王許會, 郭洋洋, 全金成, 張宇宏, 陳慈相, 邱棟梁, 毛潤乾

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.廣東省生物資源應(yīng)用研究所,廣東省動物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省野生動物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510260；3.廣西特色作物研究所，廣西 桂林 541004；4.江西省贛州市果樹植保站/贛南臍橙工程技術(shù)研究中心，江西 贛州 341000)

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柑橘黃龍病碘—淀粉法快速檢測技術(shù)優(yōu)化

王許會1, 郭洋洋2, 全金成3, 張宇宏2, 陳慈相4, 邱棟梁1, 毛潤乾2

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.廣東省生物資源應(yīng)用研究所,廣東省動物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省野生動物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510260；3.廣西特色作物研究所，廣西 桂林 541004；4.江西省贛州市果樹植保站/贛南臍橙工程技術(shù)研究中心，江西 贛州 341000)

為使一種柑橘黃龍病碘—淀粉法快速檢測技術(shù)更好地應(yīng)用于大田檢測，以砂糖橘為試驗(yàn)材料，研究無需冷凍和縮短葉片脫色時(shí)間的技術(shù).結(jié)果表明，磨掉葉片正反面表面蠟質(zhì)層后，直接脫色，可以省去冷凍處理步驟，且不影響檢測結(jié)果；檢測結(jié)果與常規(guī)PCR檢出結(jié)果的一致率為92.5%；同時(shí)，葉片脫色時(shí)間縮短7.17～8.47 h.優(yōu)化后，冬季樣品葉綠素脫除所需時(shí)間均值為5.0 h，其他季節(jié)葉片脫色時(shí)間均值為3.7 h.

柑橘黃龍病; 碘—淀粉法; 快速檢測技術(shù); PCR

柑橘黃龍病(citrus huanglongbing),又稱為黃梢病、黃枯病，是由一種寄生于植株韌皮部的革蘭氏陰性細(xì)菌引發(fā)的檢疫性病害[1].感染該病后，植株會出現(xiàn)典型的斑駁葉、黃梢和“紅鼻子果”等癥狀，病情進(jìn)一步發(fā)展會導(dǎo)致根部腐爛和生長衰弱，最終整株死亡[2];同時(shí)，黃龍病可通過苗木、柑橘木虱(Diaphorinacitri)和菟絲子(Cuscutachinensis)在田間快速傳播，給柑橘產(chǎn)區(qū)造成毀滅性災(zāi)難[3-4].

目前，生產(chǎn)上通過及時(shí)清除病樹、防治柑橘木虱和推廣無毒苗等措施來控制黃龍病的擴(kuò)散，而有效實(shí)施這些防控策略的前提是該病的準(zhǔn)確檢測.在眾多黃龍病檢測技術(shù)中，指示植物鑒定、血清學(xué)檢測和顯微鏡觀察法由于檢出率低且耗時(shí)、費(fèi)力，而很少被采用；田間癥狀診斷雖準(zhǔn)確率低但簡便易行，是常用的輔助檢測方法；分子生物學(xué)檢測具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和效率高的特點(diǎn)，是當(dāng)前應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的一種檢測方法，但存在技術(shù)要求高和檢測成本昂貴等不足[5-7].此外，基于碘—淀粉反應(yīng)的黃龍病檢測技術(shù)，由于低成本、低技術(shù)要求和較高準(zhǔn)確率的特點(diǎn)而成為田間自助檢測的主要選擇.

基于碘—淀粉反應(yīng)的黃龍病檢測技術(shù)主要建立在2個(gè)條件之上：(1)感病植株淀粉代謝異常，葉片積累大量淀粉；(2)黃龍病引起植株韌皮部組織壞死和篩管堵塞[8-11].科研人員通過對少量葉樣的研磨液染色或直接觀察葉樣組織染色后的顏色變化來判斷植株是否感染黃龍病[12-15]，但這些技術(shù)因存在嚴(yán)重的局限性而很難被應(yīng)用于大田,如需要專門的研磨設(shè)備，且健康葉片經(jīng)光合作用后會有淀粉積累，研磨液染色后也會出現(xiàn)顏色變化而影響病情診斷.毛潤乾等[16]在前人研究基礎(chǔ)上，采用暗處理技術(shù)，排除葉片正常積累的過渡型淀粉和葉片中葉綠素的干擾，建立了一種新黃龍病快速檢測技術(shù).該技術(shù)提高了檢測準(zhǔn)確性，并基本實(shí)現(xiàn)了農(nóng)民自檢；但仍有一些技術(shù)問題需要改進(jìn)，如葉片脫色時(shí)冷凍處理步驟需要冰箱完成，脫色時(shí)間較長等.本研究旨在解決快速檢測中的冷凍和脫色問題，用砂紙打磨葉片表面臘質(zhì)層的方法替代剪切葉片和葉片冷凍處理，縮短檢測時(shí)間，為柑橘黃龍病的準(zhǔn)確、快速檢測提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 健康柑橘葉片，采自廣東省生物資源應(yīng)用研究所內(nèi)的砂糖橘樹(來源于清遠(yuǎn)無病苗圃)；感染黃龍病葉片，采自廣州蘿崗九龍柑橘園，葉片經(jīng)常規(guī)PCR方法確認(rèn).

1.1.2 試劑(盒) 植物基因組DNA提取試劑盒、Taq酶、dNTPs、DL2000 DNA maker、6×Loading buffer購自北京天根生化科技有限公司，脫色液和染色液為廣東省生物資源應(yīng)用研究所專利藥劑，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.1.3 儀器設(shè)備 BioMateTM 3 Series紫外/可見光分光光度計(jì)，小型臺式高速離心機(jī)(Sigma，德國)，Mastercycler Ep gradients 梯度PCR儀(Eppendorf，德國)，電熱恒溫水槽DK-8D型(上海一恒科技有限公司)，電子天平(SHIMADZU，日本)，DGX-9003鼓風(fēng)干燥箱(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，超級純水系統(tǒng)(Barnstead，美國)，高通量組織研磨儀(北京格瑞德曼儀器設(shè)備有限公司)，DDY-6C電泳儀(北京市六一儀器廠)，CN-1000凝膠成像系統(tǒng)(Vilber，法國)，DYCP-31DN水平電泳槽(北京市六一儀器廠)，霉菌培養(yǎng)箱(MJP-150)，海爾電冰柜(FCD-270SE).

1.2 方法

1.2.1 原有技術(shù)冷凍與脫色時(shí)間的測定 采集35片成熟且健康的柑橘葉，厚薄、顏色盡量一致，沿葉脈剪取長4 cm、寬1 cm的葉塊作為葉樣，以垂直主葉脈的方向?qū)⑷~樣剪為1 mm寬的細(xì)條，不剪斷主葉脈.將剪好的葉樣放入電冰柜中，溫度為-15 ℃，冷凍時(shí)間設(shè)為0、1、2、3、4、5、6 h，每個(gè)冷凍處理重復(fù)5次.將冷凍后的葉樣浸泡在盛有12.5 mL脫色液的離心管中，置于33 ℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)；從第4小時(shí)開始，每隔1 h觀察一次并拍照，直至葉片綠色完全脫去.

1.2.2 技術(shù)優(yōu)化后冷凍與脫色時(shí)間的測定 取葉樣35片，用砂紙均勻打磨葉片兩面，破壞葉片表面的蠟質(zhì)層.將打磨好的葉樣放入電冰柜中，溫度為-15 ℃，冷凍時(shí)間設(shè)為0、1、2、3、4、5、6 h，每個(gè)冷凍處理重復(fù)5次.將葉樣浸泡在盛有12.5 mL脫色液的離心管中，置于33 ℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)；每隔1 h觀察一次并拍照，直至葉片綠色完全脫去.

1.2.3 不同季節(jié)葉片脫色時(shí)間的測定 參照廣州市2011—2013年的氣候資料，選定廣州市4個(gè)季節(jié)的模擬溫度.取葉樣，用砂紙均勻打磨葉樣兩面，破壞葉片表面的蠟質(zhì)層.將打磨好的葉樣浸泡在盛有12.5 mL脫色液的離心管中，于霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)脫色，溫度按選定的廣州市4個(gè)季節(jié)模擬溫度設(shè)定，每個(gè)溫度處理重復(fù)5次；每隔1 h觀察一次并拍照，直至葉片綠色完全脫去.

1.2.4 PCR檢測 葉片DNA提取參照TIANGEN公司的植物基因組DNA提取試劑盒說明書(版本號：DP130227).利用柑橘黃龍病亞洲種16S rDNA基因序列作靶標(biāo)，參考Jagoueix et al[17]的方法設(shè)計(jì)引物OI1/OI2c(目的片段長度1 167 bp)，由華大科技(深圳)公司合成.引物序列：OI1為5′-GCGCGTATCCAATACGAGCGGCA-3′，OI2c為5′-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3′.PCR反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液2 mL，dNTP 2 mL，上、下游引物各0.5 mL，模板1 mL，Taq DNA 聚合酶0.4 mL，加超純水17.6 mL至總體積25 mL.PCR反應(yīng)條件：96 ℃變性1 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 4 min.PCR擴(kuò)增完成后取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物與2 μL Loading Buffer混合均勻，然后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并照相，如在1 167 bp處出現(xiàn)條帶，則為陽性樣品.

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 19.0和Excel 2003軟件處理數(shù)據(jù)，采用Tukey檢驗(yàn)方法分析差異顯著性.

2 結(jié)果與分析

2.1 原有技術(shù)冷凍與脫色時(shí)間

由圖1可知，冷凍0 h，樣品葉綠素脫除時(shí)間為(20.80±4.02) h，比其他處理時(shí)間長，且差異顯著(P<0.05)； 1～6 h冷凍處理組，脫色時(shí)間為11.6～13.2 h，均值為(12.17±1.26) h，各處理間差異不顯著(P>0.05).這說明葉片被剪為細(xì)條后，冷凍處理可以縮短葉綠素脫除時(shí)間；但冷凍時(shí)間的長短，并不影響葉綠素脫除時(shí)間.

圖中小寫字母不同者表示差異顯著(P<0.05)，小寫字母相同者表示差異不顯著(P>0.05，Tukey法).

2.2 優(yōu)化后的冷凍與脫色時(shí)間

由圖2可知，冷凍0 h，樣品葉綠素脫除時(shí)間為(3.80±0.84) h；冷凍1～6 h，脫色時(shí)間為3.6～3.8 h，均值為(3.74±0.89) h；7個(gè)處理之間差異不顯著(P>0.05).這說明打磨葉片表面蠟質(zhì)層后，脫色不需要冷凍處理.因此，直接用砂紙磨去葉片正反面的蠟質(zhì)層，然后放入脫色液中脫色，省略了剪切葉片和冷凍處理的環(huán)節(jié)，達(dá)到了技術(shù)優(yōu)化的目的.比較優(yōu)化前后的葉片脫色時(shí)間可知，優(yōu)化前的平均脫色時(shí)間為(12.17±1.26) h，是優(yōu)化后的3.88倍.因此，優(yōu)化后還縮短了樣品葉綠素脫除時(shí)間，使柑橘葉片脫色和黃龍病檢測變得更加簡便和快速.

圖中小寫字母相同者表示差異不顯著(P>0.05，Tukey法).

年份溫度/℃春夏秋冬201122333219201227332916201331342420均值27332818

2.3 不同季節(jié)葉片脫色時(shí)間

根據(jù)對廣州市2011—2013年氣候資料(表1)的分析，將春季和秋季的模擬溫度設(shè)為27 ℃，夏季的模擬溫度設(shè)為33 ℃，冬季的模擬溫度設(shè)為18 ℃.

在不同溫度條件下，采用優(yōu)化技術(shù)脫除柑橘葉片的葉綠素.結(jié)果表明，18、27和33 ℃時(shí)，葉片葉綠素脫除時(shí)間均值分別為(5.00±0.71)、(3.60±0.55)和(3.80±0.45) h；顯著性檢驗(yàn)顯示，18 ℃與27、33 ℃樣品葉綠素脫除時(shí)間差異顯著(P<0.05)，27 ℃與33 ℃樣品葉綠素脫除時(shí)間差異不顯著(P>0.05).因此，溫度是影響葉片脫色的因素之一，低溫季節(jié)葉綠素脫除時(shí)間相對較長.柑橘葉片葉綠素脫除時(shí)間參考值可定為4～6 h.

2.4 優(yōu)化技術(shù)檢測黃龍病效果

采用優(yōu)化后的檢測技術(shù)，對柑橘葉片進(jìn)行顯色檢測，結(jié)果見圖3.葉片Ⅰ和Ⅱ采自感染黃龍病的植株(PCR檢測確認(rèn))，葉片檢測結(jié)果大部分顯示深藍(lán)色，說明檢測的準(zhǔn)確性較高.葉片Ⅱ脫色前為深綠色，未表現(xiàn)出黃龍病癥狀(斑駁葉)，PCR確認(rèn)為黃龍病葉；顯色檢測后顏色發(fā)生變化，葉片大部分顯示深藍(lán)色，說明優(yōu)化技術(shù)的靈敏性較高.葉片Ⅲ和Ⅳ采自健康植株，PCR檢測確認(rèn)未染?。伙@色檢測后未發(fā)生顏色變化，葉片呈麥黃色.這說明優(yōu)化技術(shù)脫色均勻，脫色效果較好，能消除葉綠素干擾，且該檢測技術(shù)對于柑橘葉片是否感染黃龍病有很高的區(qū)分度.

Ⅰ、Ⅱ?yàn)楦腥军S龍病的葉片；Ⅲ、Ⅳ為健康葉片.葉片在檢測前均經(jīng)過24 h的暗處理.

2.5 優(yōu)化技術(shù)與常規(guī)PCR檢測的一致性

用優(yōu)化技術(shù)和常規(guī)PCR技術(shù)2種方法同時(shí)對67個(gè)柑橘葉片樣本的黃龍病進(jìn)行檢測：常規(guī)PCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示，陽性樣品54個(gè)，陰性13個(gè)；優(yōu)化后顯色診斷技術(shù)檢測結(jié)果顯示，陽性樣品46個(gè)，陰性23個(gè).2種檢測方法的陽性一致率為90.7%，陰性一致率為100%，總體檢測結(jié)果的一致率為92.5%.

3 討論

碘—淀粉法快速檢測技術(shù)以其便捷、廉價(jià)和較高的準(zhǔn)確度等優(yōu)勢成為實(shí)驗(yàn)室檢測之外的首選[18-19].毛潤乾等[16]建立的黃龍病檢測技術(shù)已經(jīng)以試劑盒的形式在部分柑橘產(chǎn)區(qū)得到應(yīng)用.本研究對其脫色步驟進(jìn)行優(yōu)化，既縮短了脫色時(shí)間，又省略了冷凍步驟.此外，優(yōu)化后的檢測技術(shù)，不僅消除了葉綠素和正常積累的過渡型淀粉的干擾，而且可保證葉片的完整性，提高了檢測結(jié)果的可重復(fù)性；同時(shí)，優(yōu)化后的檢測技術(shù)用砂紙打磨、破壞葉面的蠟質(zhì)層，使染色更加均勻、迅速、直觀；顯色處理還可以較準(zhǔn)確地反映異常淀粉在葉片中的積累情況.

黃龍病檢測中，如果能將田間癥狀診斷、碘—淀粉反應(yīng)檢測和分子生物學(xué)檢測相結(jié)合，就能構(gòu)成良性的互補(bǔ)關(guān)系，形成較完整的黃龍病檢測體系.基于碘—淀粉反應(yīng)的黃龍病檢測技術(shù)必須在柑橘葉片出現(xiàn)淀粉異常積累一定程度后才具有實(shí)用性，最佳的使用時(shí)期可能是葉片出現(xiàn)輕微斑駁癥狀，對此還需進(jìn)一步驗(yàn)證.在黃龍病初期，苗木的診斷仍需用分子生物學(xué)檢測方法.田間癥狀檢測可以作為輔助診斷方法，以排除因機(jī)械損傷、水浸爛根或病蟲害引起的淀粉積累而干擾碘—淀粉檢測，提高檢測的準(zhǔn)確性.總之，黃龍病葉片中淀粉的異常積累已得到廣泛的證明[9,20-24]，基于碘—淀粉反應(yīng)的黃龍病檢測技術(shù)已取得重要應(yīng)用進(jìn)展，但在準(zhǔn)確度、靈敏度和檢測時(shí)間方面還有很大的提升空間.

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(責(zé)任編輯:楊郁霞)

Optimization of iodo-starch reaction rapid test for detecting citrus huanglongbing

WANG Xuhui1, GUO Yangyang2, QUAN Jincheng3, ZHANG Yuhong2, CHEN Cixiang4,QIU Dongliang1, MAO Runqian2

(1.College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2.Guangdong Key Laboratory of Animal Conservation and Resource Utilization/Guangdong Public Laboratory of Wild Animal Conservation and Utilization, Guangdong Institute of Applied Biological Resources, Guangzhou, Guangdong 510260, China; 3.Guangxi Especial Crops Research Institute, Guilin, Guangxi 541004, China; 4.Station of Fruit Tree Protection of Ganzhou City/Gannan Engineering Research Center for Navel Orange, Ganzhou, Jiangxi 341000, China)

To improve citrus huanglongbing detection method for rapid field test, iodo-starch reaction technology was optimized in terms of frozen time and rubbing leaf epidermis. The results showed that rubbing leaf epidermis was an alternative to frozen treatment without compromising diagnosis accuracy, achieving 92.5% consistency with PCR. So that citrus leaf with rubbed epidermis can be decolorized directly. Averagely, decoloration time was reduced by 7.17-8.47 h, with about 5.0 h saved in winter and 3.7 h in other seasons.

citrus huanglongbing; iodo-starch reaction; rapid detection technology; PCR

2016-12-12

2017-03-01

廣東省黃龍病綜合防控專項(xiàng)(2014462);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2017B020202005);廣東省科學(xué)院科技發(fā)展專項(xiàng)(2017GDASCX-0107);廣西農(nóng)業(yè)科技項(xiàng)目(Z201619);福建農(nóng)林大學(xué)科技推廣項(xiàng)目(KH1501970，KN150017A).

王許會(1989-)，女，碩士研究生.研究方向：果樹生理生化與生態(tài).Email:1510344924@qq.com.通訊作者毛潤乾(1968-)，男，研究員，碩士生導(dǎo)師.研究方向：農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治.Email:maorun@gdei.gd.cn.

Q945.8

A

1671-5470(2017)04-0392-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.04.005