袁曉琴, 劉夢(mèng)茜, 李春燕, 陳仕怡, 許麗惠, 周五朵, 吳異健, 王全溪

(福建農(nóng)林大學(xué)福建省獸醫(yī)中藥與動(dòng)物保健重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

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雞PERK的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備

袁曉琴, 劉夢(mèng)茜, 李春燕, 陳仕怡, 許麗惠, 周五朵, 吳異健, 王全溪

(福建農(nóng)林大學(xué)福建省獸醫(yī)中藥與動(dòng)物保健重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

根據(jù)雞的蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)基因序列進(jìn)行抗原肽分析，選擇含大片段抗原表位區(qū)約1 500 bp的一段基因(15～1 515 bp)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，并構(gòu)建pET-32a(+)-PERK重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中.優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，純化重組蛋白后免疫兔并制備多克隆抗體.PCR鑒定、酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果表明，pET-32a(+)-PERK重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果表明，重組蛋白在1.0 mmol·L-1IPTG、25 ℃下誘導(dǎo)9 h時(shí)的表達(dá)量最大.蛋白純化結(jié)果表明，100 mmol·L-1咪唑洗脫液可較好地洗脫重組蛋白，獲得較多的純化蛋白.免疫結(jié)束后，抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果表明，制備的多克隆抗體效價(jià)達(dá)1∶32 000，可以與重組蛋白特異結(jié)合.

雞蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK); 原核表達(dá); 多克隆抗體

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是由細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜組成的一些片狀的囊腔和管狀的腔，這些管腔相互連接形成了密閉的管道.機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)和脂肪的合成主要是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行的，除此之外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還可以進(jìn)行蛋白質(zhì)的修飾、折疊以及鈣離子的貯存等.正常情況下，蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase, PERK)主要通過(guò)其管腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白Bip蛋白相結(jié)合，結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定[1].PERK 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)I型跨膜蛋白中的一種，具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的活性，其結(jié)構(gòu)包括信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，一般位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的是N末端，而C末端則位于胞質(zhì)中[2].多種因素(如缺血再灌注損傷、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣代謝紊亂、卵磷脂合成障礙等)都可能引起機(jī)體發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)可引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)[3-5].簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白發(fā)生錯(cuò)誤折疊與未折疊從而致使蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔內(nèi)大量堆積，由此發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激.

當(dāng)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，PERK可以先通過(guò)自身磷酸化從而使真核翻譯起始因子2α(eukaryoticinitiation factor 2α, eIF2α)上第51位的絲氨酸也發(fā)生磷酸化，當(dāng)eIF2α磷酸化后，會(huì)抑制翻譯起始復(fù)合物中二磷酸鳥(niǎo)苷與三磷酸鳥(niǎo)苷之間的相互交換，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)的翻譯和合成，導(dǎo)致細(xì)胞周期的停滯[6-7].大多發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，PERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用會(huì)大于損傷作用，但假如應(yīng)激一直持續(xù)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會(huì)經(jīng)PERK途徑上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白的表達(dá)水平，并促進(jìn)其活化.而CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白可以下調(diào)Bcl2等抗凋亡基因，導(dǎo)致活性氧含量增加，從而使線粒體膜損傷、細(xì)胞色素C釋放，最終細(xì)胞發(fā)生凋亡[8-9].Zhu et al[10]研究顯示，甘草酸可以通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK-eIF2α途徑誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯在G1期，表明PERK/elF2α途徑是未折疊蛋白反應(yīng)信號(hào)的通路之一，無(wú)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，PERK與GRP78/Bip結(jié)合處于無(wú)活性狀態(tài)；當(dāng)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，PERK與分子伴侶Bip分離而處于活化狀態(tài)，誘導(dǎo)其下游elF2α磷酸化，終止細(xì)胞內(nèi)絕大部分蛋白質(zhì)的合成，調(diào)控細(xì)胞的細(xì)胞周期[11-12].

可見(jiàn)，PERK在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用.雖然國(guó)內(nèi)外關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的報(bào)道居多，但均未報(bào)道禽病也可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)因未折疊蛋白的堆積而發(fā)生應(yīng)激.因此，為進(jìn)一步研究雞PERK的生物學(xué)功能，本試驗(yàn)對(duì)雞的PERK蛋白進(jìn)行體外原核表達(dá)和多克隆抗體的制備，旨在為研究禽類病毒與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

DH5α和E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;pET-32a(+)原核表達(dá)載體購(gòu)自Promega北京生物技術(shù)有限公司;健康新西蘭黃兔由福建農(nóng)林大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)業(yè)中心提供.

主要試劑有T4連接酶(美國(guó)Promega公司),EcoRⅠ、SalⅠ快速限制性內(nèi)切酶(大連寶生生物技術(shù)公司)和異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(博士德生物技術(shù)有限公司)等.

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

參照美國(guó)生物技術(shù)信息中心(NCBI)中雞的PERK基因全長(zhǎng)序列(登錄號(hào)：XM_420868)，利用DNAMAN軟件選擇一段大小約為1 500 bp的基因(15～1 515 bp)，運(yùn)用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物[13].

上游引物(EcoRⅠ):ATGAATTCACGGTTCTCTTCTTGTTGGGA；下游引物(SalⅠ):CCGTCGACATGGTGCCAACGATTTCTTTC(劃線處為酶切位點(diǎn)).引物送往上海生物工程技術(shù)有限公司合成.

1.3PERK基因的擴(kuò)增

將從細(xì)胞中提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，待PCR擴(kuò)增結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，純化回收PCR產(chǎn)物.

1.4 pET-32a(+)-PERK重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將pET-32a(+)原核表達(dá)載體與純化后的目的片段分別用EcoRⅠ和SalⅠ進(jìn)行酶切反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后，高溫滅活30 min，在目的片段與載體的摩爾比例為7∶1的條件下置4 ℃連接過(guò)夜.

1.5 pET-32a(+)-PERK重組質(zhì)粒的鑒定及其表達(dá)鑒定

將連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR鑒定、酶切鑒定和測(cè)序.將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21中，挑取單克隆菌落接種于液體培養(yǎng)基中，并以其為模版，分別以目的基因上、下游引物和T7上、下游引物進(jìn)行PCR鑒定.

1.6 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)體系的優(yōu)化

將保存的菌種以1∶100的比例接種于LB培養(yǎng)基中，于搖床(37 ℃)中培養(yǎng)8 h，加入終濃度為1.0 mmol·L-1的IPTG，分別培養(yǎng)0、3、5、7、9和11 h，確定最佳的誘導(dǎo)時(shí)間.

在菌液IPTG終濃度為1.0 mmol·L-1，且誘導(dǎo)時(shí)間相同的條件下，分別在4、25、37和45 ℃下培養(yǎng)，確定最佳的誘導(dǎo)溫度.

菌液在最佳的誘導(dǎo)溫度和培養(yǎng)時(shí)間下，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol·L-1IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，確定最佳的誘導(dǎo)濃度.

1.7 重組蛋白的純化及鑒定

依據(jù)ProteinIsoTM Ni-NTA Resin操作方法[14]進(jìn)行蛋白分離純化，分別用20、 40、60、80、100、120和140 mmol·L-1咪唑洗脫液洗脫，確定咪唑的最佳濃度.純化后的蛋白用BCA蛋白濃度測(cè)量試劑盒測(cè)定，并將純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析鑒定.

1.8 兔抗PERK多克隆抗體的制備鑒定與其效價(jià)測(cè)定

以重組蛋白為抗原免疫新西蘭黃兔.黃兔在免疫前先采血1 mL，將其血清作為陰性對(duì)照.將1 mg 重組蛋白與1 mL不完全弗氏佐劑混合后在黃兔的皮下組織進(jìn)行多點(diǎn)注射，14 d后進(jìn)行第2次免疫(方法與第1次的相同)，免疫3 d后采血，取血清進(jìn)行蛋白免疫印記鑒定，待鑒定正確后隔3 d進(jìn)行第3次免疫.第3次免疫以1 mg 重組蛋白溶液與1 mL完全弗氏佐劑混合注射，7 d后于心臟采血，取血清進(jìn)行蛋白免疫印記鑒定.將純化后的重組蛋白(20 mg·mL-1)作為抗原包被于96孔酶標(biāo)板中.將采聚的血清以1∶1 000的比例為底，按2n倍比稀釋7次后分別作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體為二抗，應(yīng)用間接ELISA法測(cè)定血清的抗體效價(jià).

2 結(jié)果與分析

2.1PERK基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

M:DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:PERK基因擴(kuò)增產(chǎn)物.圖1 PERK基因的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PERK gene amplified by PCR

PCR擴(kuò)增后獲得大小約為1 500 bp的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1).

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

將pET-32a(+)-PERK重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定.結(jié)果(圖2A)表明，該重組質(zhì)粒為陽(yáng)性菌群，可擴(kuò)增出一條大小約為1 500 bp的特異性條帶，用載體通用引物T7可擴(kuò)增一條大于目的基因的條帶(約為2 250 bp)，進(jìn)而提取其質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定.單酶切的產(chǎn)物可見(jiàn)一條大小約為7 400 bp的線性質(zhì)粒條帶，雙酶切的產(chǎn)物可見(jiàn)目的基因大小約為1 500 bp的條帶及空質(zhì)粒大小約為5 900 bp的條帶，與預(yù)期的大小相符(圖2B).

A：陽(yáng)性克隆菌重組質(zhì)粒的PCR鑒定(M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:PERK；2:T7引物；3:PERK上游引物+T7下游引物；4:PERK下游引物+T7上游引物)；B：陽(yáng)性克隆菌重組質(zhì)粒的酶切鑒定(M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：重組質(zhì)粒；2：EcoRⅠ和SalⅠ限制酶雙酶切；3：SalⅠ限制酶單酶切.

2.3 pET-32a(+)-PERK重組質(zhì)粒的遺傳進(jìn)化樹(shù)

pET-32a(+)-PERK重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果確定重組質(zhì)粒正確，圖3表明，該序列與雞PERK基因的同源性較高.

2.4 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化結(jié)果

重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化結(jié)果表明，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的變化，重組蛋白表達(dá)量也在不斷變化，誘導(dǎo)9 h時(shí)的蛋白表達(dá)量最高，條帶大小約為78 ku(圖4A).

在誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG終濃度相同的條件下，不同溫度下重組蛋白的表達(dá)量不同，誘導(dǎo)溫度為25 ℃時(shí)的表達(dá)量最大(圖4B).

在誘導(dǎo)時(shí)間和溫度相同的條件下，用不同終濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果(圖4C)顯示，IPTG最佳的終濃度為1 mmol·L-1.

圖3 pET-32a(+)-PERK重組質(zhì)粒的遺傳進(jìn)化樹(shù)

A：誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化(M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：空質(zhì)粒；2～7：誘導(dǎo)0、3、5、7、9和11 h時(shí)的重組蛋白);B：誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化(M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1：空質(zhì)粒;2：重組蛋白未誘導(dǎo)；3～6：4、25、37和45 ℃下誘導(dǎo)的重組蛋白);C：誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化(M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1：空質(zhì)粒；2～7：0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)下的重組蛋白).

2.5 重組蛋白的純化結(jié)果

M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:純化前的蛋白；2～8:20、40、60、80、100、120和140 mmol·L-1的咪唑洗脫液.圖5 重組蛋白純化的SDS-PAGE電泳圖Fig.5 Electrophoregram of recombinant protein purified by SDS-PAGE

用不同濃度的咪唑洗脫液洗脫重組蛋白，結(jié)果(圖5)顯示，咪唑濃度為100 mmol·L-1時(shí)洗脫蛋白的量較多，且雜蛋白較少.

2.6 重組蛋白的蛋白免疫印記鑒定結(jié)果

以His·Tag標(biāo)簽蛋白的抗體作為一抗，pET-32a空載體菌組為對(duì)照，分別對(duì)獲得的重組蛋白進(jìn)行蛋白免疫印記鑒定.結(jié)果(圖6)顯示，該重組蛋白為所預(yù)期的蛋白.

A：PERK；B:標(biāo)簽蛋白.

2.7 PERK多克隆抗體的蛋白免疫印記鑒定結(jié)果

圖7 重組蛋白的蛋白免疫印記鑒定電泳圖Fig.7 Electrophoregram of recombinant protein identified by Western blot

以PERK陽(yáng)性血清作為一抗，設(shè)pET-32a空載體菌組作為對(duì)照，分別對(duì)獲得的重組蛋白進(jìn)行蛋白免疫印記鑒定.結(jié)果(圖7)顯示，該多克隆抗體為預(yù)期的抗體.

2.8 PERK多克隆抗體的效價(jià)

以20 mg·mL-1重組蛋白為抗原，將采集到的兔血清以1：1 000的比例按2n倍比稀釋7次后分別作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體為二抗，應(yīng)用間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià).結(jié)果(圖8)表明，該免疫程序制備的兔多克隆抗體效價(jià)可達(dá)到1∶32 000.

圖8 PERK多克隆抗體的效價(jià)

3 討論與小結(jié)

本試驗(yàn)選取雞PERK基因含大片段抗原表位區(qū)約1 500 bp的一段基因(15～1 515 bp)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，是由于雞PERK基因全長(zhǎng)片段高達(dá)3 000 bp，直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增無(wú)法擴(kuò)增出目的基因，只能選取其中一段的大片段抗原表位區(qū)的基因設(shè)計(jì)一段特異性的引物進(jìn)行擴(kuò)增.本試驗(yàn)對(duì)PERK基因進(jìn)行擴(kuò)增后，用EcoRⅠ和SalⅠ快速限制性內(nèi)切酶切割目的基因和原核表達(dá)質(zhì)粒，連接之后轉(zhuǎn)DH5α擴(kuò)增，再于E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，之后對(duì)重組蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化篩選，獲得理想表達(dá)量的重組蛋白.

本試驗(yàn)在誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，重組蛋白于150 r·min-1轉(zhuǎn)速搖菌比200 r·min-1更有利于重組蛋白的表達(dá)，而呂小婷等[14]在表達(dá)番鴨呼腸孤病毒 σA 蛋白時(shí)則是200 r·min-1的轉(zhuǎn)速搖菌更有利于其表達(dá).本試驗(yàn)獲得的多克隆抗體效價(jià)可達(dá)1∶32 000，這與呂小婷等[14]制備的番鴨呼腸孤病毒σA蛋白多克隆抗體效價(jià)大于 1∶32 000及武娟等[15]制備的諾如病毒衣殼蛋白多克隆抗體效價(jià)1∶10 000相比，該效價(jià)在理想范圍內(nèi).

目前關(guān)于禽類內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究以及通過(guò)PERK / eIF2α 通路使細(xì)胞周期停止的研究較少，為了研究這條通路，以尋求更多的方法治療心血管和心臟等疾病，急需PERK多克隆抗體，而市面上雞源的PERK多克隆抗體幾乎沒(méi)有，因此制備雞的PERK多克隆抗體對(duì)之后的研究尤為重要.

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(責(zé)任編輯:施曉棠)

Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of chicken PERK kinase

YUAN Xiaoqin, LIU Mengxi, LI Chunyan, CHEN Shiyi, XU Lihui,ZHOU Wuduo, WU Yijian, WANG Quanxi

(Fujian Key Laboratory of Traditional Chinese Veterinary Medicine and Animal HealthFujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Based on the antigen peptide sequence of chicken protein kinase R-like ER kinase (PERK) gene, an about 1500 bp DNA fragment encoding the major epitope domain was amplified by RT-PCR with specific primers, and then was expressed with expression vector pET 32a in BL21 cell (DE3). After expression with optimized condition of temperature, time and IPTG concentration, the purified recombinant protein was used to prepare the polyclonal antibody of PERK. Results of PCR, restriction enzyme digestion and sequencing showed that the recombinant plasmid pET-32a (+)-PERK was constructed successfully. SDS-PAGE analysis showed that the optimal expression conditions of recombinant protein were to induce at 25 ℃ with 1.0 mmol·L-1IPTG for 9 h. Protein purification result showed that 100 mmol·L-1imidazole could elute recombinant proteins effectively, resulting in higher quantity of purified protein. After immunization, the titer of the polyclonal antibody was to 1∶32 000, which could be combined with PERK.

chicken protein kinase R-like ER kinase (PERK); prokaryotic expression; polyantibody

2017-01-30

2017-04-12

國(guó)家自然科學(xué)基金——促進(jìn)海峽兩岸科技合作聯(lián)合基金資助項(xiàng)目(U1305212).

袁曉琴(1994-)，女，碩士研究生.研究方向：動(dòng)物病原與分子生物學(xué).Email:1825639283@qq.com.通訊作者王全溪(1978-)，副教授，博士.研究方向：宿主與病原互作.Email:wqx608@126.com.

S852.65

A

1671-5470(2017)04-0428-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.04.012