周 晶，方南洙,李鐘淑，徐禮杰，李?？?/p>

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院畜牧學(xué)系，吉林延吉 133000）

抗氧化劑對精子質(zhì)量影響的研究進展

周 晶，方南洙*,李鐘淑，徐禮杰，李?？?

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院畜牧學(xué)系，吉林延吉 133000）

為提高優(yōu)良公畜的利用率并獲得大量高質(zhì)量的胚胎，畜牧業(yè)引入體外授精技術(shù)。體外授精技術(shù)成功的關(guān)鍵因素之一是精液保存，精液長期保存的方法主要是冷凍保存。然而，冷凍容易使精子受到氧化應(yīng)激損傷。其中一個原因是體外的精子缺乏機體內(nèi)氧化-抗氧化體系的保護；另外冷凍會刺激精液產(chǎn)生過量的活性氧（ROS）組分，二者均能削弱精子的抗氧化能力，導(dǎo)致精子的結(jié)構(gòu)和功能受到損傷。ROS是造成氧化應(yīng)激的關(guān)鍵因素之一，它會影響精子質(zhì)量，進一步降低胚胎成活率，最終導(dǎo)致動物繁殖能力下降。針對這一問題，科學(xué)工作者已研究了大量的改進措施，如添加抗氧化劑、改善精液儲存的環(huán)境條件，或二者協(xié)同處理。目前，抗氧化藥物已在體外受精領(lǐng)域取得很大的新突破，但精子受到氧化損傷的問題還未完全解決，本文就目前精子抗氧化方面的研究作一綜述。

精子；體外受精；氧化應(yīng)激；抗氧化劑

體外受精（In Vitro Fertilization，IVF）是借助人工操作讓精子和卵子在體外環(huán)境中完成受精過程的一項技術(shù)。IVF技術(shù)可以給動物繁殖提供數(shù)量更多、成本更低的胚胎，不僅能開發(fā)優(yōu)良母畜的繁殖潛力，同時加速了良種公畜的育種進程。然而IVF技術(shù)中用于體外受精精子的保存條件難以控制。若保存條件不佳，精子的質(zhì)量就會下降，從而導(dǎo)致受精率降低以及胚胎發(fā)育不良。例如，環(huán)境中活性氧（ROS）含量持續(xù)升高會產(chǎn)生氧化應(yīng)激（Oxidative Stress，OS），精子在這種條件下保存就可能導(dǎo)致其質(zhì)量下降。雄性生殖器官的新陳代謝是處于不斷產(chǎn)生的ROS條件下，在交配過程中精子也必經(jīng)過高氧環(huán)境，因此，為了保護雄性生殖能力，必須重視氧化應(yīng)激保護機制[1]。睪丸組織自身含有抗氧化酶體系，并且它們是清除ROS的主力軍，因此，精子在生物體內(nèi)幾乎不受到OS。但是在體外環(huán)境中，由于溫度和光照等因素，使精子容易遭受OS。因此，要在家畜生產(chǎn)上提高IVF效率，首先要解決精子在體外環(huán)境中的氧化損傷，本文將從以下幾個方面進行綜述。

1 精子與氧化應(yīng)激作用

1.1 ROS及其對精子的有益作用 ROS是指生物體內(nèi)含氧且具有較強氧化還原活性的自由基和非自由基氧的衍生物。ROS是生物正常有氧代謝過程中產(chǎn)生的一系列副產(chǎn)物，主要包括超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（OH-）、一氧化氮（NO-）等。因為核外有未配對的電子存在，所以具有很強的化學(xué)反應(yīng)活性。在精子結(jié)構(gòu)和功能成熟的生理過程中，ROS的生成是有益的[2]。如圖1所示，ROS（主要是H2O2）是通過催化磷酸酯酶的氧化滅活來控制高活性半胱氨酸巰基（Cys-SH）的催化中心，進一步保證細(xì)胞的連續(xù)增殖，由于體內(nèi)研究數(shù)據(jù)的逐漸積累,表明相同的機制也可能適用于生殖系統(tǒng)中[3]。由此可知，ROS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能有助于維持精子體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，還能促進精子發(fā)生細(xì)胞的生長。此外，精子在體外保存過程中，呼吸代謝產(chǎn)生的少量而持續(xù)的ROS可以誘發(fā)精子超激活運動并獲能[4],參與相關(guān)的酪氨酸磷酸化活動，并且ROS水平的變化還能調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和精子獲能2個過程之間的平衡[5]。

圖1 ROS信號功能共識機制的總結(jié)

1.2 OS對精子的危害 精子離開體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)后，精子體內(nèi)代謝機制異常，ROS水平會不斷上升，其氧化速度超過氧化物的清除速度，導(dǎo)致氧化-還原體系失衡，最終造成精子遭受OS[6]。OS是由ROS生產(chǎn)不平衡造成的，即細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的穩(wěn)態(tài)被破壞。ROS不僅能減少抗氧化酶的活性，還能損傷線粒體DNA（mtDNA）。mtDNA是線粒體膜的電子傳遞鏈上必不可少的一種多肽，密切參與線粒體的氧化磷酸化和ATP的生成，因此mtDNA缺陷將導(dǎo)致線粒體膜電位下降，從而使氧化還原平衡更趨向于OS，最終，對精子造成不可逆的傷害。OS會損傷精子發(fā)生的細(xì)胞、精子發(fā)生的過程以及精子功能。OS對精子發(fā)生細(xì)胞最直接的危害是破壞其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，現(xiàn)在已有20多種不同類型的結(jié)構(gòu)損傷已被確認(rèn)[7]（圖2）。精子發(fā)生對溫度十分敏感，因此熱休克蛋白（HSP70）與哺乳動物精子生成密切相關(guān)，有研究表明，OS會影響精子發(fā)生過程中HSP70的表達(dá)[8]。ROS濃度超標(biāo)會干擾精子的代謝，導(dǎo)致多不飽和脂肪酸質(zhì)膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，進而降低精子能動性；還會影響精子的受精能力，具體表現(xiàn)為頂體反應(yīng)能力下降[9]。

2 精子的抗氧化原理

圖2 內(nèi)源性ROS造成含氮堿基的氧化和環(huán)基碎裂

在體內(nèi)，精子本身具有氧化還原能力，例如,能量供應(yīng)和氧化還原電位對維持液態(tài)保存精液中的精子功能是必不可少的。有研究表明，哺乳動物的精子通過糖酵解、糖酵解結(jié)合線粒體三羧酸循環(huán)或三羧酸循環(huán)結(jié)合磷酸戊糖途徑獲得的能量均可使精子產(chǎn)生極大的氧化還原能力[10]。但Qiu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在維持山羊精子運動性時，磷酸戊糖途徑比糖酵解更重要，因為磷酸戊糖途徑可以減少精子OS并為糖酵解提供更多的中間產(chǎn)物。此外，還有報道證明，通過檸檬酸循環(huán)獲得能量能維持牛精子的運動性，但對小鼠精子無影響[12]。精子自身還能修復(fù)ROS的損傷，主要包括脂肪酶、蛋白酶及其他酶類對損傷分子進行修復(fù)。但有研究表明，只有當(dāng)ROS對精子DNA造成的損傷程度輕時，其自身修復(fù)功能才會自動開啟[13]。

圖3 哺乳動物體內(nèi)的抗氧化機制

在動物體內(nèi)生殖組織中也存在氧化-還原平衡體系，受到ROS刺激時抗氧化機制就會被啟動，降低精子受到氧化損傷的程度。哺乳動物體內(nèi)進化出幾種減少氧化應(yīng)激和降低ROS損傷的抗氧化機制（圖3）：一個是由酶和低分子量化合物（如維生素）組成的抗氧化系統(tǒng)，這個系統(tǒng)在有害ROS有機會接觸其他重要分子并終止后續(xù)連鎖反應(yīng)之前將其清除；另一個是氧化還原系統(tǒng)，這個系統(tǒng)不僅能清除有害氧化物，還能不斷地恢復(fù)已氧化的分子[1]。精子發(fā)生過程中新陳代謝高度活躍，這表明生殖系統(tǒng)本身就能產(chǎn)生高水平的ROS。因此在生殖道上皮細(xì)胞和睪丸支持細(xì)胞上經(jīng)常出現(xiàn)高含量水平的氧化還原分子，如AKR（Aldo-Keto Reductases）是醛-酮還原酶,能減輕羰基化合物產(chǎn)生的氧化應(yīng)激[14]。

3 抗氧化劑對精子的影響

抗氧化劑主要是消除或減弱ROS對精子的刺激，通過阻止自由基鏈的生成和蔓延來減少OS造成的損傷。選用抗氧化劑時要考慮不能完全清除ROS，為防止細(xì)胞受到氧化壓力，就要維持細(xì)胞內(nèi)正常生理水平的ROS[15]。

3.1 提高精液質(zhì)量 液態(tài)保存法常用于精子生理結(jié)構(gòu)特殊的動物精液的儲存。例如，豬精液常采用液態(tài)保存法，原因是豬精子質(zhì)膜上不飽和脂肪酸含量高，對溫度變化極為敏感，若溫度降低直接會影響精子的質(zhì)量，因此冷凍保存不能滿足對豬受精質(zhì)量的要求。然而，在液態(tài)保存條件下，精子易受到OS。針對這一問題，劉亞偉[16]做了相關(guān)實驗，用α-硫辛酸、維生素-P和L-肉堿3種抗氧化劑對液態(tài)保存的精液進行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種抗氧化劑均能不同程度地提高精液的活率、活力、頂體完整性、質(zhì)膜完整率和線粒體活性等指標(biāo)，還降低脂質(zhì)過氧化水平。許春榮等[17]發(fā)現(xiàn)，0.01 mmol/L褪黑素可以提高豬精液液態(tài)保存后的品質(zhì)，1 mmol/L多巴胺有利于豬精子的液態(tài)保存。Eslami等[18]研究了公羊精液的液態(tài)保存，發(fā)現(xiàn)棕櫚油酸可以作為一種抗氧化劑來保護精子免受損傷，用它處理72 h可以顯著提高精子的活力和運動能力，并且通過PCR測定進一步證明櫚油酸可以提高精子的抗氧化水平及超氧化物歧化酶（SOD）活性。

通常各類保存的精液冷凍-解凍后質(zhì)量都會下降，包括活率和活力的降低以及精子DNA完整性的破壞。因此，經(jīng)冷凍-解凍后的精液也需要抗氧化劑的保護來提高精液質(zhì)量。Pang等[19]研究結(jié)果顯示，1 mmol褪黑素可以提高牛冷凍-解凍精液的質(zhì)量。肉堿是一種強大的抗氧化劑，在冷凍-解凍后的精液中補充7.5 mmol的肉堿能通過促進線粒體ATP的生成而減少ROS的產(chǎn)生，進而改善水牛精子質(zhì)量，但對體外受精能力沒有任何作用[20]。用5 mmol的精胺處理冷凍-解凍后的精液時，能有效地清除精子內(nèi)的ROS，防止細(xì)胞凋亡，維持精子功能[21]。

3.2 延長精子的壽命 精液稀釋液可以維持精子在體外保存過程中的受精能力并延長其存活時間，根據(jù)用途和性質(zhì)可分為現(xiàn)用稀釋液、常溫稀釋液、低溫稀釋液和冷凍保存稀釋液4種。在稀釋液中添加抗氧化劑可提高稀釋液對精子的抗氧化保護能力。Cheema等[22]研究表明，在精液冷凍稀釋液中添加150 μmol的化學(xué)物質(zhì)錳可以給精子提供抗氧化的保護，延長精子壽命，提高體外受精和人工授精的成功率。稀釋液中添加0.8%卵磷脂可顯著提高精子的運動力和生育能力，并降低精子的形態(tài)異常率，結(jié)果表明卵磷脂是精液冷凍保存后稀釋液的增強劑，可作為保護長期儲存冷凍精液壽命的一個工具[23]。鹽酸-半胱氨酸和抗壞血酸2個抗氧化添加劑混合添加到精液稀釋液中可以提高-196℃低溫保存的水牛精子的質(zhì)量參數(shù)，減少天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶和堿性磷酸酶等在精液中的泄露，進而延長水牛精子的壽命[24]。維生素C和維生素E作為抗氧化劑添加到精液稀釋液中，可以顯著提高冷凍后精子的壽命和質(zhì)量，Azawi等[25]用Awassi公羊的精液進行實驗驗證了這一結(jié)論。

3.3 提高精子受精率 受精率的高低取決于精液的質(zhì)量，而精子質(zhì)量的評估指標(biāo)之一是精子DNA碎片指數(shù)（DNA Fragmentation Index，DFI）。DFI是代表精子DNA損傷程度的參數(shù)，它受ROS和抗氧化劑之間平衡的影響[26]。在精子總堿性磷酸酶（TALP）介質(zhì)中加入10 μg/mL氯化鋅、500 μg/mL D-天冬氨酸鹽（D-Asp）和40 μg/mL輔酶Q10，可以有效防止精子能動性的損失，降低DFI，此外，在精液中添加這些抗氧化劑可以提高精子受精率，并使受精后胚胎的囊胚發(fā)育率顯著高于對照組[27]。抗氧化劑的確可以提高精子的受精率，但是只有添加適當(dāng)?shù)膭┝坎拍馨l(fā)揮其作用。白藜蘆醇（Res）和兒茶素-3-沒食子酸酶（EGCG）是2種具有高水平抗氧化活性的抗氧化劑。Gadani等[28]實驗表明，在解凍的豬精液中添加25 μmol/L或50 μmol/L EGCG，精子受精率顯著高于對照組和其他濃度處理組；同時，添加2 mmol/L的Res也可以觀察到相同的效果。也有研究表明，抗氧化劑褪黑素雖然能影響精液質(zhì)量和生育能力，但是對精液受精率無影響[29]。

3.4 提高胚胎發(fā)育效率 動物體外受精最終的目的是獲得質(zhì)量好的胚胎，ROS造成的OS不僅會擾亂精子的受精潛力，還會減弱這些細(xì)胞創(chuàng)造出一個正常健康胚胎的能力[30]。因此要保證體外受精的精子免受氧化損傷，目前研究中常采用添加抗氧化劑來達(dá)到此目標(biāo)。例如超氧化物歧化酶模擬劑（MnTE）具有抗氧化作用，這種抗氧化劑可通過細(xì)胞的滲透行為來保護精子免受ROS誘導(dǎo)的基因組DNA損傷。Mohsen等[31]實驗結(jié)果表明，在冷凍-解凍的山羊精液中添加0.1 μmol MnTE可以顯著提高膜的完整性，而在冷凍的精液中補充0.01 μmol MnTE，發(fā)現(xiàn)解凍后精子的頂體完整性顯著高于對照組和其他濃度處理組，同時還能提高囊胚形成率和孵化率。

4 結(jié) 語

近年來，動物繁殖率日益下降，雖已有大量關(guān)于提高精子性能的研究及改進措施，但精子的氧化現(xiàn)象仍很嚴(yán)峻，需要繼續(xù)進行精子抗氧化方面的研究。目前，在畜牧業(yè)中，最簡單有效的解決辦法就是使用抗氧化劑。確定氧化應(yīng)激的誘因及其作用機制，才能合理選擇抗氧化劑種類并更好地利用其來改善精子的抗氧化損傷，提高體外受精的成功率。

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Research Progress on Antioxidant Ef f ect of on Sperm Quality

ZHOU Jing, FANG Nan-zhu*, LI Zhong-shu, XU Li-jie, LI Fu-jun*

Animal husbandry technology introduced in vitroertilization to increase the utilization rate ogenetically and phenotypically improve sire and to obtain high number ogood quality embryos. One othe keyactors osuccessul in vitroertilization is semen preservation. cryopreservation is one othe best methodor long-term preservation osemen. However preservation easily produce oxidative stress which is harmulor sperm . One othe main reasonor this is that in vitro sperm lack the oxidant-antioxidant system protection othe body; Second reason is that the preservation process stimulates the overproduction oreactive oxygen. Both condition weaken sperm antioxidant ability and lead to structural andunctional damage othe sperm. One othe keyactors ooxidative stress is reactive oxygen species(ROS), which aect the quality osperm, reduce the survival rate oembryos and decline the animal reproduction ability. To solve this problem, scientically a large number oimprovement measures have been studied such as adding antioxidants, improving conditionsor semen storage environment, or both etc. At present, in theeld oin vitroertilization antioxidant drug has made a lot onew breakthroughs, but oxidative damage with sperm has not beenully solved. In this paper, we summarized the antioxidative eect on semen preservation.

Sperm; in vitroertilization; Oxidative stress; Antioxidant

S814.1

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-07-013

2017-02-22；

2017-04-23

國家自然科學(xué)基金項目（31360546）

周晶（1993-），女，吉林大安人，碩士研究生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail:1021825630@qq. com

* 通訊作者：李福俊，男，吉林龍井人，講師， E-mail：fujun li66@hotmail.com ；方南洙，男，教授， E-mail：nzfang@ ybu.edu.cn