宋玉芹，于光輝，王建琳，張 燦，張廷榮

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109）

IGFBP3基因內(nèi)含子2多態(tài)性及其與豬主要生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

宋玉芹，于光輝，王建琳，張 燦，張廷榮*

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109）

胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（Insulin- like Growth Factor Binding Proteins，IGFBPs）與動(dòng)物的生長發(fā)育有著密切的聯(lián)系，為研究IGFBP3的多態(tài)性與豬生長性狀之間的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)采用PCR-RFLP方法對(duì)大白豬、杜洛克及長白豬IGFBP3基因內(nèi)含子2的多態(tài)性進(jìn)行分析，并且研究了IGFBP3不同基因型對(duì)體長、體高、瘦肉率、活體背膘、肌肉厚度、0～100 kg日增重、30～100 kg日增重及100 kg體重日齡等主要生長性狀的影響。結(jié)果表明：IGFBP3基因內(nèi)含子2共417 bp，在3個(gè)豬群中有1個(gè)A307G多態(tài)位點(diǎn)與豬的生長性狀有關(guān)，并且都是AG基因型占優(yōu)勢(shì)，杜洛克與長白豬在該位點(diǎn)上偏離Hardy-Weinberg平衡（P＜0.010）；3個(gè)品種豬群IGFBP3基因的多態(tài)性信息含量（PIC）均表現(xiàn)為中度多態(tài)（0.34～0.37）；IGFBP3基因的GG基因型對(duì)大白豬的體高（P=0.068）、瘦肉率（P=0.058）的影響較大，對(duì)杜洛克豬的瘦肉率（P=0.099）、肌肉厚度（P=0.079）的影響較大，對(duì)長白豬的0～100 kg日增重的影響均接近顯著水平（P=0.08）。GG基因型豬具有體高、瘦肉率高和生長較快的特點(diǎn)，為以后豬的育種和選種提供參考。

豬；IGFBP3；PCR-RFLP；關(guān)聯(lián)分析

生長激素（Growth Hormone，GH）主要是通過胰島素樣生長因子（Insulin-like Growth Factor，IGFs）介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)促生長作用。哺乳動(dòng)物的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（Insulin- like Growth Factor Binding Proteins, IGFBPs）能夠與IGFs結(jié)合成穩(wěn)固的復(fù)合物，延長IGFs的半衰期，增加IGFs在靶組織中的分布，調(diào)節(jié)IGFs的生物學(xué)功能[1]。IGFBP3不僅能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制癌細(xì)胞，而且能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期， 因?yàn)镮GFBP3本身有促進(jìn)細(xì)胞生長作用，與胎盤的形成以及后期胎兒在子宮內(nèi)的發(fā)育具有極為密切關(guān)系[2]。IGFBP3也與肌肉發(fā)育有關(guān)，兒童骨骼肌中此蛋白的含量高于成年人[3]。豬的IGFBP3基因定位在18q24染色體上，全長4 532 bp，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，編碼293個(gè)氨基酸[4]。IGFBP3基因存在較多的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，通過標(biāo)記與性狀的關(guān)聯(lián)分析，認(rèn)為部分位點(diǎn)可能對(duì)豬的部分生長性狀有重要影響[4]。本研究采用PCRRFLP方法對(duì)豬IGFBP3基因內(nèi)含子2的Tas I限制性酶切位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析，研究該位點(diǎn)的基因型與生長性狀關(guān)聯(lián)情況，為該基因結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)群體取自山東某種畜禽有限公司原種豬場，其中有大白豬189頭，杜洛克154頭，長白豬117 頭。采集耳組織樣品，用常規(guī)的苯酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，稀釋成100 ng/μL備用。

1.2 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank已知序列（No: AY422045）設(shè)計(jì)引物，由青島擎科生物工程有限公司合成。上游引物：5'-CCGCGTGGGAAT GGTAACTACA-3'，下游引物：5'-GCGGGAACG GGAGGGAGAG -3'。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，其中MgCl2（25 mmol/L）1.5 μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，上下游混合引物（50 μmol/L）0.3 μL，Taq 酶（5 U/μL ）0.2 μL，模板DNA 1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，雙蒸水19 μL。循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸1 min，33個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物的檢測和酶切：取4 μL PCR產(chǎn)物，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇特異性強(qiáng)的產(chǎn)物用于酶切反應(yīng)。

1.3 酶切 酶切時(shí)取8 μL PCR產(chǎn)物加入0.4 μL TAS I 酶和0.9 μL Buffer，65℃恒溫過夜。酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以5～10 V/cm電壓電泳約25 min，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照并記錄結(jié)果。

1.4 主要生長指標(biāo)測定 利用GB8467-87瘦肉型種豬性能測定技術(shù)規(guī)程，獲得試驗(yàn)豬生長性狀的測定結(jié)果。主要生長指標(biāo)有體長、體高、瘦肉率、活體背膘、肌肉厚度、0～100 kg日增重、30～100 kg日增重及100 kg體重日齡。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

遺傳雜合度（He）為某一群體中一個(gè)特定的基因位點(diǎn)上等位基因雜合的雜合度。計(jì)算群體內(nèi)某一座位的基因雜合度Nei氏公式[5]：

式中，Pi為某一座位第i個(gè)等位基因頻率；n 為該座位等位基因數(shù)。

有效等位基因數(shù)（Ne）反映等位基因間的相互影響，是衡量基因純合度的指標(biāo)。等位基因在群體中分布的越均勻，有效等位基因數(shù)越接近實(shí)際檢測到的等位基因個(gè)數(shù)。

多態(tài)信息含量（PIC）用于對(duì)標(biāo)記基因多態(tài)性的估計(jì)。利用Bot-stein 公式[6]計(jì)算：

式中，Pi和Pj分別為第i和第j個(gè)等位基因在群體中的頻率，n為等位基因數(shù)。

圖1 TASI酶切417 bp PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2 結(jié) 果

2.1 PCR酶切結(jié)果 如圖1所示，PCR擴(kuò)增的IGFBP3基因的內(nèi)含子2的片段長度為417 bp，而且經(jīng)限制性內(nèi)切酶TASI 65℃消化后，在檢測的所有個(gè)體中共有3種基因型，分別被定義為AA基因型（417 bp），AG基因型（417/307/110 bp）和GG基因型（307/110 bp）。

2.2 IGFBP3的基因型與基因頻率 大白豬、杜洛克及長白豬各品種群體的基因頻率和基因型頻率見表1。3個(gè)豬群中都以IGFBP3基因AG基因型占明顯優(yōu)勢(shì)，占一半以上。經(jīng)Х2適合性檢驗(yàn)表明杜洛克、長白豬群體在該位點(diǎn)上偏離Hardy-Weinberg平衡。

2.3 不同種群IGFBP3基因雜合度及多態(tài)信息含量由表2可見，大白、杜洛克、長白3個(gè)品種群體IGFBP3基因均表現(xiàn)為中度多態(tài)，在IGFBP3基因影響的性狀選擇上還有較大的選擇空間。Ne是衡量基因純合度的又一指標(biāo)，Ne越接近實(shí)際檢測到的等位基因的個(gè)數(shù)，等位基因在群體中分布的越均勻。大白、杜洛克和長白豬3個(gè)種群中只有杜洛克豬群體的Ne與實(shí)際檢測到的等位基因數(shù)相差稍大。

表1 IGFBP3基因型頻率、基因頻率分布

表2 IGFBP3基因在3個(gè)種群中的He、Ne和PIC

2.4 IGFBP3不同基因型與主要生長性狀的關(guān)聯(lián)分析 由表3可見，3種基因型對(duì)杜洛克、大白、長白3個(gè)豬種的8個(gè)生長性狀的影響均未達(dá)到顯著水平（P＞0.05），但GG型對(duì)大白豬的體高和瘦肉率、杜洛克豬的瘦肉率和肌肉厚度、長白豬的0～100 kg日增重的影響均接近顯著水平，顯示了GG基因型豬群有體高與瘦肉率較高，生長較快的特點(diǎn)。

3 討 論

3.1 IGFBP3基因的遺傳效應(yīng)與性狀之間的關(guān)系IGFBP3在組織中的表達(dá)水平與動(dòng)物的生長發(fā)育有顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，IGFBP3基因mRNA和蛋白在小月齡胎兒中的表達(dá)水平高于適齡胎兒[7]，豬血清中IGFBP3的含量與平均日增重也呈負(fù)相關(guān)[8]。長白豬與藍(lán)塘豬的雜交F2代資源群IGFBP3基因A2670G位點(diǎn)與豬的胴體和肉質(zhì)性狀的關(guān)系研究表明，IGFBP3與豬的多個(gè)性狀間存在顯著相關(guān)，其中G基因可能是選擇瘦肉率的有利基因，而A基因?qū)x擇肌肉的大理石花紋有利[9]。大白豬IGFBP3基因G3695A位點(diǎn)不同基因型與其生長速度和背膘厚有關(guān)，其中GG基因型生長速度顯著提高，而雜合子GA基因型的背膘厚顯著降低[10]。本研究結(jié)果顯示，GG基因型對(duì)大白豬的體高和瘦肉率、杜洛克豬的瘦肉率和肌肉厚度、長白豬的0～100 kg日增重的影響均接近顯著水平，顯示GG基因型豬群體高與瘦肉率較高，生長速度較快。可知GG基因型對(duì)豬有促進(jìn)生長、增加瘦肉率的正效應(yīng)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

表3 不同基因型對(duì)生長性狀的影響

3.2 3個(gè)豬群IGFBP3基因的多態(tài)性 芬蘭大白豬IGFBP3基因G3695A位點(diǎn)多態(tài)性檢測結(jié)果表明，GC基因型的頻率為0.4950，G等位基因的頻率為0.6955，均為最高[11]。楊士紅等[10]研究中國大白豬IGFBP3基因G3695A位點(diǎn)多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)GA基因型和A等位基因的頻率最高，分別為0.7127和0.5759。而本研究3個(gè)品種豬群也是雜合基因型AG的基因型頻率最高，都在一半以上，與前人研究結(jié)果一致。但是等位基因A的頻率在大白豬和長白豬中比等位基因G大，而在杜洛克群體中等位基因G的頻率大于A，這可能由于不同豬群的遺傳背景不同或在育種過程中選育方向不同造成的。本研究中杜洛克、長白豬群體在該位點(diǎn)上偏離Hardy-Weinberg平衡，這種現(xiàn)象在不同的群體中經(jīng)常發(fā)生，特別是培育品種體系中由于親本的貢獻(xiàn)不同造成的[12]。

綜上所述，可知IGFBP3基因在大白豬、杜洛克和長白豬多態(tài)性較高，GG基因型豬具有體高、瘦肉率高和生長較快的特點(diǎn)，是一個(gè)值得研究的重要基因。

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The Polymorphism of IGFBP3 Intron 2 and Its Relationship with the Main Growth Traits of Pigs

SONG Yu-qin, YU Guang-hui, WANG Jian-lin, ZHANG Can, ZHANG Ting-rong*
(College oAnimal Science, Qingdao Agricultural University, Shandong Qingdao 266109, China)

There is a relationship between the Insulin-like Growth Factor Binding Proteins (IGFBPs) and animals’growth and development. This research aimed to study the polymorphism oIGFBP3 and its relationship with pig growth characteristics. The method oPCR-RFLP was used to study the intron 2 oIGFBP3 of Landrace, Duroc and Landrace pigs. The inuence oIGFBP3 gene type to pig body length, body height, lean meat rate, backat, muscle thickness, 0～100 kg gain weight, 30～100 kg and 100 kg gain weight growth traits were analyzed. The results showed that there were 417 bps for the intron 2 of IGFBP3, and the polymorphism oA307G aected the pig growth. The three pigs with IGFBP3 gene heterozygous AG genotype were dominant. Duroc and Landrace were deviatedrom Hardy-Weinberg one quilibrium at thesite (P＜0.01). The IGFBP3 gene PIC showed moderate polymorphism in the three varieties opig (0.34～0.37). The GG genotype of IGFBP3 gene had greatly inuence in the body height (P=0.068) and lean meat rate (P=0.058) in large white. It had greatly inuenced in the lean meat rate (P=0.099) and muscle thickness (P=0.079) oDuroc. The eect to weight gain at 0-100 kg were close to signicant level in Landrace (P=0.08). This is showed that the GG genotype pig had the characteristics ohigher body height andaster growth. It could suer a suggestionor pig genetics and breeding.

Pig; IGFBP3; PCR-RFLP; Association analysis

S828.2

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-07-044

2016-10-12；

2017-02-11

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（SDAI T-08-13）

宋玉芹（1965-），女，山東招遠(yuǎn)人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)，E-mail: songyuqin65@126.com

* 通訊作者：張廷榮（1962-），男，山東安丘人，教授，研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種，E-mail: zhangtr2006@126. com