渠海 呂萌萌 朱宇皇 付光宇

基于三種檢測方法的17α羥孕酮臨床檢測比對

渠海1呂萌萌2朱宇皇1付光宇1

目的 評價具有不同檢測原理的3個17α羥孕酮試劑盒，分析其臨床檢測結(jié)果的相關性和一致性。方法收集2015年2月至10月臨床確診為先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥患者的血清120例，設為試驗組；收集同期體檢健康者血清120例，設為對照組。分別采用3個產(chǎn)品的17α羥孕酮試劑盒進行定量檢測，對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析。結(jié)果3個產(chǎn)品的相關性R2分別為0.82、0.76和0.77，臨床的陽性符合率為100%、100%和99.2%，陰性符合率為97.5%、98.3%和98.3%，總符合率為98.8%、99.2%和98.8%。3個產(chǎn)品的臨床符合率差異無統(tǒng)計學意義（P〉0.05）。結(jié)論不同檢測原理的3個產(chǎn)品的17α羥孕酮試劑盒的臨床檢測結(jié)果具有等效性，符合臨床應用要求。

17α羥孕酮；放射免疫法；酶聯(lián)免疫法；磁微?；瘜W發(fā)光法

先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥（congenital adrenal hyperplasia，CAH）是一種由于腎上腺皮質(zhì)激素合成途徑中酶的缺陷引起的疾病，屬常染色體隱性遺傳?。?］。常見的缺陷酶包括21-羥化酶、17-羥化酶、3-羥脫氫酶和11-羥化酶等，其中21-羥化酶缺陷癥（21-hydroxylase deficiency，21-OHD）約占CAH的90%～95%［2］。臨床上通常把CAH分為經(jīng)典型和非經(jīng)典型，其中非經(jīng)典型又稱做遲發(fā)型（nonclassic 21-hydroxylase deficiency，NCCAH）。經(jīng)典型多發(fā)于新生兒，發(fā)病率約為10/10萬；遲發(fā)型多發(fā)于非新生兒，發(fā)病率約為前者的l0倍，女性多于男性［3］。

由于21-羥化酶在類固醇激素的代謝過程中起著至關重要的作用，所以其在體內(nèi)的缺失會導致 17α 羥孕酮（17α-OH-progesterone，17α-OHP）含量逐漸的升高。17α-OHP被認為是CAH特別是NCCAH診斷中的最顯著的指標［4］。目前市場上針對非新生兒檢測的試劑盒多種多樣，檢測方法也各異。主要有放射免疫、酶聯(lián)免疫以及化學發(fā)光等檢測方法。經(jīng)查詢國家食品藥品監(jiān)督管理總局網(wǎng)站，鄭州安圖生物工程股份有限公司的17α-OHP檢測試劑盒是針對非新生兒CAH的首個全自動磁微?；瘜W發(fā)光產(chǎn)品。而且在國際上，該廠家的17α-OHP檢測試劑也是首次成功應用到全自動磁微?；瘜W發(fā)光的檢測系統(tǒng)中的產(chǎn)品。

本文選擇3種方法學的商業(yè)試劑盒進行研究，以臨床診斷結(jié)果作為金標準，進行臨床樣本比對工作。研究目前醫(yī)院應用較為廣泛的17α-OHP商業(yè)試劑盒之間的差異及與臨床結(jié)果的符合率，為臨床使用單位選擇適宜試劑產(chǎn)品提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本

2015年2月至10月從鄭州市第六人民醫(yī)院收集臨床確診為先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥的患者血清120例，設為試驗組。收集同期體檢健康者血清120例設為對照組。健康樣本來源人群，無現(xiàn)病史及近期手術史，排除孕婦和產(chǎn)婦。每例樣本均記錄性別、年齡、臨床診斷，女性樣本應當確認其生理周期。樣本使用無添加劑采血管（紅蓋）收集，37℃靜置30 min，離心15 min，-20℃保存?zhèn)溆?。嚴重溶血、脂血或渾濁的樣本不能用于檢測，需重新采集。

1.2 試劑和主要儀器

主要儀器：PHO mo酶標儀和Auto Lumo A2000全自動化學發(fā)光測定儀（鄭州安圖生物工程股份有限公司），GC-911γ放射免疫計數(shù)器（中佳光電儀器）。試劑：美國DSL公司（產(chǎn)品A）放射免疫17α-OHP檢測試劑盒，貨號ACTIVE 17α-OHP PROGESTERONE DSL-5000；鄭州安圖生物工程股份有限公司（產(chǎn)品B）生產(chǎn)的磁微?；瘜W發(fā)光17α-OHP檢測試劑盒，批號20150728；德國DRG公司（產(chǎn)品C）生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫17α-OHP檢測試劑盒，貨號EIA-1292。商業(yè)第三方控制品（Lyphochek?Immunassay Plus Control 40271-40273，5 mL/瓶，Bio-Rad Laboratories，Inc）。

1.3 方法學比對

分析3個試劑盒的線性范圍以及正常值參考范圍，使用商業(yè)第三方控制品確認3個試劑盒在重復性和準確度之間的差異，保證檢測結(jié)果的合理有效性。

重復性與準確度的考察參照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會頒布的EP系列文件，主要步驟如下：

重復性：試劑盒檢測高、中、低值3支質(zhì)控品，要求重復測定5天，每天重復4次。根據(jù)擬合標準曲線計算測量結(jié)果，再計算每個濃度水平至少20次測量結(jié)果的平均值M和標準差SD，根據(jù)公式CV=SD/M×100%得出變異系數(shù)CV。

準確度：試劑盒檢測高、中、低值3支質(zhì)控品，按照1∶9的比例分別加入到相同的基質(zhì)樣本中，制成回收樣本，加入高值樣本的體積不得超過總體積的10%。每個回收樣本重復檢測3次求均值，計算回收率。

通過對相同人群樣本的臨床檢測，對3家同類產(chǎn)品進行比較，結(jié)合240份臨床診斷結(jié)果，分析商業(yè)試劑盒與診斷結(jié)果之間的符合率。排除線性范圍外的40份樣本后，通過對線性范圍內(nèi)的200份樣本進行兩兩比對，對檢測結(jié)果的相關性作圖，得出相應的R2，分析測定結(jié)果差異的原因。

1.4 判斷標準

臨床符合率根據(jù)各個廠家提供的產(chǎn)品說明書中的正常人參考值范圍進行判定，參考值范圍內(nèi)為陰性，參考值范圍外為陽性。

1.5 操作人員要求

經(jīng)專業(yè)上崗培訓并且取得相應上崗證的醫(yī)學檢驗專業(yè)人員。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行相關回歸分析，分別計算3個廠家產(chǎn)品檢測結(jié)果的陽性符合率和陰性符合率，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，相關系數(shù)R2＞0.9表示測定結(jié)果相關性好。

2 結(jié)果

2.1 3個廠家試劑盒的操作過程分析

根據(jù)廠家說明書，比較3個廠家試劑盒的操作過程，產(chǎn)品B整個過程優(yōu)于產(chǎn)品A和產(chǎn)品C，見表1。

2.2 3個廠家試劑盒的線性范圍分析

根據(jù)廠家說明書，比較3個廠家試劑盒的線性范圍，廠家B具有最寬的線性范圍，廠家A具有最低的檢測能力，見表2。

2.3 3個廠家試劑盒的正常值參考范圍

根據(jù)廠家說明書，比較3個廠家試劑盒的正常值參考范圍，3個廠家試劑盒的正常值參考相差較小，可以進行臨床平行比對，見表3。

2.4 3個廠家試劑盒的重復性和準確度比較

采用商業(yè)第三方質(zhì)控比較3個廠家試劑盒的重復性和準確度，3個廠家試劑盒在重復性和準確度方面均無顯著的差異，見表4、5。

表1 3個廠家試劑盒的操作過程Table 1 The test procedure of 3 kits

表2 3個廠家試劑盒的線性范圍Table 2 The assay dynamic range of 3 kits

表3 3個廠家試劑盒的正常值參考范圍Table 3 The expected normal values of 3 kits

表4 3個廠家試劑盒的重復性Table 4 The reproducibility of 3 kits

表5 3個廠家試劑盒的準確度Table 5 The accuracy of 3 kits

2.5 3個廠家試劑盒的陽性率、陰性率及總符合率比較

以臨床診斷作為實驗檢測的金標準，試驗組120例血清經(jīng)3個廠家試劑盒檢測后的結(jié)果與金標準的陽性符合率見表6。對照組120例血清經(jīng)3個廠家試劑盒檢測后的結(jié)果與金標準的陰性符合率見表7。3個廠家試劑盒檢測后的結(jié)果與金標準的總符合率見表8。3個廠家產(chǎn)品的檢測結(jié)果差異在試驗組及對照組中均無統(tǒng)計學意義（P〉0.05）。

2.6 3個廠家試劑盒間的相關性分析

從2.2的結(jié)果可以看出，產(chǎn)品B的線性范圍與產(chǎn)品A和C相比，增加了20～30 ng/mL的檢測區(qū)間，為了驗證該區(qū)段之間的相關性，以產(chǎn)品B的線性范圍0～30 ng/mL為參考，分別對范圍內(nèi)的3個廠家試劑盒的200份臨床樣本的定量檢測結(jié)果進行兩兩比對，產(chǎn)品A與B、A與C以及B與C的斜率為 1.09、0.94和0.79，其R2值分別為0.82、0.76和0.77，見圖1～3。

表6 3個廠家試劑盒的試驗組與金標準陽性符合率統(tǒng)計Table 6 The positive coincidence rate of 3 kits and gold standard in experimental group

表7 3個廠家試劑盒的對照組與臨床診斷陰性符合率統(tǒng)計Table 7 The negative coincidence rate of 3 kits and gold standard in control group

表8 3個廠家試劑盒的對照組與臨床診斷符合率統(tǒng)計Table 8 The total coincidence rate of 3 kits and gold standard in control group

2.7 3個廠家試劑盒的異常樣本分析

由2.4和2.6結(jié)果可以觀察到，3個廠家試劑盒變異在10%以內(nèi)，產(chǎn)品兩兩比對的斜率在25%以內(nèi)，所以選出廠家間數(shù)值差異在1.5倍以上的樣本進行分析，根據(jù)各個廠家試劑盒的正常值參考范圍，確定與金標準之間的差異，結(jié)果表明數(shù)值異常樣本對臨床診斷結(jié)果影響較小，見表9。

圖1 產(chǎn)品A和B相關性分析Figure 1 The clinical correlation of A and B

圖2 產(chǎn)品A和C相關性分析Figure 2 The clinical correlation of A and C

圖3 產(chǎn)品B和C相關性分析Figure 3 The clinical correlation of B and C

表9 3個廠家試劑盒實質(zhì)異常樣本的結(jié)果分析Table 9 The result of variation sample in 3 kits

3 討論

由于CAH屬于染色體隱形遺傳病的一種，所以對于CAH的關注，早期主要集中在對新生兒的篩查。1977年17α-OHP的測定方法出世，使非新生兒21-羥化酶缺陷癥篩查成為可能［5］。隨著發(fā)達國家對該疾病研究的深入，以及近年來因NCCAH所造成的臨床誤診引起了國內(nèi)一些學者及醫(yī)學工作者關注，除了對新生兒篩查的研究［6-7］外，對17α-OHP在NCCAH檢測中的意義也得到了廣大共識，逐漸興起了研究的熱潮［8-9］。

17α-OHP是由腎上腺皮質(zhì)及性腺產(chǎn)生，其活性很低，經(jīng)21-羥化酶作用下生成皮質(zhì)醇的前體化合物［10-11］。17α-OHP在體內(nèi)具有與腎上腺皮質(zhì)醇一致的晝夜節(jié)律變化。目前市場上存在有放射免疫、酶聯(lián)免疫以及化學發(fā)光等不同原理的17α-OHP檢測試劑盒。放射免疫分析法靈敏度高，幾乎可測定生物體內(nèi)任何物質(zhì)，但檢測操作相對繁瑣，同時存在放射性污染的問題。酶聯(lián)免疫試劑具備試劑穩(wěn)定、無危害污染、操作簡便等優(yōu)點，得以迅速推廣應用。至今酶聯(lián)免疫仍是免疫分析方法中較常用的方法?；瘜W發(fā)光免疫分析是將具有高靈敏度的化學發(fā)光測定技術與高特異性的免疫反應相結(jié)合的檢測分析技術。免疫磁珠是免疫學和磁微粒技術結(jié)合而發(fā)展起來的一類新型材料，此固相材料有較多的優(yōu)點，既可提高混勻速度和分離效率，又達到擴大抗原抗體反應接觸面積的目的，并且可以同時在磁場的作用下，快速使抗原抗體復合物和游離蛋白得到分離，以達到縮短反應時間和簡化操作步驟的目的。磁微粒化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)是免疫磁珠、化學發(fā)光與免疫反應3個體系相結(jié)合而建立的檢測體系，是用于檢測微量抗原或抗體的一種標記免疫測定技術。該體系既具有放射免疫分析的高靈敏度，又避免放射性污染；即具有酶聯(lián)免疫的操作簡便性，又具有使用自動化設備實現(xiàn)單個反應標準化管理的特點，減低手工操作或板式產(chǎn)品批量管理造成的檢驗結(jié)果誤差；試劑穩(wěn)定，保質(zhì)期長，成為最有前途的免疫分析方法之一。

通過線性范圍、正常值參考范圍及分析性能的比對，3個廠家的試劑盒具備臨床比對的特征。結(jié)果顯示3種方法與金標準的符合率較優(yōu)（陰陽性符合率〉98%）。但是3個廠家試劑盒之間臨床濃度值有較大差異，低值區(qū)個別樣本可能由于各廠家方法學間的差異會出現(xiàn)假陽性，兩兩比對相關性R2均未達到0.9以上。這也與國際上之前的研究結(jié)果相一致［12］，針對該類樣本需繼續(xù)跟蹤，進行數(shù)據(jù)積累統(tǒng)一分析。此情況可能是由于各個廠家使用的抗體不同，不同抗體與體內(nèi)小分子類似物的交叉反應程度不同，從而不能達到量值上的一致性。3個廠家試劑盒沒有明顯的差異性，都存在假陽性的問題，這也是與色譜質(zhì)譜聯(lián)用的金標準比較存在不足的地方［13］。高效液相色譜串聯(lián)檢測17α-OHP，在國外已經(jīng)得到了廣泛的應用，相應的基礎研究也有很多，均表現(xiàn)出了與臨床診斷結(jié)果有良好的一致性［14-15］。許多國外的臨床診斷機構(gòu)都已經(jīng)應用到實際工作中，如美國的QUEST和Labcorp。色譜方法雖然檢測結(jié)果準確可靠，被視為小分子檢測的金標準，但因為設備昂貴，操作繁瑣，不符合國情。而免疫診斷方法具有費用低、檢測快捷等優(yōu)點被市場廣泛應用，但解決假陽性的問題仍需要各方積極努力。

綜上所述，經(jīng)本研究組的臨床比對，雖然3個廠家不同檢測原理的17α-OHP檢測試劑盒在臨床相關性不能達成一致，但與臨床診斷的符合率較高，具有等效性，在現(xiàn)有金標準不能廣泛應用開展的前提下，能夠滿足臨床檢測要求。臨床使用單位可根據(jù)操作繁雜度及其他性價比等選擇適宜本單位的優(yōu)質(zhì)試劑產(chǎn)品。

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The clinical comparison of three methods for 17α-OH-progesterone assay kit

QU Hai1，LV Mengmeng2，ZHU Yuhuang1，F(xiàn)U Guangyu1
（1.Autobio Diagnostics CO.，Ltd，Zhengzhou，Henan，China，450016；2.Department of Clinical Laboratory，the Sixth People’s Hospital of Zhengzhou City，Zhengzhou，Henan，China，450015）

Objective To compare the correlation and consistency of results of 17α-OH-progesterone assay kits from 3 different manufactures. Methods From February to October 2015,17α-OH-progesterone in serum samples collected from 120 patients with congenital adrenal hyperplasia and 120 healthy subjects were detected by 3 different manufactures.The results of 17α-OH-progesterone were statistically analyzed. Results The R2of results detected by the 3 kits were 0.82,0.76 and 0.77.The positive coincident rate were 100%,100%and 99.2%.The negative coincident rate were 97.5%,98.3%and 98.3%.The total coincident rate were 98.8%,99.2%and 98.8%.The value of 3 kits were without statistical difference(P〉0.05).Conclusion The performance of the 3 kinds of 17α-OH-progesterone assay kit might be equivalent,all of which could meet the requirements of clinical application.

17α-OH-progesterone;Immuno-radiametric assay(RIA);Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA);Chemiluminescent microparticle immunoassay(CMIA)

河南省重大科技專項（121100510200）

1.鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南，鄭州450016

2.鄭州市第六人民醫(yī)院檢驗科，河南，鄭州450015

付光宇，E-mail：fuguangyu@autobio.com.cn