炎細胞浸潤等病理表現(xiàn)評分為3分。尼氏染色每個腦組織均選取3個視野400倍鏡下觀察，計數(shù)神經(jīng)元，每個視野計數(shù)后取均值作為該樣本的細胞密度。

2.5 腦組織生化指標的測定 實驗結(jié)束后水合氯醛麻醉動物，斷頭處死，每只大鼠取缺血側(cè)視交叉附近冠狀切片腦組織約100 mg，按1 ∶9(W/V)加入冰冷生理鹽水，制成 10%的腦組織勻漿。將勻漿液3 000 r·min-1離心15 min，取上清液， -80℃超低溫冰箱保存待測。按試劑盒說明書測定腦組織勻漿LDH、CAT活性以及LPO含量。

2.6 腦組織Bcl-2、Bax、caspase-3、p-Akt以及Akt蛋白表達的測定 斷頭處死動物后，每組隨機選取3只大鼠，取缺血側(cè)半暗帶附近固定解剖部位腦組織約50 mg，加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液(W ∶V=1 ∶10)提取腦組織蛋白，用考馬斯亮藍法進行蛋白含量的測量。按10 μL蛋白樣品/泳道上樣，行SDS-PAGE電泳，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用脫脂奶粉封閉2 h，進行一抗孵育，用TBST洗膜，10 min × 3次，將PVDF膜放入稀釋好的Bcl-2、Bax、caspase -3、p-Akt、Akt、β-actin及GAPDH (1∶1 000 稀釋)一抗中，4 ℃封閉過夜；TBST 洗膜3次后，將PVDF 膜放入HRP標記的二抗中(1 ∶5 000)，37℃孵育1 h；TBST 洗膜后，暗室中加ECL發(fā)光液并進行曝光、顯影、定影，利用BIO-RAD GS-900校準型光密度計掃描X線膠片，采用Image-lab圖像處理軟件分析實驗結(jié)果。

2.7 PC12細胞Bcl-2、Bax、caspase-3、p-Akt以及Akt蛋白表達的測定 藥物作用結(jié)束后，收集細胞，蛋白裂解液裂解，測定蛋白含量，按20μL蛋白樣品/泳道上樣，其余操作同“2.6”。

3 結(jié)果

3.1 HE染色 由Fig 1可見，假手術(shù)組動物腦皮層、白質(zhì)區(qū)域?qū)哟吻宄?，細胞排列整齊有序，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，染色清晰。與假手術(shù)組相比，模型組動物腦皮層白質(zhì)區(qū)域細胞可見彌漫性不同程度的水腫，部分細胞變性、壞死，皮質(zhì)顆粒層細胞排列紊亂，可見數(shù)量不等的膠質(zhì)細胞增生，神經(jīng)纖維排列紊亂，呈網(wǎng)狀和條索狀，病理評分明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，AH 0.15 mg·kg-1劑量組能明顯減輕病理改變，評分明顯降低(P<0.01)，AH其他劑量組與模型組比較也有降低病理評分的趨勢(Tab 1)。

Fig 1 HE staining of brain tissue in all groups (×400)

A: Sham group; B: MCAO group; C: Nim group; D: AH 1.2 mg·kg-1group; E: AH 0.6 mg·kg-1group; F: AH 0.3 mg·kg-1group; G: AH 0.15 mg·kg-1group

Tab 1 Effects of anisodine hydrobromide on morphological changes of MCAO model rats(±s,n=8)

##P<0.01vssham;**P<0.01 vs MCAO

3.2 神經(jīng)元存活情況 Fig 2結(jié)果顯示，假手術(shù)組神經(jīng)元細胞排列整齊致密，胞體較大，胞質(zhì)藍染，尼氏體豐富；模型組細胞排列疏松，核仁消失，出現(xiàn)空泡樣變性，尼氏體明顯減少， 大量細胞脫失，存活細胞減少，與假手術(shù)組比較差異有顯著性(P<0.01)；陽性藥物Nim和AH 0.15 mg·kg-1可明顯提高大鼠腦組織存活神經(jīng)元數(shù)目(P<0.05或P<0.01)；AH其他劑量組也表現(xiàn)出提高腦組織存活神經(jīng)元數(shù)目的趨勢(Tab 2)。

3.3 AH對MCAO大鼠腦組織LPO含量、CAT及 LDH活性的影響 由Tab 3可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織LPO含量明顯增加(P<0.05)，CAT活性明顯降低(P<0.05)，腦組織LDH活性明顯增加(P<0.05)；AH 0.3 mg·kg-1劑量組能明顯降低模型大鼠腦組織LPO含量和明顯提升腦組織CAT含量，與模型組比較差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)；AH 0.15 mg·kg-1劑量組能明顯升高腦組織CAT含量，與模型組比較差異有顯著性(P<0.05)。AH 1.2 mg·kg-1劑量組能明顯降低模型大鼠腦組織LDH含量，與模型組比較差異有顯著性(P<0.05)。

Fig 2 Nissl staining of all groups(×400)

A: Sham group; B: MCAO group; C: Nim group; D: AH 1.2 mg·kg-1group; E: AH 0.6 mg·kg-1group; F: AH 0.3 mg·kg-1group; G: AH 0.15 mg·kg-1group

Tab 2 Effects of anisodine hydrobromide on number of surviving neurons of MCAO model rats(±s,n=8)

##P<0.01vssham；*P<0.05，**P<0.01vsMCAO

3.4 AH對MCAO大鼠腦組織Bax、Bcl-2、caspase-3及p-Akt表達的影響 如Fig 3、Tab 4所示，模型動物腦組織Bax、Bcl-2、caspase-3及p-Akt的表達均明顯升高，與假手術(shù)組比較差異有顯著性(P<0.01)；與模型組相比，AH各劑量組均可明顯降低Bax的表達(P<0.01)，與此同時AH各劑量組均可調(diào)高Bcl-2/Bax、p-Akt/Akt的比值(P<0.05或P<0.01)；AH在0.3～1.2 mg·kg-1劑量下可明顯提高Bcl-2的表達(P<0.01)，在0.3～0.6 mg·kg-1劑量下可明顯降低caspase-3的表達(P<0.05或P<0.01)。

Tab 3 Effects of anisodine hydrobromide on contents of LPO and activities of CAT， LDH in brain tissue of

#P<0.05vssham；*P<0.05，**P<0.01vsMCAO

Fig 3 Expression of Bax, Bcl-2, p-Akt, Akt and caspase-3 protein expression in all rats

1:Sham group;2:MCAO group;3:Nim group;4:AH 1.2 mg·kg-1;5: AH 0.6 mg·kg-1;6:AH 0.3 mg·kg-1;7:AH 0.15 mg·kg-1

3.5 AH對PC12細胞OGD-R模型Bax、Bcl-2、caspase-3及p-Akt表達的影響 如Fig 4、Tab 5所示，PC12細胞OGD-R后抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達有所提升，與空白對照組相比差異有顯著性(P<0.01)，而促凋亡蛋白Bax及caspase-3的表達也有升高趨勢；與模型組相比，AH各劑量組均可明顯提高Bcl-2的表達(P<0.01)，也表現(xiàn)出降低Bax表達的趨勢；AH在較低劑量25～50 μmol·L-1表現(xiàn)出降低caspase-3表達的趨勢。同時，與空白對照組相比，模型組Bcl-2/Bax比值有明顯提升(P<0.05)，而與模型組相比，AH各劑量組均可明顯提高Bcl-2/Bax比值(P<0.01)；在PC12細胞OGD-R模型中，p-Akt表達水平明顯降低(P<0.01)，與模型組相比，AH在50 μmol·L-1劑量下可明顯提高p-Akt/Akt比值(P<0.01)。

Fig 4 Expression of Bax, Bcl-2, p-Akt, Akt and caspase-3 protein in PC12 cells

1:Contol group；2: OGD-R group；3: NBP group；4: AH 100 μmol·L-1；5: AH 50 μmol·L-1；6: AH 25 μmol·L-1

4 討論

缺血性腦卒中是腦卒中的主要類型，也是腦卒中死亡的首要原因，其高致殘率為患者家庭和社會帶來了沉重的負擔。研究資料顯示，缺血性腦卒中是由多因素、多環(huán)節(jié)損傷所致的動態(tài)復(fù)雜的疾病，其發(fā)病機制復(fù)雜，其公認的主要機制之一為氧化應(yīng)激[6]。而報道顯示，抗氧化損傷為莨菪烷類藥物抗缺血/再灌注損傷的重要機制[7]。LPO在體內(nèi)水平的高低反映了體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的速率，CAT是機體內(nèi)源性抗過氧化損傷的主要酶系[8]。本研究結(jié)果顯示，模型動物腦組織CAT活性明顯降低， LPO含量明顯增加，而AH在較低劑量(0.3 mg·kg-1)以下，可明顯提高MCAO大鼠腦組織CAT活性，減少LPO含量。LDH是腦血管疾病時腦組織損害最敏感的酶[9]，本研究中模型動物LDH活性明顯增加，AH在大劑量時(1.2 mg·kg-1)時能明顯降低模型大鼠腦組織LDH活性，表明AH對抗缺血/再灌注損傷的作用機制與其抗自由基過氧化有關(guān)。

尼氏小體是神經(jīng)元細胞質(zhì)內(nèi)的一種正常結(jié)構(gòu)，它由大量平行排列的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和夾雜其間的核糖核蛋白體組成，是細胞內(nèi)的一種蛋白質(zhì)合成裝置，可作為觀察神經(jīng)元細胞功能狀態(tài)的指標[10]。本研究中，模型動物大量神經(jīng)元丟失，尼氏體明顯減少,氫溴酸各劑量組對神經(jīng)元的存活情況都有一定程度的改善，尤以小劑量(0.15 mg·kg-1)效果明顯。

Bcl-2、Bax基因是目前已知的在凋亡調(diào)控過程中功能相互對立的一對最重要的調(diào)控基因。研究資料顯示，細胞內(nèi)這兩種對立蛋白的比率關(guān)系是決定細胞存亡的關(guān)鍵。當Bcl-2高表達時，對抗細胞凋亡，反之，細胞對死亡信號的反應(yīng)性增強，啟動凋亡。而caspase 家族成員中的caspase-3在細胞凋亡過程中占據(jù)核心地位，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”[11]。本研究中，MCAO模型動物腦組織Bax、Bcl-2及caspase-3水平明顯升高，AH各劑量組能明顯降低促凋亡基因Bax及凋亡執(zhí)行者caspase-3的表達，提升Bcl-2及Bcl-2/Bax水平，表明AH能對抗神經(jīng)細胞凋亡。

Tab 4 Effects of anisodine hydrobromide on expression of Bax, Bcl-2, caspase-3 and p-Akt protein in brain tissue of MCAO model rats(±s,n=3)

##P<0.01vssham；*P<0.05，**P<0.01vsMCAO

Tab 5 Effects of anisodine hydrobromide on Bax, Bcl-2, caspase-3 and p-Akt protein expression in PC12 cells of OGD-R model

#P<0.05,##P<0.01vssham；*P<0.05，**P<0.01vsMCAO

PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是重要的細胞存活通路，其中發(fā)揮作用的是Akt。盡管目前的文獻報道，動物腦缺血/再灌注模型和PC12細胞OGD-R模型中p-Akt的表達強弱較正常組尚存爭議，但是p-Akt表達的增強可發(fā)揮抗凋亡作用是得到公認的[12-16]。激活的Akt 可以通過磷酸化Bad、caspase-9、Forkhead、NF-κB、GSK-3β等抑制細胞凋亡[17-18]。本研究中，AH各劑量組均能明顯提高MCAO大鼠p-Akt的表達，表明AH對抗細胞凋亡與激活A(yù)kt有關(guān)。

PC12細胞在神經(jīng)細胞的保護及信號通路的研究中被廣泛應(yīng)用，而氧糖剝奪模型也是國際公認的研究腦缺血的經(jīng)典模型[19]。本實驗的體外研究中，AH能明顯提高PC12細胞OGD-R模型Bcl-2及p-Akt的表達，同時能明顯提高Bcl-2/Bax比率，在蛋白表達的調(diào)控上表現(xiàn)出了與動物實驗相近的作用趨勢。這也從另一個角度確證了提高p-Akt蛋白的表達是AH抗凋亡的作用機制之一。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，AH在不同劑量下均可對大腦缺血/再灌注損傷不同指標作出一定程度的改善。但是由于動物實驗個體差異大，加之缺血性腦卒中發(fā)病機制復(fù)雜，在本研究所采取的各方面評價指標中，藥物未顯示出良好的量效關(guān)系，但是綜合各方面指標分析，藥物在較小劑量時療效相對較好，這與早期Xu等[3]的報道基本吻合。本研究的不足之處為在PI3K/Akt信號通路中只研究了Akt的表達，缺乏對其下游或上游相關(guān)蛋白的進一步探討，這些都是本課題下一步值得探討的問題。

(致謝: 本實驗完成于成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，實驗過程中得到該實驗室全體老師的指導(dǎo)及同學(xué)的協(xié)助，在此表示感謝。同時感謝成都第一制藥有限公司給予本實驗的大力支持。)

[1] 蔣崇慧，楊光田，湯 彥. 山莨菪堿在大鼠腦缺血/再灌注時對神經(jīng)元凋亡的影響[J]. 中國急救醫(yī)學(xué)，2001，21(3):131-3.

[1] Jiang C H，Yang G T，Tang Y. Influence of anisodamine on neuronal apoptosis after cerebral ischemia/reperfusion in the rats[J].ChinJCritCareMed，2001，21(3):131-3.

[2] 彭新琦，可 君. 三種莨菪類藥物在大鼠急性前腦缺血及再灌注損傷中的作用[J]. 中國藥理學(xué)報，1992，13(4):357-8.

[2] Peng X Q，Ke J. Effect of 3 henbane drugs on acute forebrain ischemia and reperfusion injury in rats[J].ActaPharmacolSin，1992，13(4):357-8.

[3] Xu W，Deng Y F. Effect of anisodine on acute forebrain ischemia-reperfusion damage in rats[J].ActaPharmacolSin，1996，17(2):161-3.

[4] Longa E Z，Weinstein P R，Carlson S，et al. Reversible middle cerbral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20(1):84-91.

[5] Zhang X Q， Eyzaguirre C. Effect of hypoxia induced by Na2S2O4on intracellar calcium and resting potential of mouse glomus cell[J].BrainRes，1999，818(1): 118-26.

[6] 路 暢，杜 肖，賀曉麗，等. 小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血/再灌注大鼠恢復(fù)早期的神經(jīng)保護作用研究[J]. 中國藥理學(xué)通報，2016，32(7):938-44.

[6] Lu C，Du X，He X L，et al. Neuroprotective effect of active components of Xiaoxuming decoction on focal cerebral ischemia /reperfusion injury in rats during early recovery period[J].ChinPharmacolBull，2016，32(7): 938-44.

[7] 陳 群，曾因明，許鵬程，等.亞低溫復(fù)合山莨菪堿對腦缺血/再灌注期間羥自由基產(chǎn)生的影響[J]. 中華麻醉學(xué)雜志,1999,19(8):509.

[7] Chen Q，Zeng Y M，Xu P C，et al. The effects of hypothermia combined with anisodamine on the hydroxyl free radical during cerebral ischemia-reperfusion[J].ChinJAnesthesiol，1999，19(8):509.

[8] Husain K，Whitworth C，Somani S M，et al .Carboplatin-induced oxidative stress in rat cochlea [J].HearRes，2001，159(1-2):14.

[9] 肖麗萍，黃益興. 急性腦梗死患者血清乳酸脫氫酶的測定及臨床意義[J]. 腦與神經(jīng)疾病雜志，2000，8(1):54.

[9] Xiao L P，Huang Y X. The determination of serum lactate dehydrogenase and its clinical significance on patients with acute cerebral infarction[J].JBrainNervDis，2000，8(1):54.

[10] 季旭明，車 萍，齊東梅，等. 川芎嗪干預(yù)大鼠局灶性腦缺血模型神經(jīng)元細胞凋亡的作用機制研究[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30(11):2461-3.

[10] Ji X M，Che P，Qi D M，et al. Study on the mechanisms of tetramethylpyrazine(TMP) resisting neural apoptosis in focal cerebral ischemia rats[J].ChinArchTraditChinMed, 2012，30(11):2461-3.

[11] 董雅潔, 高維娟. Bcl-2、Bax、caspase-3在細胞凋亡中的作用及其關(guān)系[J]. 中國老年學(xué)雜志，2012，11(32):4828-30.

[11] Dong Y J，Gao W J. The role and relationship of Bcl-2, Bax, caspase-3 in cell apoptosis[J].ChinJGerontol，2012，11(32):4828-30.

[12] Liang K， Ye Y， Wang Y, et al. Formononetin mediates neuroprotection against cerebral ischemia/reperfusion in rats via downregulation of the Bax/Bcl-2 ratio and upregulation PI3K/Akt signaling pathway[J].JNeurolSci, 344(1-2): 100-4.

[13] Xue X H, You Y M, Tao J, et al. Electro-acupuncture at points of Zusanli and Quchi exerts anti-apoptotic effect through the modulation of PI3K/Akt signaling pathway[J].NeurosciLett, 2014，558: 14-9.

[14] Chen X H， Chen S Q， Jiang Y, et al. Minocycline reduces oxygen-glucose deprivation-induced PC12 cell cytotoxicity via matrix metalloproteinase-9， integrin β1 and phosphorylated Akt modulation[J].NeurolSci， 2013，34(8)：1391-6.

[15] Liu X M， Zhou X Y， Hou J C， et al. Ginsenoside Rd promotes neurogenesis in rat brain after transient focal cerebral ischemia via activation of PI3K/Akt pathway[J].ActaPharmacolSin，2015，36(4):421-8.

[16] 王春燕，黃 萍，張朕華. 3β-雙水楊酰薯蕷皂苷元對腦缺血/再灌注損傷大鼠的梗死體積及PI3K/Akt 信號通路的影響[J]. 中國藥理學(xué)通報，2013，29(12) : 1672-5.

[16] Wang C Y，Huang P，Zhang Z H. Effects of 3β-double salicyloyl diosgenin on infarct volume and PI3K/Akt signal path in rats with focal cerebral ischemia /reperfusion injury [J].ChinPharmacolBull, 2013，29(12) : 1672-5.

[17] 許藝超，石松生.PI3K/Akt信號通路在腦缺血神經(jīng)元凋亡中作用的研究進展[J]. 國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志，2012，39(6):530-3.

[17] Xu Y C，Shi S S. The research progress of PI3K/Akt signaling pathway in the neuron apoptosis of cerebral ischemia[J].JIntNeurolNeurosurg，2012，39(6):530-3.

[18] Guo C， Yin Y， Duan J L，et al. Neuroprotective effect and underlying mechanism of sodium danshensu [3-(3，4-dihydroxyphenyl) lactic acid from Radix and Rhizoma Salviae miltiorrhizae =Danshen] against cerebral ischemia and reperfusion injury in rats[J].Phytomedicine， 2015，22(2):283-9

[19] Vaudry D， Stork P J， Lazarovici P, et al. Signaling pathways for PC12 cell differentiation: makingthe right connections[J].Science, 2002，296(5573):1648-9.

The protective mechanism of anisodine hydrobromide against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats

CHEN Dan-dan1,2， PENG Cheng1,3, WAN Feng4， LIU Han1, AO Hui1, XIE Xiao-fang1,3
(1.CollegeofPharmacy,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu611137，China; 2.DeptofPharmacyandExamination,Ya’anPolytechnicalColledge,Ya’anSichuan625000,China; 3.StateKeyLabBreedingBaseofSystematicResearch,DevelopmentandUtilizationofChineseMedicineResources,SichuanProvinceandMinistryofScienceandTechnology,Chengdu611137,China; 4.ChengduNo.1PharmaceuticalCoLtd.,Chengdu610031,China)

Aim To investigate the protective mechanism of anisodine hydrobromide against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. MethodsInvivo: the cerebral ischemia-reperfusion injury model was established by middle cerebral artery occlusion (MCAO) via suture method in rats; the rats were injected anisodine hydrobromide(1.2, 0.6, 0.3, 0.15 mg·kg-1); the morphological changes were detected by HE staining; the Nissl staining was used to count the number of surviving neurons; the activity of CAT and LDH, the LPO contents in the brain tissue were measured; the expressions of Bax, Bcl-2, caspase-3 and p-Akt in brain tissue were detected by Western blot.Invitro: Western blot assay was used to determine the expression of Bax, Bcl-2, caspase-3 and p-Akt protein expression in the OGD-R model of PC12 cells. The signal pathway of anisodine hydrobromide was identified. Results Anisodine hydrobromide with the dose of 0.15 mg·kg-1could significantly lessen the morphological changes, and improve the number of surviving neurons; the dose of 0.3 and 0.15 mg·kg-1could significantly improve the activity of CAT; the dose of 0.3 mg·kg-1could significantly reduce the contents of LPO in the rat brain tissue; the dose of 1.2 mg·kg-1could significantly decrease the activity of LDH; the dose of 0.15 ～1.2 mg·kg-1could inhibit the expression of Bax, promote the expression of p-Akt in rat brain tissue. All the doses except 0.15 mg·kg-1could promote the expression of Bcl-2 in rat brain tissue.Invitro, the results showed that anisodine hydrobromide in 25～100 μmol·L-1could significantly improve the expression of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax, and the dose of 50 μmol·L-1could significantly improve the ratio of p-Akt/Akt. Conclusion The mechanism of anisodine hydrobromide against cerebral ischemia-reperfusion injury model rats might be related to its anti-oxidative activity and the activation of Akt.

anisodine hydrobromid; cerebral ischemia-reperfusion; HE staining; Nissl staining; oxidative stress; p-Akt

2017-05-04,

2017-06-07

四川省科技支撐計劃項目(No 2016SZ0027)

陳丹丹(1986-)，女，博士生，講師，研究方向：疾病動物模型與中藥復(fù)方藥理學(xué)，E-mail:chendandan619@126.com； 謝曉芳( 1983-)，女，博士，副研究員，研究方向:中藥藥理學(xué)與毒理學(xué)，通訊作者，E-mail: xxf14544@163.com

時間：2017-7-7 11:04 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170707.1104.024.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.08.012

A

1001-1978(2017)08-1096-07

R-332；R284.1；R322.81；R743.310.22；R977.3；R977.6