趙靜苗，胡繼宏，王秋萍

·論著·

·中醫(yī)·中西醫(yī)結(jié)合研究·

黃芪甲苷誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的研究

趙靜苗，胡繼宏*，王秋萍

目的 探討黃芪甲苷(AST)誘導(dǎo)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)向心肌樣細(xì)胞分化的作用。方法 對(duì)第2代BMSCs進(jìn)行傳代培養(yǎng)，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)不同濃度AST在24、48、72 h時(shí)對(duì)BMSCs的增殖作用。取第4代BMSCs分為BMSCs組、5-氮雜胞苷組(5-AZA組)和AST組，5-AZA組和AST組分別加入濃度為10 μmol/L的5-AZA和濃度為100 μmol/L的AST誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)，采用熒光倒置相差顯微鏡觀察誘導(dǎo)后各組細(xì)胞的形態(tài)變化。通過(guò)Real-time qPCR法檢測(cè)誘導(dǎo)后各組結(jié)蛋白(Desmin)、α橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-SCA)、肌鈣蛋白I(cTnI)mRNA表達(dá)水平；采用Western blotting法檢測(cè)各組肌鈣蛋白T(cTnT)表達(dá)水平。結(jié)果 100 μmol/L AST亞組孔72 h時(shí)BMSCs增殖情況好于24、48 h時(shí)及其他濃度AST亞組孔各時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)。熒光倒置相差顯微鏡觀察顯示AST體外誘導(dǎo)SD大鼠BMSCs形態(tài)分化類(lèi)似心肌樣細(xì)胞。5-AZA組、AST組Desmin、α-SCA、cTnI mRNA表達(dá)水平表達(dá)高于BMSCs組(P<0.05)，且AST組以上蛋白mRNA表達(dá)水平高于5-AZA組(P<0.05)。與BMSCs組組比較，5-AZA組和AST組cTnT表達(dá)水平升高(P<0.05)；與5-AZA組比較，AST組cTnT表達(dá)水平下降(P<0.05)。結(jié)論 濃度為100 μmol/L的AST作用72 h時(shí)能夠在體外誘導(dǎo)BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化，但分化效果弱于5-AZA。

肌細(xì)胞,心臟；細(xì)胞分化；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；黃芪甲苷

趙靜苗，胡繼宏，王秋萍.黃芪甲苷誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2017，20(21)：2635-2639.[www.chinagp.net]

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急性心肌梗死(AMI)是目前全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生命的重大疾病之一，我國(guó)AMI發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)[1]。心肌梗死后心肌細(xì)胞缺血壞死導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少、心肌纖維化，進(jìn)而導(dǎo)致心室重構(gòu)，使得心力衰竭的發(fā)生率和病死率增高[2]。近年來(lái)許多研究者將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞以修復(fù)梗死區(qū)的心肌細(xì)胞從而改善心臟功能，重建心肌結(jié)構(gòu)[3-6]。5-氮雜胞苷(5-AZA)為誘導(dǎo)BMSCs分化為心肌樣細(xì)胞的有效化學(xué)制劑,但其具有細(xì)胞毒性,所以尋找更加有效、安全的誘導(dǎo)劑成為重要問(wèn)題[7]。黃芪是傳統(tǒng)的益氣類(lèi)中藥，具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、斂瘡生肌、補(bǔ)中益氣等功效；現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí),黃芪甲苷(AST)具有強(qiáng)心、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、保護(hù)組織器官、抗細(xì)胞凋亡和抗感染等藥理作用[8-9]。本研究探討了AST誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞分化的可能性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 第2代SD大鼠BMSCs(購(gòu)自北京醫(yī)科利昊生物科技有限公司)，DMEM培養(yǎng)基(500 ml，購(gòu)自HyClone公司)，胎牛血清(500 ml，購(gòu)自HyClone公司)，AST(購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司，中國(guó)食品藥品檢定研究院批號(hào)：110781-200613)，5-AZA、M-MLV(購(gòu)自Promega公司)，Oligo(dT)纖維素〔購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司〕，Bulge-LoopTMmiRNA qPCR Primer set(購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司)，Rnase Inhibitor(購(gòu)自Promega公司)，SYBR Master Mixture(購(gòu)自TAKARA公司)、Primer(購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司)，RIPA強(qiáng)裂解液(購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，二甲基亞砜(DMSO，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司)Prestained Protein Marker(購(gòu)自美國(guó)Thermo公司)，4×蛋白上樣緩沖液(購(gòu)自Solarbio公司)，ECL-PLUS/kit(購(gòu)自美國(guó)Thermo公司)，兔單克隆抗體Nesprin1、小鼠單克隆抗體肌鈣蛋白T(cTnT)及肌鈣蛋白I(cTnI)(購(gòu)自英國(guó)Abcam公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(SANYO)、熒光倒置相差顯微鏡(Olympus)、Nanodrop 分光光度計(jì)(Thermo 2000/2000c)、穩(wěn)壓電泳儀(上海天能EPS-600)、超細(xì)勻漿機(jī)(FLUKO公司F6/10)、Real-time PCR儀器(Agilent公司 MX3000p)、酶標(biāo)分析儀(北京普朗公司DNM-9602A型)、低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Kontront-42K)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 SD大鼠BMSCs的培養(yǎng)與傳代 第2代BMSCs培養(yǎng)：常規(guī)滅菌，打開(kāi)培養(yǎng)瓶，放入原代細(xì)胞，在培養(yǎng)瓶中加入完全培養(yǎng)基(含20%胎牛血清)，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，48 h后首次換液，以后每隔3 d更換1次培養(yǎng)液，2周后細(xì)胞長(zhǎng)滿80%瓶底可傳代。BMSCs的傳代培養(yǎng)：將第2代BMSCs瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液棄去，加入PBS沖洗2次，以除去培養(yǎng)液中的血清，加入2 ml胰酶蛋白消化細(xì)胞，采用熒光倒置相差顯微鏡進(jìn)行觀察，控制消化時(shí)間(2～3 min)。細(xì)胞收縮變圓時(shí)，立即加入含少量血清的培養(yǎng)液終止消化,用彎頭吸管輕輕吹打細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，800 r/min離心5min(離心半徑12.5 cm)，棄上清液。加入完全培養(yǎng)液充分吹打成單細(xì)胞懸液，按1∶3傳代接種于75 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，待細(xì)胞鋪滿瓶底后依上法繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.3.2 篩選AST對(duì)BMSCs增殖的最佳作用濃度及時(shí)間 采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)AST對(duì)BMSCs的增殖作用。將AST的濃度設(shè)為50、100、200、400 μmol/L及24、48、72 h時(shí)間段。取第4代BMSCs，調(diào)整濃度為1×106/100 μl，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液吹打混勻成細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔接種量為100 μl，邊緣用無(wú)菌PBS填充，設(shè)置調(diào)零孔(無(wú)血清培養(yǎng)基)、對(duì)照孔(不加AST的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞)及50、100、200、400 μmol/L亞組孔，每孔每板設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，各孔加入無(wú)菌MTT溶液20 μl，放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清液，加入150 μl的DMSO，置搖床低速震蕩10 min后，于酶標(biāo)儀下490 nm處測(cè)量各孔的吸光度值(即BMSCs增殖情況)。

1.3.3 BMSCs的誘導(dǎo)分化 取第4代BMSCs進(jìn)行分組：空白對(duì)照組(BMSCs組)、5-AZA組、AST組進(jìn)行誘導(dǎo)。BMSCs組加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)；5-AZA組加入濃度為10 μmol/L的5-AZA，誘導(dǎo)24 h；AST組加入濃度為100 μmol/L的AST誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)72 h。每3 d更換1次完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，4周后對(duì)分化的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察以及分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.3.4 采用Real-time qPCR檢測(cè)結(jié)蛋白(Desmin)、α橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-SCA)、cTnI mRNA表達(dá)水平 提取總蛋白，800 r/min離心5 min(離心半徑12.5 cm)，去上清液，細(xì)胞沉淀中加入1 ml Trizol，充分混勻后室溫靜止5 min，然后轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml專(zhuān)用EP管中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA：將2 μl反轉(zhuǎn)錄引物(0.5 μg/μl)和2.0 μg 總RNA加入到無(wú)酶管中，補(bǔ)充Rnase-free water至10 μl；混勻后800 r/min離心5 min (離心半徑12.5 cm)，70 ℃溫浴10 min；后立即置于冰水混合物中冰浴，使反轉(zhuǎn)錄引物和模板退火；在上述混合物中，按以下的比例配制反應(yīng)體系(冰上進(jìn)行)混勻，800 r/min離心5 min(離心半徑12.5 cm)；在42 ℃水浴反應(yīng)1 h，然后再70 ℃水浴10 min使反轉(zhuǎn)錄酶失活；將得到的cDNA置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

注：-表示無(wú)此項(xiàng)目；Desmin=結(jié)蛋白，α-SCA=α橫紋肌肌動(dòng)蛋白，cTnI=肌鈣蛋白I

1.3.5 采用Western blotting法檢測(cè)各組誘導(dǎo)分化后cTnT的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌3次后，將細(xì)胞重懸于裂解液中，冰浴30 min，使細(xì)胞充分裂解。4 ℃、12 000 r/min離心10 min(離心半徑12.5 cm)，收集上清液，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。各組取等量蛋白質(zhì)，經(jīng)5%、12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，封閉后，與一抗結(jié)合，4 ℃搖床過(guò)夜；TBST洗滌后與二抗結(jié)合反應(yīng)，同上洗滌。用ECL發(fā)光顯色后，在凝膠成像系統(tǒng)上曝光檢測(cè)，采用Quantity One 4.6.2軟件對(duì)圖像進(jìn)行光密度分析，以GAPDH作為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1AST對(duì)BMSCs增殖的最佳作用濃度及時(shí)間分析 50μmol/LAST亞組孔與在24、48、72h時(shí)BMSCs增殖情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；100μmol/LAST亞組孔在24、48、72h時(shí)BMSCs增殖情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且100μmol/LAST亞組孔72h時(shí)BMSCs增殖情況好于24、48h時(shí)及其他亞組孔各時(shí)間點(diǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。

2.2 誘導(dǎo)分化后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 誘導(dǎo)分化4周后，BMSCs組細(xì)胞形態(tài)多呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞數(shù)量較多、密集分布，培養(yǎng)液中有少量凋亡細(xì)胞懸浮(見(jiàn)圖1A)；5-AZA組細(xì)胞體積增大，性狀類(lèi)似“肌島樣”結(jié)構(gòu)，部分細(xì)胞出現(xiàn)首尾相接的情況(見(jiàn)圖1B)；AST組細(xì)胞數(shù)量較多，呈束狀排列，成簇生長(zhǎng)(見(jiàn)圖1C)。

2.3 誘導(dǎo)后各組Desmin、α-SCA、cTnImRNA表達(dá)水平比較 3組Desmin、α-SCA、cTnImRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與BMSCs組比較，5-AZA組和AST

表2 對(duì)照孔和AST孔不同時(shí)間點(diǎn)BMSCs增殖情況比較

注：與50 μmol/L亞組孔比較，aP<0.05；與200 μmol/L亞組孔比較，bP<0.05；與400 μmol/L亞組孔比較，cP<0.05；與100 μmol/L亞組孔24 h比較，dP<0.05；與100 μmol/L亞組孔48 h比較，eP<0.05；AST=黃芪甲苷

注：A為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)組，B為5-氮雜胞苷(5-AZA)組，C為黃芪甲苷(AST)組

圖1 熒光倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化

Figure 1 Morphological changes in BMSCs in the BMSCs group,5-AZA group and AST group observed by phase contrast fluorescence inverted microscopy

組的Desmin、α-SCA、cTnI mRNA表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與5-AZA組比較，AST組的Desmin、α-SCA、cTnI mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表3)。

2.4 誘導(dǎo)后各組cTnT表達(dá)水平比較 BMSCs組、5-AZA組、AST組cTnT表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與BMSCs組比較，5-AZA組和AST組cTnT表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與5-AZA組比較，AST組cTnT表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖2、表4)。

Table 3 Expression levels of Desmin mRNA,α-SCA mRNA and cTnI mRNA in BMSCs group,5-AZA group and AST group measured by Real-time qPCR

組別DesminmRNAα-SCAmRNAcTnImRNABMSCs組1.00±0.001.00±0.001.00±0.005-AZA組1.59±0.56a1.24±0.01a1.11±0.03aAST組1.77±0.38ab1.96±0.08ab1.37±0.20abF值41.6464.4918.52P值0.0320.0300.030

注：與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)組比較，aP<0.05；與5-氮雜胞苷(5-AZA)組比較，bP<0.05

注：cTnT=肌鈣蛋白T

圖2 誘導(dǎo)后各組cTnT蛋白水平表達(dá)

Figure 2 Expression levels of cTnI protein in the BMSCs group,5-AZA group and AST group detected by Western blotting

Table4ExpressionlevelsofcTnIintheBMSCsgroup,5-AZAgroupandASTgroupdetectedbyWesternblotting

組別cTnTBMSCs組0.09±0.055-AZA組0.67±0.10aAST組0.21±0.05abF值129.29P值<0.01

注：與BMSCs組比較，aP<0.05；與5-AZA組比較，bP<0.05；cTnT=肌鈣蛋白T

3 討論

心肌梗死之后修復(fù)壞死的心肌、改善心肌功能是心肌梗死治療的關(guān)鍵所在。BMSCs是存在于骨髓基質(zhì)中的非造血系的成體干細(xì)胞，具備向多種細(xì)胞分化的能力[10-12]。體外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，加入適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑，可以使BMSCs定向分化為心肌樣細(xì)胞[13-14]。5-AZA是目前最常用也是被公認(rèn)的最有效的誘導(dǎo)劑，但對(duì)細(xì)胞有一定的毒性作用[15-17]。因此，如何提高誘導(dǎo)分化的效率或?qū)ふ倚碌恼T導(dǎo)分化因子，建立更加完善的誘導(dǎo)分化體系是目前醫(yī)學(xué)研究的迫切需要。黃芪是傳統(tǒng)的益氣類(lèi)中藥，具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、斂瘡生肌等功效，黃芪主要活性成分AST具有良好的強(qiáng)心作用，對(duì)缺血心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，能有效保護(hù)缺氧的心肌細(xì)胞，降低損傷程度，且對(duì)心肌肥大具有抑制作用[18]。

既往研究表明，Desmin、α-SCA、cTnI及cTnT作為心肌細(xì)胞分化的早期標(biāo)志物已得到了公認(rèn)，是目前特異性檢測(cè)心肌細(xì)胞應(yīng)用最普遍的指標(biāo)[19]。本研究結(jié)果顯示，AST在100 μmol/L濃度下作用72 h時(shí)對(duì)BMSCs增殖的作用最佳；熒光倒置相差顯微鏡觀察顯示，AST組BMSCs呈束狀排列，成簇狀生長(zhǎng)，說(shuō)明AST體外誘導(dǎo)SD大鼠BMSCs形態(tài)分化類(lèi)似心肌樣細(xì)胞；MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，AST組Desmin、α-SCA、cTnI mRNA表達(dá)水平高于5-AZA組和BMSCs組；BMSCs組cTnT表達(dá)水平最低，AST組cTnT表達(dá)水平低于5-AZA組，表明AST能夠誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞分化，但促分化效果弱于5-AZA，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[20]。

綜上所述，AST能夠誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞分化，具有效果顯著、作用確切等特點(diǎn)，符心血管疾病防治要求，有良好的應(yīng)用推廣價(jià)值。

作者貢獻(xiàn)：趙靜苗進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，文獻(xiàn)資料收集、整理文章的可行性分析、撰寫(xiě)論文、對(duì)文章整體負(fù)責(zé)；趙靜苗、王秋萍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，趙靜苗、胡繼宏進(jìn)行論文的修訂，英文的修訂，文章的質(zhì)量控制及審校，監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：趙躍翠)

Astragaloside Effect on the Differentiation of Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Cardiomyogenic Cells in Vitro

ZHAOJing-miao,HUJi-hong*,WANGQiu-ping

GansuKeyLaboratoryforthePreventionandTreatmentofMajorDiseasesbyMolecularMedicineandChineseMedicine,GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000，China

*Correspondingauthor:HUJi-hong,Associateprofessor；E-mail：hujihonghappy@163.com

Objective To investigate the astragaloside(AST) effect on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) into cardiomyogenic cells in SD rats.Methods BMSCs were subcultured on behalf of BMSCs.The proliferation of BMSCs was detected by MTT assay at 24,48,72 h after the inducing with different concentrations of AST.The 4th generation of BMSCs were divided into BMSCs group,5-azacytidine group(5-AZA group) and AST group,cultured with the culture medium with 10% fetal bovine serum,the culture medium with 10 μmol/L 5-AZA,and the culture medium with 100 μmol/L AST,respectively.Morphological changes of BMSCs were observed by phase contrast fluorescence inverted microscopy.The expression levels of Desmin mRNA,α-Sarcomeric actin(α-SCA) mRNA and troponin(cTnI) mRNA in the BMSCs group,5-AZA group and AST group were measured by Real-time qPCR,and the expression levels of cTnT in these three groups were detected by western blotting.Results The proliferation of BMSCs was the best when they were induced for 72 h by AST at the concentration of 100 μmol / L(P<0.05).Morphological differentiation of BMSCs induced by AST in vitro was similar to that of cardiomyogenic cells.The BMSCs group had lower expression levels of Desmin mRNA,α-SCA mRNA and cTnI mRNA than 5-AZA group and AST group(P<0.05).Compared with 5-AZA group,the expression levels of Desmin mRNA,α-SCA mRNA and cTnI mRNA in AST group were higher(P<0.05).5-AZA group and AST group had higher cTnT expression levels than the BMSCs group(P<0.05).Compared with 5-AZA group,AST group had lower expression levels of cTnT(P<0.05).Conclusion The differentiation of BMSCs into cardiomyogenic cells in vitro can be promoted after being induced by AST with a concentration of 100 μmol/L for 72 hours,but the induction effect of AST is weaker than 5-AZA.

Myocytes,cardiac；Cell differentiation；Bone marrow mesenchymal stem cells;Astragaloside

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260597)

R 329.21

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.05.y11

2017-02-20；

2017-05-10)

730000甘肅省蘭州市，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)甘肅重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

*通信作者：胡繼宏，副教授；E-mail：hujihonghappy@163.com