徐志遠(yuǎn)，楊明輝，姬鵬云，張效生，張金龍，朱士恩，阿布力孜·吾斯曼，趙 靜，劉國世*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，吉林長春 130118；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京 100193；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

黑薩?？撕投挪囱蛐迈r和冷凍胚胎移植效率的研究

徐志遠(yuǎn)1,2，楊明輝2，姬鵬云2，張效生3，張金龍3，朱士恩2，阿布力孜·吾斯曼4，趙 靜1*，劉國世2*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，吉林長春 130118；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京 100193；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

為提高優(yōu)質(zhì)肉用種用綿羊胚胎移植的效率，試驗(yàn)選取76只黑薩福克羊和27只杜泊羊作為供體，采用“CIDR+FSH+PMSG ”法進(jìn)行超數(shù)排卵處理。選取384只小尾寒羊?yàn)槭荏w，采用“CIDR+PMSG”法進(jìn)行同期發(fā)情處理，以探索供體胚胎發(fā)育階段、胚胎冷凍處理、胚胎體外停留時間以及移植給受體時移植側(cè)黃體數(shù)量等因素對胚胎移植妊娠率的影響。 結(jié)果表明：移植新鮮囊胚的妊娠率極顯著高于桑椹胚（P＜0.01）；冷凍/解凍囊胚移植妊娠率極顯著低于新鮮囊胚（P＜0.01），而冷凍/解凍桑椹胚移植妊娠率與新鮮桑椹胚無顯著差異（P＞0.05）；此外，移植桑椹胚時，移植側(cè)有1個黃體的受體妊娠率極顯著低于有2～3個黃體受體妊娠率（P＜0.01），但移植囊胚時兩者間差異不顯著（P＞0.05）。綜上可知，子宮角移植桑椹胚和囊胚時，移植新鮮囊胚、移植冷凍桑椹胚效率較高；將新鮮桑椹胚移植給移植側(cè)有2～3個黃體受體效果好于1個黃體受體。

綿羊；桑椹胚；囊胚；冷凍胚胎；受體黃體數(shù)；妊娠率

近年來黑薩福克羊和杜泊羊作為肉用種羊在我國一直廣受歡迎，養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益很大，但由于自然繁殖效率低，加之引種到國內(nèi)的時間不長，擴(kuò)繁種群有限，在我國仍然處于小群體狀態(tài)。超數(shù)排卵、人工授精、胚胎移植等技術(shù)配合應(yīng)用能夠極顯著提高良種的擴(kuò)繁效率。易金云等[1]報道，利用CIDR+FSH+PMSG遞減4 d 8針注射法對黑薩?？搜蜻M(jìn)行超數(shù)排卵獲得可用胚數(shù)高達(dá)16.8枚，對杜泊羊進(jìn)行超排獲得可用胚數(shù)達(dá)到了14.3枚。李愛朵等[2]報道，利用內(nèi)窺鏡子宮角輸精法輸精，薩?？搜蚬w受精率高達(dá)97.02%。王賽賽等[3]報道，采用子宮角沖胚法獲得的杜泊羊可用胚胎丟失少，而且術(shù)后發(fā)生粘連的可能性較小。包花拉等[4]報道，杜泊羊供體同期發(fā)情主要集中在撤栓后的12～36 h，受體小尾寒羊主要集中在撤栓后的24～48 h。然而關(guān)于這兩種肉用綿羊胚胎移植過程中的影響因素及如何獲得更高的移植妊娠率報道較少。

本試驗(yàn)在生產(chǎn)條件下，分析了黑薩?？搜?、杜泊羊作為供體時胚胎的發(fā)育階段、胚胎冷凍處理、胚胎體外停留時間以及移植給受體時移植側(cè)黃體情況等因素對受體移植后妊娠率的影響，篩選出較好的移植方案，以期為生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物 試驗(yàn)于2015年1月和5月在河北省遵化市某羊場進(jìn)行。供體綿羊?yàn)?6只黑薩?？搜蚝?7只杜泊羊，年齡2～6歲，無生殖系統(tǒng)疾病，超排處理前已有2個以上正常的發(fā)情周期。受體羊?yàn)?54只小尾寒羊，年齡1.5～4歲，無生殖系統(tǒng)疾病，膘情適中，試驗(yàn)前適當(dāng)補(bǔ)飼。

1.2 試驗(yàn)器械及試劑藥品 試驗(yàn)器械包括假陰道，集精杯，移動式保定架，輸精槍，腹腔鏡，導(dǎo)尿管，水浴鍋，實(shí)體顯微鏡，移植針，手術(shù)器械、B超儀等。試劑藥品中，促卵泡素（FSH）、促黃體素（LH）、孕馬血清促性腺激素（PMSG）來自寧波三生藥業(yè)有限公司；促排3號（LRH-A3）購自丹東市綠丹和華動物制藥有限公司；陰道栓（CIDR）為新西蘭產(chǎn)，20個/袋，孕酮含量為1.38 g/個；Holding培養(yǎng)液為新西蘭產(chǎn)，50 mL/袋；PBS（沖卵液）為新西蘭產(chǎn)；長效土霉素注射液產(chǎn)自美國輝瑞，100 mL/瓶；75%酒精、碘酒、新潔爾滅、抗生素、生理鹽水等均為國產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計 本試驗(yàn)分胚胎發(fā)育不同階段、胚胎是否經(jīng)歷冷凍保存、早發(fā)情供體與晚發(fā)情供體、胚胎移植前在體外環(huán)境下停留的不同時間與受體羊移植側(cè)卵巢不同黃體數(shù)共5組因素對胚胎移植后妊娠效果進(jìn)行比較試驗(yàn)。每組因素的試驗(yàn)都是在其他因素基本一致的條件下進(jìn)行。

1.4 供體超數(shù)排卵、人工授精、沖胚及胚胎分級供體超排參照易金云等[1]采用的CIDR+FSH（遞減4 d 7針）+PMSG（ 1針）注射法。按照方案安排，供體在發(fā)情周期的任意一天1次放入CIDR，當(dāng)天記為第0天，在此后的第10天，根據(jù)供體羊體重，開始注射相應(yīng)劑量的FSH，每隔12 h注射1次，劑量遞減，在注射FSH第7針后不久（第13天）取出CIDR，第7針之后12 h注射PMSG。供體羊在撤栓后12～48 h內(nèi)試情，每隔6 h試情1次。于撤栓后48 h腹腔鏡法子宮角輸精，注射LH 100 IU。輸精后5～6 d手術(shù)法沖出供體子宮中的桑椹胚和囊胚。將沖出的胚胎通過體視顯微鏡觀察分為1、2、3、4級，分級標(biāo)準(zhǔn)：

1級胚胎：胚胎的形態(tài)正常，發(fā)育速度與胚胎日齡一致，卵裂球排列緊密適度，大小、色澤均勻，透明帶完整。

2級胚胎：發(fā)育速度與胚胎日齡基本一致，卵裂球排列不太緊密，輪廓清晰，個別卵裂球大，透明帶完整。

3級胚胎：卵裂球排列松散，輪廓不清晰，色澤過暗，有的破裂呈沙粒樣，有碎片；透明帶不完整。

4級胚胎：變性胚、退化胚。

1、2級胚胎可以進(jìn)行移植，但本試驗(yàn)只對1級胚胎移植結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5 受體的同期發(fā)情處理 在受體綿羊發(fā)情周期的任意一天放置CIDR，第13天注射PMSG并取出CIDR，于撤栓后24～48 h期間利用公羊試情。嚴(yán)格控制供受體發(fā)情同步差，使兩者在理論上不超過12 h。

1.6 胚胎移植方法 采用腹腔鏡微創(chuàng)手術(shù)法將桑椹胚或囊胚移植到與供體同步發(fā)情的受體羊子宮角中。

1.7 冷凍/解凍胚胎 冷凍胚胎全為杜泊綿羊胚胎，于澳大利亞進(jìn)口，為程序化慢速冷凍、細(xì)管保存。解凍方法為三步法解凍。

1.8 試驗(yàn)羊術(shù)后處理及受體妊娠診斷 供體受體羊術(shù)后肌肉注射長效土霉素5 mL，圈舍保持干燥清潔，供體給予充足水料并多觀察，以保證術(shù)后恢復(fù)良好。受體于移植后60 d通過B超儀診斷妊娠與否，妊娠受體單獨(dú)分群并適當(dāng)補(bǔ)飼。

1.9 統(tǒng)計分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2003軟件處理后，使用SPSS20.0軟件對妊娠率數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 黑薩?？思岸挪囱蚺咛グl(fā)育階段對受體妊娠的影響 由表1可知，本試驗(yàn)共用黑薩福克135枚鮮胚桑椹胚和86枚鮮胚囊胚、杜泊56枚桑椹胚和42枚囊胚，胚胎體外停留2.5 h內(nèi)移植給撤栓5.5 d的受體羊，每只受體移植一枚1級桑椹胚（1M）或一枚1級囊胚（1B）。結(jié)果顯示，受體移植囊胚的妊娠率極顯著高于桑椹胚（P＜0.01）。移植相同階段胚胎時，杜泊羊妊娠率略高于黑薩?？搜颍≒＞0.05）。

表1 囊胚移植與桑椹胚移植受體妊娠情況

2.2 冷凍及胚胎發(fā)育階段對胚胎移植妊娠的影響如表2所示，凍胚桑椹胚（凍胚1M）、鮮胚桑椹胚（鮮胚1M）移植妊娠率分別為63.4%、 51.9%（P＞0.05）；然而凍胚囊胚（凍胚1B）、鮮胚囊胚（鮮胚1B）移植妊娠率分別為48.2%、 80.6%（P＜0.01）；此外，凍胚1M移植妊娠率也略高于凍胚1B移植妊娠率（P＞0.05）。

表2 冷凍、鮮胚移植后受體妊娠情況

2.3 供體發(fā)情早晚對沖胚時胚齡的影響 如表3所示，供體撤栓后12～48 h期間試情，12～24 h期間發(fā)情記為早發(fā)情供體（共22只），36～48 h期間發(fā)情記為晚發(fā)情供體（共18只），兩組間在輸精后5.5 d沖胚時囊胚所占比例差異極顯著（P＜0.01），分別為81.7%、17.4%。

表3 供體發(fā)情早晚對沖胚時囊胚比例的影響

2.4 胚胎體外停留時間對受體妊娠的影響 由表4可知，黑薩?？撕投挪囱蝓r胚隨機(jī)移植過程中，桑椹胚在體外停留0.5～1、1～1.5、1.5～2.5 h，移植單個鮮胚桑椹胚（1M）的受體3組間妊娠率差異不顯著（P＞0.05）；囊胚在體外停留0.5～1、1～1.5、1.5～2.5 h，移植單個鮮胚囊胚（1B）的受體3組間妊娠率差異也不顯著（P＞0.05）。

表4 胚胎體外停留時間對受體妊娠的影響

2.5 受體羊移植側(cè)和移植側(cè)黃體數(shù)對受體妊娠影響

2.5.1 受體羊卵巢上黃體分布規(guī)律 本試驗(yàn)中384只受體小尾寒羊左右側(cè)黃體總數(shù)為1～6枚。如表5所示，左側(cè)0黃體、右側(cè)1黃體占23.18%；左側(cè)1黃體、右側(cè)1黃體占21.16%；左側(cè)1黃體、右側(cè)0黃體占16.41%。

2.5.2 受體移植側(cè)黃體數(shù)對妊娠的影響 如表6所示，黑薩?？撕投挪垂w羊胚胎隨機(jī)移植1枚桑椹胚（1M）時，受體羊移植側(cè)有1個黃體妊娠率極顯著低于移植側(cè)有2～3枚黃體妊娠率（P＜0.01）；然而當(dāng)移植1枚囊胚（1B）時，受體羊移植側(cè)有1枚黃體與2～3枚黃體兩者間妊娠率差異不顯著（P＞0.05）。

表5 受體羊黃體分布情況 %

表6 受體移植側(cè)黃體個數(shù)對妊娠的影響

3 討 論

3.1 胚胎發(fā)育階段對受體妊娠的影響 供受體生殖系統(tǒng)生理狀態(tài)的同步性是胚胎移植成功與否的關(guān)鍵因素，供體羊與受體羊同期發(fā)情存在差異，撤栓后0～48 h內(nèi)的發(fā)情時間不一致會最終導(dǎo)致卵巢上卵泡破裂排卵的時間不同[4]。在胚胎移植過程中，需要按照受體與供體發(fā)情時間相近的原則進(jìn)行配對移植，即移植胚胎的階段要與受體羊的生理狀態(tài)盡可能吻合。張紅等[5]研究表明，?？芭咭浦彩芴ヂ矢哂谀遗?；而張金龍等[6]報道表明，囊胚移植的妊娠率顯著高于桑葚胚。本試驗(yàn)結(jié)果表明，受體撤栓5.5 d杜泊和黑薩?？搜蛞浦材遗呷焉锫史謩e高達(dá)88.1%和83.7%，遠(yuǎn)高于移植桑葚胚的妊娠率57.1%和50.4%，這與張金龍等[6]報道結(jié)果相一致。此外，供體品種黑薩福克和杜泊對移植妊娠無顯著影響，不同于易金云等[1]報道的黑薩福克胚胎移植后的妊娠率顯著低于杜泊羊，這可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)中的2個品種間相同階段的胚胎質(zhì)量（全為1級胚胎）相差不大。

3.2 胚胎冷凍對移植妊娠的影響 張亮等[7]研究表明，冷凍桑椹胚和囊胚階段的胚胎，移植后的受胎率囊胚顯著高于桑椹胚。而王素梅等[8]的報道表明，凍胚桑椹胚與凍胚囊胚移植妊娠率差異不顯著。本試驗(yàn)研究表明，受體撤栓5.5 d期間移植冷凍桑椹胚和冷凍囊胚的移植妊娠率差異不顯著，這與王素梅等[8]的報道相一致。而本試驗(yàn)中，新鮮囊胚移植妊娠率極顯著高于冷凍囊胚，而新鮮桑椹胚移植妊娠率與冷凍桑椹胚之間差異不顯著，這可能與囊胚冷凍/解凍過程中易受到損傷有關(guān)[9]。

3.3 供體發(fā)情早晚對沖胚時胚齡的影響 本試驗(yàn)結(jié)果表明，供體輸精后5.5 d沖胚時獲得囊胚的比例與供體撤栓后發(fā)情早晚相關(guān)，撤栓后12～24 h期間發(fā)情的早發(fā)情供體沖胚時囊胚率高達(dá)81.7%，然而36～48 h期間發(fā)情的晚發(fā)情供體囊胚率只有17.4%。這可能是由不同供體個體間發(fā)情、排卵先后存在較大差距造成[3]。

3.4 胚胎體外停留時間對受體妊娠的影響 張金龍等[6]研究表明，波爾山羊胚胎在體外停留60 min內(nèi)對移植成功率沒有顯著差異。張紅等[5]報道，波爾山羊胚胎在體外停留時間4 h內(nèi)對受體妊娠無顯著影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，杜泊和黑薩?？斯w綿羊胚胎移植過程中，無論桑葚胚還是囊胚，體外停留時間在2.5 h內(nèi)不影響移植后的受體妊娠。

3.5 受體羊移植側(cè)和黃體個數(shù)對妊娠率的影響 何振富等[10-11]研究表明，受體移植側(cè)1個黃體與2個黃體對妊娠無顯著影響。本試驗(yàn)的研究表明，移植囊胚時受體黃體數(shù)對妊娠沒有影響，但移植桑椹胚時，受體移植側(cè)2～3個黃體妊娠率更高，這可能與移植側(cè)黃體數(shù)2～3個的受體較1個黃體的受體植入窗口期更長有關(guān)[12]。

4 結(jié) 論

在黑薩?？撕投挪囱蚺咛ヒ浦策^程中，5.5 d撤栓處理的受體子宮角移植桑椹胚和囊胚時，新鮮胚胎移植囊胚、冷凍胚胎移植桑椹胚效率較高；將新鮮桑椹胚移植給移植側(cè)有2～3個黃體受體效果好于1個黃體受體。

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Study of Fresh and Frozen Embryo Transfer Ef ficiency of Black Suf f olk and Dorper Ewes

XU Zhi-yuan1,2, YANG Ming-hui2, JI Peng-yun2, ZHANG Xiao-sheng3, ZHANG Jin-long3, ZHU Shi-en2, Abulizi Wusiman4, ZHAO Jing1*, LIU Guo-shi2*

To improve the embryo transer eciency oelite species osheep with high meat quality, a total o76 Black Suolk and 27 Dorper ewes were treated by “CIDR+FSH+PMSG” methodor superovulation as donors. The 384 smalltailed han sheep were treated by “CIDR+PMSG” methodor estrus synchronization as receptors. It was explored to test the inuence odevelopmental stages oembryo,rozen processing othe embryo, embryo in vitro residence time and transplantation olateral corpus luteum number oreceptor on the pregnancy rates ater embryo transer. The pregnancy rate oblastocyst transplantation was signicantly higher than morula transplantation (P＜0.01) when a singleresh embryo was transplanted. Therozen/thaw blastocyst transplantation pregnancy rate was signicantly lower thanresh blastocyst (P＜0.01), but the dierence betweenrozen/thaw morula andresh morula was not signicant(P＞0.05). In addition, the pregnancy rate with transplanted morula would be signicantly aected (P＜0.01), the transplanted blastocyst would not be signicantly aected(P＞0.05), when the transplanted-side-ovary oreceptor had 1 corpus luteum or 2～3 corpus luteums. In conclusion, when morula and blastocyst were tansplanted into uterine horn, higher pregnancy rate could be achieved iaresh blastocyst or arozen morula was transered. Fresh morula should be transplanted to the receptor with 2～3 corpus luteums on ovary transplantation side instead o1 corpus luteum.

Sheep; Morula; Blastocyst; Frozen embryo; Corpus luteum number oreceptor; Pregnancy rate

S826.3

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-07-048

2016-09-29；

2017-02-08

轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)（2014ZX08008-002B、2016ZX08 008-003）；新疆自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目（2016E02037）；中國農(nóng)業(yè)大學(xué)與新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)合作基金（2015TC050）

徐志遠(yuǎn)（1989-），男，河北唐山人，碩士，研究方向?yàn)閯游镞z傳育種與繁殖，E-mail: xzy2008331111@163.com

? 通訊作者：劉國世，E-mail: gshliu@cau.edu.cn；趙靜，E-mail: wenfa2004@163.com