謝煜楠 楊發(fā)達 黃廣強 黃勇

佛山市南海區(qū)地中海貧血基因類型分析

謝煜楠 楊發(fā)達 黃廣強 黃勇

目的 通過調(diào)查佛山市南海區(qū)地中海貧血基因的基因類型和構(gòu)成比，了解本地區(qū)的地中海貧血基因型的分布，為防控本地區(qū)重型地貧的出現(xiàn)提供依據(jù)。方法采用gap-PCR法檢測--SEA/αα，-α3.7/αα，-α4.2/αα 3種常見缺失型α地貧；采用反向斑點雜交法，可以檢測αQSα，αCSα，αWSα 3種常見突變型α地貧；采用反向點雜交法檢測 β-地貧常見的17種點突變，包括-29、-28、17、βE、41-42、43、71-72、654、Int、14-15、27/28、Ⅰ-1、Ⅰ-5、31、-30、CAP、-32。結(jié)果檢測 α-地中海貧血缺失型1 359例標本，檢出陽性標本490例，陽性率為36.06%（490/1359）。主要缺失類型是--SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα；進行α-地中海貧血突變型檢測的有1 210例，陽性率為2.8%（35/1 210）。進行β-地中海貧血突變型檢測的有1 073例，陽性率為24.98%（268/1 073），主要類型是CD41-42、IVS-Ⅱ-654、CD17、-28；共檢出41例復合型地貧，其中α缺失合并α突變的有4例，α-地貧合并β-地貧有37例。結(jié)論本研究為佛山市南海區(qū)的遺傳咨詢和制定該地區(qū)人群篩查的地貧預防計劃提供了有價值的基礎資料。

地中海貧血；基因型；構(gòu)成比

地中海貧血（以下簡稱地貧）又被稱為海洋性貧血或珠蛋白生成障礙性貧血，是一組嚴重威脅人類健康的致死，致殘的遺傳性血液病，是世界上最常見及發(fā)病率最高的單基因遺傳病［1］。我國南方地區(qū)各地報道的地中海貧血基因缺陷率為2.5%～20%，而廣東及廣西兩省地中海貧血基因缺陷發(fā)生率高達 15.20%［2］及 21.09%［3］，兩省地中海貧血的病例數(shù)占全國總數(shù)的2/5以上，因此，地中海貧血已經(jīng)成為廣東等高發(fā)地區(qū)社會性公共衛(wèi)生問題［4］。目前本病尚無有效治療方法，攜帶者檢查及產(chǎn)前基因診斷是唯一防止新的患兒出生，提高人口素質(zhì)的有效措施。本文通過回顧2015年在我院進行的地中海貧血基因檢測資料，探討南海地區(qū)各種地中海貧血基因突變的類型及構(gòu)成比，對于貫徹優(yōu)生優(yōu)育，提高人口素質(zhì)具有重大意義。

1 資料與方法

1.1 標本來源

選取2015年1月～2015年12月來我院進行地中海貧血基因檢查的患者（包括婚檢、產(chǎn)檢、體檢人群）。其中婚檢和產(chǎn)檢夫婦單方或（和）雙方中有地貧篩查陽性。平均紅細胞體積（mean corpuscular volum，MCV）〈82 fL或（和）平均紅細胞血紅蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）〈27 pg。

1.2 標本的采集與處理

采集待檢者的靜脈血標本2 mL于EDTA-K2真空抗凝采血管中，充分搖勻抗凝。如當天檢驗則按試劑盒說明書進行DNA提取的前處理，如不能當日檢驗則放置4℃冰箱中保存，保存期限為7 d。

1.3 檢測試劑來源及方法學

我室使用的是亞能生物技術（深圳）有限公司提供的全套地中海貧血基因檢測試劑盒，包括以下檢測內(nèi)容。

α-地中海貧血缺失型檢測試劑盒，采用gap-PCR法，可檢測--SEA/αα，-α3.7/αα，-α4.2/αα 3種常見缺失型類型。α-地中海貧血突變型檢測試劑盒，采用反向斑點雜交法，可以檢測αCSα，αQSα，αWSα 3種常見突變型。β-地中海貧血突變型檢測試劑盒，采用反向點雜交法，可以檢測β-地貧常見的17種點突變，包括-29、-28、17、βE、41-42、43、71-72、654、Int、14-15、27/28、Ⅰ-1、Ⅰ-5、31、-30、CAP、-32。

1.4 檢測方法

按試劑盒提供的試劑使用說明書進行操作。

1.5 檢測結(jié)果的判斷

1.5.1 α-地中海貧血缺失型檢測結(jié)果判斷

①正常：檢測樣品只有一條1 826 bp的正常條帶。②缺失雜合子：檢測樣品有2個條帶，若其一為1 826 bp的正常條帶，其二為某一缺失型的條帶，則結(jié)果為此相應缺失型的雜合子；若無正常條帶，結(jié)果為這種缺失型的雙重雜合子。③缺失合純子：檢測樣品只有一條缺失型條帶，無正常條帶，結(jié)果為此相應缺失型的純雜合子。

1.5.2 α-地中海貧血突變型檢測結(jié)果判斷

膜條設3個正常對照點（QSN、CSN、WSN），根據(jù)膜條上藍色斑點顯現(xiàn)的位置，讀取相應位置上標注的基因型信息。

1.5.3 β-地中海貧血突變型檢測結(jié)果判斷

2.2 患者甲狀腺結(jié)節(jié)消融區(qū)液化性壞死發(fā)生時間與臨床表現(xiàn) 11 枚甲狀腺結(jié)節(jié)消融區(qū)液化性壞死發(fā)生于術后 14～28 d，4 枚發(fā)生于術后 29～35 d，3 枚發(fā)生于術后第 36 天。18 枚甲狀腺結(jié)節(jié)消融區(qū)液化性壞死的首發(fā)癥狀均為消融區(qū)相應頸部體表皮膚紅腫變硬，并非消融針穿刺點紅腫（圖1A），腫脹多繼續(xù)加重，局部隆起，最后紅腫范圍擴大直至覆蓋穿刺點，其中 6例患者頸部皮膚破潰后有黃白色黏稠液體從原皮膚穿刺點流出（圖1B）；最嚴重者可形成頸部腫塊狀隆起，并可見皮膚多處破潰（圖1C）。18例患者均無發(fā)熱等全身癥狀，血常規(guī)示白細胞計數(shù)及比例均在正常范圍。

膜條設7個正常對照點（41-42N、654N、-28N、71-72N、17N、βEN、31N），根據(jù)膜條上藍色斑點顯現(xiàn)的位置，讀取相應位置上標注的基因型信息。

1.5.4 α-地貧-β-地貧復合型檢測結(jié)果判斷

同時檢出有α-缺失型/或α-突變型與β-地中海貧血的患者判斷為復合型地貧。

2 結(jié)果

2.1 α-缺失型地貧、α-突變型地貧和β-突變型地貧的檢出結(jié)果

進行α-地貧缺失型檢測的有1 359例，進行α-地貧突變型檢測的有1 210例，進行β-地貧突變型檢測的有1 073例，其各型地貧檢出的結(jié)果見表1。

2.2 缺失型α-地貧基因型檢出情況

對490例α-缺失型地貧進行了--SEA/αα，-α3.7/αα，-α4.2/αα，HKαα 4種基因型檢測，檢測結(jié)果見表2。

2.3 突變型α-地貧基因型檢出情況

在35例確診為α-非缺失型地貧中，進行了αCSα，αQSα，αWSα 3種常見的突變基因型檢測，其結(jié)果見表3。

2.4 β-地貧基因型檢測結(jié)果

在268例確診為β-地貧標本中，進行了β-地貧常見的17種點突變檢測，共檢出11種基因型，其中β突變合并α缺失/突變的有37例。其檢出結(jié)果見表4。

3 討論

地中海貧血是由于珠蛋白基因發(fā)生缺陷，致使珠蛋白鏈合成減少或缺如，使形成血紅蛋白的α-鏈/非α-鏈比例失衡，而導致的一組遺傳性溶血性疾?。?］。根據(jù)珠蛋白肽鏈合成受到抑制的類型，地中海貧血可以分為 α-、β-、δβ-和 δ-型地貧等類型，其中α-和β-地貧較為常見。

表1 α-缺失型地貧，α-突變型地貧，β-突變型地貧的檢出結(jié)果Table 1 The detection of α-thalassemia，α-thalassemia non-missing，β-thalassemia

表2 490例α-缺失型地貧基因型檢測結(jié)果Table 2 The detection of 490 cases of α-thalassemia gene deletion type

表3 35例α-突變型地貧基因型檢測結(jié)果Table 3 The detection of 35 cases of α-thalassemia non-missing gene deletion type

α地貧是由于α珠蛋白基因突變引起的，它可分為缺失型和非缺失型2種類型，我國人群中最常見的3種缺失型α-地中海貧血，分別是--SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα，最常見的 3 種突變型 α-地貧分別是αCSα、αQSα、αWSα。本次檢出α-地貧525例（包括缺失490例和突變35例）。南海地區(qū)人群中最常見的α 缺失類型是--SEA/αα（67.96%），其次為-α3.7/αα（17.14%）和-α4.2/αα（9.18%），前3種占的比例為94.28%，與既往有關佛山地區(qū)的報道相似［6-7］。最常見的 α 突變類型是 αQSα/αα（34.29%），αWSα/αα（28.57%），αCSα/αα（34.29%），3種突變頻率比較接近，這與陳淑芬等［8］的報道有點出入，可能與檢測例數(shù)還不夠多有關。另外我們發(fā)現(xiàn)一例攜帶有HKαα基因的樣本，豐富了南海區(qū)的臨床材料。HKαα基因是-α3.7和αααanti4.2不等位交換形成，基因型 HKαα/αα 易被診斷為-α3.7/αα［9］，判斷時應加以區(qū)別。

表4 268例β-突變型地貧基因檢測結(jié)果Table 4 The detection of 268 cases of β-thalassemia gene deletion type

β地貧是由β珠蛋白基因突變引起，目前發(fā)現(xiàn)的β地貧基因突變超過200種，在中國已報道有48種，其中中國南方報道有46種［5］。本次研究共發(fā)現(xiàn)β基因型11種，最常見的β突變類型是β41-42/βN（44.40%），β654/βN（19.03%），β17/βN（12.69%），β-28/βN（11.19%），南海地區(qū)前4種β突變占總例數(shù)的87.31%，廣東省和省內(nèi)的研究資料數(shù)據(jù)［9-12］接近，但后2個突變類型的構(gòu)成比又有些差別；與羅娟莉［13］的福建省 β地中海貧血主要類型為β654/βN（41.13%）、β41-42/βN（29.00%）、β17/βN（13.42%）和劉富華［3］的廣西地區(qū)β地中海貧血主要類型β41-42/βN（46.89%）、β17/βN（20.20%）、β654/βN（14.97%）有所不同。研究表明，南海區(qū)的β地中海貧血的突變類型與廣東省內(nèi)的相符，但同時又與其他地區(qū)有著一定的區(qū)域性差別，這符合了它具有明顯的地域性和異質(zhì)性的特點［1］。另外，發(fā)現(xiàn)一例罕見型的β地中海貧血基因突變（CD17），豐富了臨床研究資料。

本次研究沒把MCV作為全部受檢人群的初篩指標，原因是MCV雖然對地貧初篩的靈敏度較高，但對-α3.7/αα、-α4.2/αα基因型存在一部分漏診，對靜止型α/輕型β地貧漏診極大部分［14］，影響了地貧的檢出率。何云英等［15］在佛山地區(qū)1 514例地中海貧血基因型分析中報道α地貧的漏診率達3.04%，其中以3.7型、4.2型、WS型3種類型最易漏診。潘干華等［16］在1 392例血液學篩查指標陰性人群中檢出地中海貧血基因攜帶者漏診率為5.39%，且均為靜止型α地中海貧血。

佛山是地中海貧血的高發(fā)地區(qū)之一，佛山市政府從2007年開始，對佛山市戶籍人員實行免費婚前地貧篩查和產(chǎn)前地貧篩查，南海區(qū)從2016年1月開始，對于孕前優(yōu)生的血常規(guī)檢查出MCV〈82 fL和（或）MCH〈27 pg的人員進行免費的地中海貧血基因診斷，對于夫婦雙方基因診斷確診為都攜帶有α地貧或都攜帶有β地貧的孕婦進行抽取羊水或臍血進行產(chǎn)前基因診斷。我院作為南海地中海貧血篩查中心，承擔了大部分的地貧基因檢測任務，可以大大地減少重型地貧患兒的出生，有效地提高出生人口素質(zhì)［6］。以往對地中海貧血基因型研究的文獻大多都只做α-缺失和β-突變，本研究對α-突變也做了統(tǒng)計，數(shù)據(jù)更全面，本研究通過大量的臨床數(shù)據(jù)闡明了南海區(qū)的地貧基因類型和頻率，結(jié)合本地區(qū)基因型分布特點，制訂符合當?shù)氐牡刎毞揽夭呗院图夹g流程，對于本地區(qū)地中海貧血的遺傳咨詢，攜帶者篩查，優(yōu)化產(chǎn)前診斷，提高人口素質(zhì)有一定的參考價值。

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Analysis on genotypes with thalassemia in Nanhai of Foshan

XIE Yunan ，YANG Fada，HUANG Guangqiang，HUANG Yong
(Department of Clinical Laboratory，Nanhai District Maternal and Child Health Hospital of Foshan City，Guangdong,China,528200)

Objective The study aimed to investigate the genotypic distribution of thalassemia by examining the genotype and composition ratio of the thalassemia gene in the Nanhai district of Foshan city,providing a basis for prevention and control of the emergence of severe thalassemia in the region. Methods gap-PCR method was utilized to detect--SEA/αα,-α3.7/αα,-α4.2/αα 3 common gene deletions in α gene mutations.Reverse dot blot techniques were applied to detect αQSα,αCSα,αWSα 3 common mutation sites in non-missing type α -thalassaemia.The reverse dot blot method was applied to detect 17 common mutation sites in β -thalassaemia,including-29,-28,17,βE,41-42,43,71-72,654,Int,14-15,27/28,Ⅰ-1,Ⅰ-5,31,-30,CAP,and-32. Results 1 359 persons with α-thalassaemia were examined,and the positive rate was 36.0%(490/1 359).The main missing types were-SEA/αα,-α3.7/αα,and-α4.2/αα.1 210 persons with α-thalassaemia nonmissing type were examined,with a corresponding positive rate of 2.8%(35/1 210).The main types were αCSα/αα,αQSα/αα,and αWSα/αα.1 073 persons with β-thalassaemia mutants were examined.The positive rate was 24.98%(268/1 073)and the main types were CD41-42,IVS-Ⅱ-654,CD17,and-28.41 cases of complex gene deletion type were detected,including 4 cases of α deletion combined α mutation and 37 subjects with α -thalassaemia combined β-thalassaemia. Conclusion This study provides valuable basic data for genetic counseling in the Nanhai district of Foshan and to formulate programs for population-based screening for thalassemia prevention.

Thalassemia;Genotype;Composition ratio

佛山市醫(yī)學類科技攻關項目（2015AB000532）

佛山市南海區(qū)婦幼保健院檢驗科，廣東，佛山528200

謝煜楠，E-mail：xynan718@163.com