林芬 楊立業(yè) 邢少宜 張琳

廣東潮汕地區(qū)地中海貧血基因突變譜分析

林芬 楊立業(yè) 邢少宜 張琳

目的 了解潮汕地區(qū)地中海貧血的基因突變類型及構(gòu)成比，為更準(zhǔn)確地進(jìn)行地貧診斷提供理論依據(jù)。方法應(yīng)用跨越斷裂點(diǎn)聚合酶鏈反應(yīng)（Gap-polymerase chain reaction，Gap-PCR）、反向斑點(diǎn)雜交（reverse dot blot，RDB）技術(shù)和PCR+導(dǎo)流雜交法，分析潮汕4個(gè)地理區(qū)域（汕頭、潮州、揭陽、汕尾）的地貧基因突變類型。結(jié)果2 057例地貧樣本中，檢出14種α-地貧突變基因和19種β-地貧突變基因，同時(shí)檢出α和β復(fù)合型地貧13種。α-地貧中最常見的基因型為東南亞缺失型（--SEA），β-地貧以IVS-Ⅱ-654M位點(diǎn)突變最為常見，其次是41/42M。結(jié)論潮汕地區(qū)地中海貧血的基因突變類型呈多樣化，本研究的數(shù)據(jù)可為本地區(qū)開展地貧診斷和研究提供參考資料。

地中海貧血；基因類型；潮汕地區(qū)

地中海貧血（地貧）是由于珠蛋白基因發(fā)生缺陷，致使珠蛋白鏈合成減少或缺如而導(dǎo)致的一組遺傳性溶血性疾病，輕者可無臨床表現(xiàn)，重者以進(jìn)行性溶血性貧血為主要特征。地貧遍布世界各地，高發(fā)于地中海沿岸的意大利、希臘、馬耳他、塞浦路斯、中非洲、亞洲、南太平洋地區(qū)到東南亞各國的廣大地區(qū)［1-2］，它給流行區(qū)人們?cè)斐删薮蟮墓残l(wèi)生問題和社會(huì)負(fù)擔(dān)。我國長江以南的廣大地域?yàn)榈刂泻Ｘ氀甙l(fā)區(qū)，尤以廣西、廣東和海南三省為甚。據(jù)流行病學(xué)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析估算，廣東每年約有11萬新生兒為地中海貧血基因攜帶者，每年出生重癥地中海貧血超過1 000人［3］。

潮汕地處廣東沿海區(qū)域，擁有10 918.5平方公里的面積和1 500萬的人口，潮汕居民為中原南下福建而后遷入粵東地區(qū)的早期漢人后裔。以往文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，地貧在潮汕地區(qū)有較高的發(fā)生率［4-5］。本文對(duì)該地4個(gè)區(qū)域（潮州、汕頭、揭陽和汕尾）確診的2 057例地貧樣本進(jìn)行基因突變類型分析。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

地貧基因檢測樣本收集自潮汕4個(gè)地理區(qū)域，分別為汕頭市（汕頭大學(xué)附屬第一醫(yī)院，70例）、潮州市（潮州市中心醫(yī)院，1 441例）、揭陽市（普寧婦幼保健院，154例；榕城婦幼保健院，89例）、汕尾（陸豐婦幼保健院，303例）。受測者年齡在5～80歲之間，平均年齡（37.5±0.8）歲，超過98%為潮汕本地人，均簽署了地貧基因檢測知情同意書。所有受測者抽取2 mL外周血，在4℃環(huán)境下送至分子實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行地貧基因分析。

1.2 方法

1.2.1 試劑

潮州和汕頭地區(qū)的標(biāo)本采用深圳亞能生物科技有限公司的地中海貧血基因檢測試劑盒檢測，汕尾和揭陽的標(biāo)本采用廣東凱普生物化學(xué)有限公司的地中海貧血基因檢測試劑盒檢測。

1.2.2 標(biāo)本制備

取受測者EDTA-K2抗凝血各100 μL，嚴(yán)格按照試劑盒說明提取樣本DNA。

1.2.3 潮州和汕頭α/β地貧的分子診斷

缺失型α-地貧基因診斷使用深圳亞能的α-地貧基因檢測試劑盒（Gap-PCR法）進(jìn)行檢測，左側(cè)缺失為-α3.7，右側(cè)缺失為-α4.2，東南亞型缺失為--SEA，雙重缺失雜合子為-α3.7/--SEA和-α4.2/--SEA。突變型α-地貧基因診斷應(yīng)用深圳亞能的非缺失型α-地貧基因突變檢測試劑盒（PCR-反向點(diǎn)雜交）檢測中國人常見的3種突變，分別為Hb Constant Spring（αCSα）、Hb Quong Sze（αQSα）和 Hb West Mead（αWSα）。β-地貧基因診斷應(yīng)用深圳亞能的β-地貧基因檢測試劑盒（PCR-反向點(diǎn)雜交法），檢測中國人常見的β-珠蛋白基因17種突變，分別為：-29M（A〉G），-28M（A〉G），-30M（T〉C），-32（C〉A(chǔ)），CapM（-AAAC），IntM（T〉G），14/15M（+G），17M（A〉T），βEM（G〉A(chǔ)），27/28M（+C），31M（-C），IVS-I-1M（G〉T），IVS-I-5M（G〉C），41/42M（-TTCT），43M（G〉T），71/72M（+A），IVS-II-654M（C〉T）。PCR反應(yīng)條件見以往的報(bào)道［5］，所有實(shí)驗(yàn)流程嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

1.2.4 汕尾和揭陽α/β地貧的分子診斷

采用廣東凱普生物的地貧基因檢測試劑盒檢測 3種缺失型 α地貧（--SEA、-α3.7、-α4.2）、3 種突變型α地貧（αCSα、αQSα、αWSα）和19種中國人最常見的β地貧，分別為：-29M（A〉G），-28M（A〉G），-30M（T〉C），-32（C〉A(chǔ)），CapM（-AAAC，A〉C），IntM（T〉G），14/15M（+G），17M（A〉T），βEM（G〉A(chǔ)），27/28M（+C），31M（-C），IVS-I-1M（G〉A(chǔ)，G〉T），IVS-I-5M（G〉C），41/42M（-TTCT），43M（G〉T），71/72M（+A），IVS-II-654M（C〉T）。引物及探針見以往的報(bào)道［6］，所有實(shí)驗(yàn)流程嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 地貧基因類型分布

2 057例確診為地中海貧血的樣本中，α-地貧1 462例，β-地貧561例，各占71.07%和27.27%，另有α和β復(fù)合型地貧34例，占1.65%。檢出14種α-地貧基因突變類型，--SEA占74.62%，其次是-α3.7和-α4.2，以上3種基因型占α-地貧的90%以上。共發(fā)現(xiàn)19種β-地貧基因型，其中含雜合子12種，雙重雜合子6種，純合子僅見IVS-II-654M/IVS-II-654M。β-地貧前3位基因型依次是IVS-II-654M、41/42M、-28M，共占81.1%。常規(guī)試劑盒檢測范圍內(nèi)的14/15M、31M、IVS-I-1M、-32M和-30M未被檢出。潮汕4個(gè)地理區(qū)域地貧基因突變類型見表1。

2.2 潮汕地區(qū)地貧基因頻率分布

潮汕4個(gè)地理區(qū)域中α-地貧基因突變頻率最高為--SEA，其次是 -α3.7和-α4.2，以上 3 種基因型占α-地貧的90%以上。IVS-II-654M、41/42M、-28M，17M這4種突變位點(diǎn)為基因頻率最高的β-地貧基因型。潮汕地區(qū)地貧基因頻率分布見表2。

表1 潮汕地區(qū)地貧基因突變類型及構(gòu)成比Table 1 The genotype and composition ratio of thalassemia in Chaoshan region

表2 潮汕地區(qū)地貧基因頻率分布（%）Table 2 The gene frequency distributio of thalassemia in Chaoshan region（%）

3 討論

地中海貧血基因突變表現(xiàn)為明顯的地域性或群體特異性，不同種族人群擁有自己獨(dú)特的基因突變譜。潮汕地區(qū)為廣東省三大漢族群落之一，它東鄰福建漳州，西接惠州，南面和北面分別與南海、梅州相連。

與以往檢測結(jié)果相似［5］，--SEA是潮汕地區(qū)最主要的地貧基因型，--SEA純合突變表現(xiàn)為Hb Bart's胎兒水腫綜合征，導(dǎo)致胎兒的死亡或出生后馬上死亡，并且在母親分娩時(shí)造成大出血，危及母體［3］，因此重型α-地貧新生兒出生缺陷是本地區(qū)地貧的重要防控目標(biāo)。本次我們還在潮州地區(qū)發(fā)現(xiàn)11例重型β-地貧樣本，共檢出7種基因型組合形式，患者均表現(xiàn)為小細(xì)胞中、重度貧血，其中組合類型β0/β0（41-41M/17M）的患者比β+/β（+IVS-II-654M/-28M、IVS-II-654M/IVS-II-654M）和β0/β（+41-41M/IVS-II-654M、41-41M/-28M、IVS-II-654M/17M）患者貧血癥狀更重。重型β-地貧患者目前只能依賴長期輸血維持生命，只有少數(shù)病人有機(jī)會(huì)接受骨髓移植，此類患者給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)，因此對(duì)孕產(chǎn)婦的產(chǎn)前地貧篩查是防止重型地貧嬰兒出生的最重要的預(yù)防措施。

本研究的數(shù)據(jù)也顯示了潮汕地區(qū)與我國南方其他地區(qū)的人群有著一樣的地貧突變組合，但基因突變位點(diǎn)的頻率各不相同。潮汕地區(qū)α-地貧以--SEA最為常見，海南卻以-α3.7所占比例最多［7］。β-地貧方面，潮汕地區(qū)最為常見的基因類型是IVS-II-654M，其次為41/42M。海南省則以41/42M 為首位，-28M 次之［7］，廣西 β-地貧按頻率高低依次是41/42M、17M、IVS-II-654M，惠州地區(qū)頻率最高是41/42M，而后是IVS-II-654M［8-9］。據(jù)歷史記載，中原漢人從西晉末年開始，歷經(jīng)數(shù)次大規(guī)模南遷，而后定居于贛、閩、粵、瓊、臺(tái)諸省。人群的交融同化，帶來生物學(xué)遺傳變異，因而這些地區(qū)的地貧基因型存在一定的相似性，但又有各自的特點(diǎn)。

我們知道，β-地貧基因的突變可以作為人群遷移的遺傳標(biāo)記，從而揭示人群之間的親緣關(guān)系［10-11］。以往的研究指出，我國南方地區(qū)β-地貧基因突變以41/42M發(fā)生頻率最高［12］，海南黎族人中β-地貧基因突變幾乎全為41/42M［13-14］，在廣西地區(qū)，41/42M占42.47%［8］。我們發(fā)現(xiàn)，潮汕與福建、廣東梅州和臺(tái)灣地區(qū)最常見的β-地貧突變基因均為 IVS-II-654M［10-12］，與之前 Lin 等［6］報(bào)道的IVS-II-654M發(fā)生率高于CD41/42M這一現(xiàn)象僅在客家人居住區(qū)及其周邊潮汕地區(qū)的發(fā)現(xiàn)一致，這也說明地貧基因突變類型與人群分布密切相關(guān)。

基于我們的研究數(shù)據(jù)，潮汕地區(qū)地貧的基因類型非常豐富，尤其是潮州的地貧突變組合多樣化，相比之下，汕頭的基因類型較為簡單，可能與我們?cè)谠摰貐^(qū)收集的樣本量較少有關(guān)。

地貧的預(yù)防控制是南方十省醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)的重點(diǎn)工作，隨著經(jīng)濟(jì)、交通高度發(fā)達(dá)，南北人群交流日益頻繁，加上地理、氣候等影響因素的共同作用，地貧的基因情況變得更為復(fù)雜，開展基因診斷和研究具有重要意義。本研究的分析數(shù)據(jù)，可為本地區(qū)地貧檢測和遺傳咨詢提供參考資料。

參考文獻(xiàn)

［1］Muncie HL Jr，Campbell J.Alpha and beta thalassemia［J］.Am Fam Physician，2009，80（4）：339-344.

［2］Weatherall DJ，Clegg JB.Inherited haemoglobin disorders：an increasing global health problem［J］.Bull World Health Organ，2001，79（80）：704-712.

［3］徐湘民，張新華，陳荔麗.地中海貧血預(yù)防控制操作指南［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2011：20.

［4］盧建沛，溫怡仙，鄭頤，等.汕頭市戶籍人群α和β地中海貧血的分子流行病學(xué)調(diào)查［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2008，8（2）：139-141.

［5］林芬，林春萍，翁妙珊，等.潮州地區(qū)人群血紅蛋白病基因型分布調(diào)查［J］.分子診斷與治療雜志，2012，4（2）：107-110.

［6］Lin M，Zhu JJ，Wang Q，et al.Development and evaluation of a reverse dot blot assay for the simultaneous detection of common alpha and beta thalassemia in Chinese［J］.Blood Cells Mol Dis，2012，48（2）：86-90.

［7］陳運(yùn)春，王海波，吳智明，等.海南省1620例地中海貧血基因突變檢測分析［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2014（2）：18-19.

［8］Xiong F，Sun M，Zhang X，et al.Molecular epidemiological survey of haemoglobinopathies in the Guangxi Zhuang Autonomous Region of southern China［J］.Clin Genet，2010，78（2）：139-148.

［9］劉宇鵬，李雪蓮，劉瑞玉.惠州地區(qū)5500例珠蛋白生成障礙性貧血的基因檢測分析［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2016，45（19）：2635-2637.

［10］Giambona A，Vinciguerra M，Cannata M，et al.The genetic heterogeneity of β-globin gene defects in Sicily reflects the historic population migrations of the island［J］.Blood Cells Mol Dis，2011，46（4）：282-287.

［11］Das SK，Talukder GA review on the origin and spread of deleterious mutants of the beta-globin gene in Indian populations［J］.Homo，2001，52（2）：93-109.

［12］Lin M，Wen YF，Wu JR，et al.Hemoglobinopathy：Molecular epidemiological characteristics and health effects on Hakka people in the Meizhou region，southern China［J］.PLoS One，2013，8（2）：e55024.

［13］周代鋒，王政，王小英，等.海南省漢、黎族人群中6種β-地中海貧血基因突變的研究［J］.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，13（1）：5-7.

［14］周代鋒，蔡望偉，蔡蘭潔，等.海南省黎族人4種β地中海貧血基因突變的研究［J］.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，7（1）：4-7.

［15］徐兩蒲，黃海龍，王燕，等.福建省籍各地市人群地中海貧血的分子流行病學(xué)研究［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2013，30（4）：403-406.

［16］Liu SC，Peng CT，Lin TH，et al.Molecular lesion frequency of hemoglobin gene disorders in Taiwan ［J］.Hemoglobin，2011，35（3）：228-236.

The analysis of gene spectrum of thalassemia in Chaoshan area，Guangdong Province

LIN Fen，YANG Liye ，XING Shaoyi，ZHANG Lin
（Central Laboratory，Chaozhou Central Hospital Affiliated to Southern Medical University，Chaozhou，Guangdong，China，521021）

Objective To investigate the type of gene mutation of thalassemia and constituent ratio in the Chaoshan region,and provide the theoretical basis for gene diagnosis of thalassemia. Methods Thalassemia genotypes of Chaoshan area(including Shantou,Chaozhou,Jieyang,Shanwei)were identified by Gap-PCR，reverse dot blot(RDB),PCR and flow-through hybridization. Results Among the 2 057 samples which were confirmed for thalassemia,14 types of α-thalassemia(α-thal)alleles and 19 types of β-thalassemia(β -thal)alleles were identified.Moreover,13 kinds of compound α -thal and β -thal were found.The most common α -thal was--SEAand the most common β -thalassemia was IVS-Ⅱ -654M,followed by 41/42M.Conclusion The gene types for thalassemia were diversely distributed in the Chaoshan region.The results would provide reference data for diagnosis and research of thalassemia in this area.

Thalassemia;genetype;Chaoshan region

廣東省“揚(yáng)帆計(jì)劃”人才培養(yǎng)項(xiàng)目資助

南方醫(yī)科大學(xué)附屬潮州中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東，潮州521021

楊立業(yè)，E-mail：yangleeyee@sina.com