張 瑋，楊 冉，郭惠芳，封曉娟，魏 群，張 玉，王奕卓，李金澤，劉淑霞

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院免疫風(fēng)濕科，河北 石家莊 050000；3. 河北省人民醫(yī)院醫(yī)院感染管理科，河北 石家莊 050000)

HMGB1和TNFAIP3在狼瘡性腎炎系膜細(xì)胞增殖中的作用

張 瑋1，楊 冉1，郭惠芳2，封曉娟1，魏 群3，張 玉2，王奕卓1，李金澤1，劉淑霞1

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院免疫風(fēng)濕科，河北 石家莊 050000；3. 河北省人民醫(yī)院醫(yī)院感染管理科，河北 石家莊 050000)

目的 初步探討高遷移率族蛋白1(high mobility group protein B1，HMGB1)和腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3(tumor necrosis factor α-induced protein-3, TNFAIP3)在狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)患者和人類腎小球系膜細(xì)胞(human mesangial cell, HMC)增殖中的作用及機(jī)制。方法 收集Ⅳ型LN患者的腎穿樣本，采用免疫熒光和免疫組化技術(shù)檢測腎小球細(xì)胞中HMGB1、TNFAIP3及IκBα蛋白表達(dá)水平；運(yùn)用人重組HMGB1為刺激物刺激HMC，采用BrdU參入技術(shù)檢測細(xì)胞增殖水平，并用Western blot技術(shù)檢測TNFAIP3、IκBα及p65表達(dá)水平。結(jié)果 與對照組相比，LN患者腎小球細(xì)胞中HMGB1及TNFAIP3蛋白表達(dá)升高，IκBα表達(dá)水平降低；體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，人重組HMGB1刺激HMC后，細(xì)胞增殖水平明顯升高，同時在HMGB1刺激30 min后，與對照組相比，TNFAIP3的蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，而IκBα蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，隨后p65蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。結(jié)論 HMGB1和TNFAIP3可能通過活化NF-κB信號通路促進(jìn)LN系膜細(xì)胞的過度增殖。

狼瘡性腎炎；HMGB1；TNFAIP3；細(xì)胞增殖；人系膜細(xì)胞；蛋白表達(dá)

狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡常見并發(fā)癥之一，也是其主要的致死原因，其在國內(nèi)的發(fā)病率逐年攀升，但因具體作用機(jī)制并不清楚，治愈率很低[1]。因此，對其作用機(jī)制的研究尤為重要。

高遷移率族蛋白1(high mobility group protein B1， HMGB1)是一種非組蛋白染色質(zhì)結(jié)合蛋白，參與DNA的轉(zhuǎn)錄及修飾等生物學(xué)功能。新近研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1作為炎癥因子參與了呼吸系統(tǒng)、肝臟、腫瘤及自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征等多種疾病的發(fā)生[2-4]，其在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的作用也得到越來越多的重視[5]，但HMGB1在LN中發(fā)揮了何種作用尚不明確。

之前我們的研究發(fā)現(xiàn)在小鼠系膜細(xì)胞中，HMGB1能夠活化NF-κB信號通路，從而促進(jìn)系膜細(xì)胞的增殖[6]，但在LN患者及人類系膜細(xì)胞中是否也存在相似作用仍是未知。此外，我們近來研究發(fā)現(xiàn)，在LN患者外周血中腫瘤壞死因子-α-誘導(dǎo)蛋白- 3(tumor necrosis factor α-induced protein 3，TNFAIP3)mRNA表達(dá)水平明顯升高。TNFAIP3作為炎癥反應(yīng)負(fù)向調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，是一種表達(dá)于多個免疫器官的誘導(dǎo)性胞質(zhì)蛋白，該基因既具有泛素化酶又具有去泛素化酶的功能[7]，以往研究發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平異?？赡芘cNF-κB的功能異常有關(guān)。然而，TNFAIP3是否與HMGB1共同參與調(diào)控NF-κB的活性，從而參與LN的發(fā)生發(fā)展目前仍不清楚。

因此，本實(shí)驗(yàn)擬以Ⅳ型LN患者及人腎小球系膜細(xì)胞(human mesangial cell, HMC)為研究對象，通過對HMGB1及TNFAIP3相關(guān)信號通路的研究，探討HMGB1和TNFAIP3在LN腎小球系膜細(xì)胞過度增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 采用癌旁遠(yuǎn)端正常組織和LN患者腎組織各15例，實(shí)驗(yàn)已經(jīng)過倫理委員會核準(zhǔn)，由河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院提供。人系膜細(xì)胞系購自中南大學(xué)高等研究中心。兔抗HMGB1單克隆抗體(Abcam公司，貨號ab79823)，兔抗TNFAIP3多克隆抗體(ABclonal公司，貨號A2127)，兔抗IkBα單克隆抗體(Abcam公司，貨號ab32518)，兔抗p65多克隆抗體(Abcam公司，貨號ab90532)，SP法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號SP9001)，Dylight 649-山羊抗兔熒光二抗(KPL公司，貨號072051806)，BrdU參入試劑盒(Merck Millipore 公司，貨號2752)。

1.2 分組 腎穿樣本分為正常組織對照組和LN患者組。細(xì)胞分組：采用人重組HMGB1蛋白刺激HMC細(xì)胞，對細(xì)胞增殖水平影響的研究分為空白對照組和不同濃度刺激組，收集不同濃度刺激后各個時間點(diǎn)的細(xì)胞；對蛋白表達(dá)水平影響的研究分為空白對照組和不同時間點(diǎn)刺激組。

1.3 免疫組化 腎組織脫蠟至水；3%過氧化氫避光孵育20 min，0.01 mmol·L-1枸櫞酸修復(fù)液，高壓修復(fù)5 min并自然晾涼；正常山羊血清37℃封閉60 min；滴加抗TNFAIP3或IκBα抗體(1 ∶200稀釋)4℃過夜；二抗37℃孵育30 min；三抗37℃孵育30 min；DAB顯色液顯色5 min；蘇木精染色2 min；氨水返藍(lán)30 s，鹽酸酒精分化30 s；脫水透明，中性樹膠封片。

1.4 免疫熒光 腎組織脫蠟至水；0.01 mmol·L-1枸櫞酸修復(fù)液，高壓修復(fù)5 min；正常山羊血清37℃封閉60 min；滴加抗HMGB1抗體(1 ∶200稀釋)，4℃過夜；0.01 mmol·L-1PBS洗滌3次，每次5 min；TRITC-山羊抗兔IgG(1 ∶200稀釋)37℃孵育60 min(避光)；DAPI復(fù)染；熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。免疫熒光染色結(jié)果判定：HMGB1蛋白陽性信號均呈紅色熒光。

1.5 BrdU參入法檢測細(xì)胞增殖水平 HMC細(xì)胞以1×105/孔接種于96孔板，用50、100、200μg·L-1的人重組HMGB1蛋白刺激細(xì)胞，每組設(shè)立3個復(fù)孔。37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)2、4、8、12 h；收集細(xì)胞前1 h，每孔加入100 μL BrdU參入液；收集細(xì)胞，每孔加入固定液200 μL，室溫孵育30 min；Washing Buffer沖洗3次；每孔滴加抗BrdU抗體100 μL，室溫放置1 h，Washing Buffer沖洗3次；每孔滴加二抗100 μL，室溫孵育30 min，Washing Buffer沖洗3次,滴加過氧化物酶底物每孔100 μL，室溫孵育30 min，此時增殖活躍的細(xì)胞孔呈藍(lán)色。每孔加入終止液100 μL，細(xì)胞孔由藍(lán)色變?yōu)榱咙S，酶標(biāo)儀于450 nm處檢測其OD值。

1.6 Western blot 采用100 μg·L-1人重組HMGB1蛋白刺激HMC，收集刺激后0、10、20、30、40、50、60 min各時間點(diǎn)的細(xì)胞，裂解后，采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，煮沸5 min變性。50 μg樣品進(jìn)行10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白分離后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉37℃封閉1 h。加入TNFAIP3、IκBα或p65抗體(稀釋濃度均為1 ∶1 000)4℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋濃度為1 ∶5 000)37℃孵育2 h。Odyssey FC成像系統(tǒng)顯影，并對條帶進(jìn)行定量分析，以目的條帶和β-actin條帶積分光密度值(IOD值)的比值代表目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 腎組織中HMGB1、TNFAIP3和IκBα蛋白的表達(dá)水平 免疫熒光結(jié)果提示，與對照組癌旁遠(yuǎn)端正常組織相比，LN患者腎小球HMGB1蛋白(紅色)陽性細(xì)胞比例明顯升高，且主要定位于細(xì)胞核(Fig 1A、1B)。免疫組化結(jié)果提示，與對照組相比，TNFAIP3蛋白表達(dá)水平升高(Fig 1C、1D)，IκBα蛋白表達(dá)水平降低(Fig 1E、1F)，二者均定位于細(xì)胞質(zhì)。

Fig 1 HMGB1, TNFAIP3 and IκBα expression levels in glomerular cells of type Ⅳ LN patients and normal tissues by immunofluorescence and immunohistochemistry technique

A～B:Immunofluorescence of HMGB1 expression; C～D:Immunohistochemistry of TNFAIP3 expression; E～F:Immunohistochemistry of IκBα expression

2.2 HMGB1對HMC細(xì)胞增殖的影響 LN患者體內(nèi)存在HMGB1的上調(diào)，該上調(diào)是否與細(xì)胞增殖有關(guān)呢？我們進(jìn)一步采用HMGB1重組蛋白對人類的系膜細(xì)胞(HMC)進(jìn)行刺激，BrdU參入結(jié)果提示，與對照組相比，100、200 μg·L-1HMGB1刺激HMC 8、12 h后，HMC增殖水平均明顯升高(P<0.05)，二者之間無明顯差異(Fig 2)。

2.3 TNFAIP3在HMGB1參與的NF-κB信號通路中的作用 是否由于HMGB1的上調(diào)引起TNFAIP3表達(dá)量的變化，從而影響了NF-κB信號通路的活化水平呢？我們采用HMGB1重組蛋白對HMC在不同時間點(diǎn)進(jìn)行刺激，研究TNFAIP3的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，人重組HMGB1刺激10 min后，HMC中TNFAIP3蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)，見Fig 3。而IκBα蛋白表達(dá)水平與TNFAIP3正好相反，與對照組相比，人重組HMGB1刺激30 min后， HMC中 IκBα蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見Fig 4。p65蛋白表達(dá)水平與IκBα相反，與對照組相比，刺激40 min后，明顯升高(P<0.05)。提示TNFAIP3可能參與HMGB1誘導(dǎo)的HMC中NF-κB信號通路的活化，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。

Fig 2 HMC proliferation levels increased significantly after HMGB1 stimulation using BrdU incorporation technology

*P<0.05vscontrol

Fig 3 TNFAIP3 protein expression level increased 10, 20, 30 min after HMGB1 stimulation

*P<0.05vscontrol

3 討論

LN是系統(tǒng)性紅斑狼瘡最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥，但其發(fā)病機(jī)制尚未清楚。細(xì)胞免疫及體液免疫功能紊亂導(dǎo)致多種細(xì)胞因子分泌失衡，并通過相互協(xié)同或拮抗作用參與多種組織和器官的損傷[8]，其中HMGB1的作用得到越來越多的關(guān)注。HMGB1是一種非組蛋白染色質(zhì)結(jié)合蛋白，我們的前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HMGB1在小鼠狼瘡性腎炎中異常表達(dá)[6,9]，提示HMGB1可能參與了LN的發(fā)病過程，但是具體機(jī)制如何仍不十分清楚。

Fig 4 IκBα protein expression level decreased,while p65 increased significantly 30 min and 40 min after HMGB1 stimulation

*P<0.05vscontrol

腎小球細(xì)胞的增殖是LN的主要病理特征之一，也是其腎臟病理的活動性指標(biāo)。我們以往研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠系膜細(xì)胞中HMGB1可能促進(jìn)腎小球細(xì)胞增殖，參與疾病發(fā)生[6,10]。本研究也證實(shí)了HMGB1在LN患者腎小球細(xì)胞中，尤其是系膜區(qū)細(xì)胞中存在表達(dá)水平的上調(diào)；體外實(shí)驗(yàn)則證實(shí)了人重組HMGB1能夠誘導(dǎo)HMC增殖水平的升高。這些結(jié)果提示HMGB1可能在LN的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用，而這一作用是通過促增殖作用實(shí)現(xiàn)的。那么，HMGB1又是如何發(fā)揮作用的呢？

HMGB1可能是通過激活細(xì)胞內(nèi)信號通路發(fā)揮其功能的。其中，NF-κB信號通路與免疫性疾病的關(guān)系最為密切[11-12]。正常情況下，NF-κB與IκB組成三聚體處于失活狀態(tài)。IκB蛋白的降解使NF-κB從三聚體中得以釋放，并被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中發(fā)揮其核轉(zhuǎn)錄因子作用。在這個過程中，IκBα的降解是整個信號通路的中心環(huán)節(jié)之一。在本研究中，我們證實(shí)了在LN患者腎小球細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)確實(shí)存在著IκBα蛋白表達(dá)水平的降低，提示IκBα有可能遭到降解，泛素化是常見的蛋白降解途徑之一。我們對多種泛素連接酶進(jìn)行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNFAIP3在LN患者中表達(dá)水平明顯升高。TNFAIP3是一種表達(dá)于多個免疫器官的誘導(dǎo)性胞質(zhì)蛋白，該基因既具有泛素化酶又具有去泛素化酶的功能，因而在免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤、TNF介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等方面均具有重要作用[7]。有研究證實(shí)其與NF-κB-IκB三聚體的關(guān)系密切[13]，能夠抑制NF-κB的活化，是重要的炎癥抑制因子，而且TNFAIP3與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病的關(guān)系也十分密切[14]。但是TNFAIP3在LN進(jìn)展中的作用仍不十分明了，我們在研究中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，TNFAIP3在LN患者腎小球中的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，推測TNFAIP3表達(dá)水平的變化可能是由HMGB1所介導(dǎo)的。

因此，我們以人重組的HMGB1刺激HMC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNFAIP3表達(dá)水平迅速升高，隨后我們檢測到了IκBα蛋白表達(dá)水平的下調(diào)，p65蛋白表達(dá)水平明顯增加。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示，HMGB1可能通過上調(diào)TNFAIP3蛋白表達(dá)水平，影響IκBα的表達(dá)水平，誘發(fā)NF-κB信號通路的活化，介導(dǎo)系膜細(xì)胞過度增殖，從而參與LN的發(fā)病。以往研究認(rèn)為TNFAIP3為NF-κB的負(fù)調(diào)節(jié)因子[15]，但是在LN中TNFAIP3的具體作用尚不明確，因此，是否有其他的因素影響其負(fù)調(diào)控作用仍是未知[16]。總之，TNFAIP3是如何影響IκBα表達(dá)水平，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究證實(shí)了HMGB1和TNFAIP3在LN腎小球系膜細(xì)胞過度增殖中的重要作用，為揭示LN的發(fā)病過程提供了新的依據(jù)，同時為其靶向治療提供了新的思路。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)在河北省腎臟病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、河北醫(yī)科大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室完成，特此致謝! )

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Role of HMGB1 and TNFAIP3 involved in mesangial cell proliferation of lupus nephritis

ZHANG Wei1, YANG Ran1,GUO Hui-fang2,FENG Xiao-juan1,WEI Qun3,ZHANG Yu2,WANG Yi-zhuo1, LI Jin-ze1, LIU Shu-xia1
(1.DeptofPathology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China;2.DeptofRheumatology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China;3.DeptofNosocomialInfectionControl,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050000,China)

Aim To investigate the mechanism of high mobility group protein B1(HMGB1) and tumor necrosis factor α-induced protein-3(TNFAIP3) involved in cell proliferation in lupus nephritis(LN) patients and human mesangial cells(HMC).Methods Immunofluorescence and immunohistochemistry technique were employed to detect HMGB1, TNFAIP3 and IκBα expression levels in glomerular cells of type Ⅳ LN patients. BrdU incorporation technology was used to detect cell proliferation level in HMC after stimulated by recombinant HMGB1.TNFAIP3 and IκBα expression levels in HMC were detected after HMGB1 stimulation by Western blot.Results The expression levels of HMGB1 and TNFAIP3 were increased in LN patients, while IκBα was decreased. HMC proliferation levels increased significantly after HMGB1 stimulation. At the same time, 30 minutes after HMGB1 stimulation, the expression level of TNFAIP3 was significantly increased(P<0.05), while IκBα decreased(P<0.05) and then p65 increased significantly(P<0.05),compared with control group.Conclusion HMGB1 and TNFAIP3 are probably involved in mesangial cell proliferation by activating of NF-κB signaling pathways in LN pathogenesis.

lupus nephritis; HMGB1; TNFAIP3; cell proliferation; human mesangial cells; protein expression

2017-03-18,

2017-04-16

河北省自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(No H2015206449)；河北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)科技研究計(jì)劃(No ZD20140034)；河北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(No 201510089038)

張 瑋(1983-)，女，博士，講師，研究方向：泛素化與去泛素化在狼瘡性腎炎發(fā)病中的作用，E-mail：zwbl201309@126.com； 楊 冉(1990-)，女，碩士生，研究方向：狼瘡性腎炎的發(fā)病機(jī)制，共同第一作者，E-mail：767388259@qq.com； 劉淑霞(1975-)，女，博士，教授，研究方向：狼瘡性腎炎的發(fā)病機(jī)制，通訊作者，E-mail: susanliu1976@163.com

時間：2017-7-7 11:04 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170707.1104.028.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.08.014

A

1001-1978(2017)08-1109-05

R322.61；R329.24；R593.242；R977.6