郭詩哲孫亞英劉少華陳世益陳疾忤

1復旦大學附屬華山醫(yī)院內(nèi)分泌科，復旦大學內(nèi)分泌糖尿病研究所（上海200040）2復旦大學附屬華山醫(yī)院運動醫(yī)學科（上海200040）

柚皮素抑制小鼠骨骼肌急性鈍挫傷后纖維化

郭詩哲1孫亞英2劉少華2陳世益2陳疾忤2

1復旦大學附屬華山醫(yī)院內(nèi)分泌科，復旦大學內(nèi)分泌糖尿病研究所（上海200040）2復旦大學附屬華山醫(yī)院運動醫(yī)學科（上海200040）

目的：了解腹腔注射SMAD3抑制劑柚皮素對小鼠骨骼肌急性鈍挫傷后纖維化的影響。方法：72只7～8周齡C57bl/6小鼠（20～24 g）隨機分為4組，每組18只。包括正常對照組（A組）、普通損傷組（B組）、損傷后二甲基亞砜（DMSO）注射組（C組）、損傷后柚皮素注射組（D組）。B、C、D三組均用自制打擊裝置制造右側(cè)脛骨前肌中段急性鈍挫傷模型；C、D組分別腹腔注射單純DMSO溶液、柚皮素DMSO溶液，1次/天，直至傷后28天取材。所有小鼠處死取材后，Western Blot方法檢測4組小鼠右脛骨前肌SMAD3、pSMAD3、CollagenⅠ、α-SMA的表達；HE及Masson染色評估脛骨前肌的組織學變化；電生理學方法檢測各組小鼠脛骨前肌快速顫搐收縮和強直收縮能力，以了解小鼠損傷骨骼肌力學性能恢復情況。結(jié)果：1）B、C、D組所有損傷后小鼠骨骼肌中SMAD3表達均高于A組，B、C組pSMAD3表達升高，D組SMAD3以及pSMAD3的表達低于B、C組；2）B、C、D組中CollagenⅠ與α-SMA水平高于A組，但D組的CollagenⅠ與α-SMA水平低于B、C組；3）HE染色發(fā)現(xiàn)，損傷骨骼肌中間質(zhì)較正常組增多，Masson染色證實B、C、D組急性鈍挫傷后骨骼肌出現(xiàn)明顯纖維化，但D組的骨骼肌纖維化面積顯著低于B組和C組；4）損傷后骨骼肌快速顫搐收縮與強直收縮能力顯著下降，但D組明顯優(yōu)于B、C組。結(jié)論：SMAD3抑制劑柚皮素可抑制骨骼肌損傷后的SMAD3磷酸化水平，改善纖維化，減輕疤痕生成，從而促進骨骼肌損傷修復，提高骨骼肌損傷后的愈合質(zhì)量。

骨骼肌；鈍挫傷；纖維化；柚皮素；SMAD3

急性骨骼肌損傷在運動損傷中常見。損傷骨骼肌有強大的自我修復能力，但纖維沉積的速度要快于肌肉再生，故損傷后期纖維化不可避免[1]。伴有纖維化的骨骼肌的生物力學特性較差，容易發(fā)生再次損傷，從而影響運動能力[2]。當前臨床上的治療辦法普遍集中于肌肉損傷及出現(xiàn)纖維化后減小纖維化對肌肉特性的影響，如拉伸或康復鍛煉，并不能從根本上減少細胞外膠原沉積以及纖維化的過程，故治療效果有限[3]。

轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）在骨骼肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[4]?，F(xiàn)已證明，TGF-β1可促進其下游蛋白SMAD3的磷酸化，從而上調(diào)細胞外基質(zhì)Col?lagenⅠ與間質(zhì)細胞標志物α-SMA的表達[5]。有研究顯示，與正常小鼠相比，在經(jīng)過致病因素誘導后，缺乏SMAD3蛋白的小鼠中受損組織纖維化程度降低[6]。因而若能夠干擾SMAD3的表達或磷酸化，則可能起到改善骨骼肌纖維化的作用。

柚皮素是近年來從葡萄柚中提取出來的一種成分，具有多種藥理作用，如抗炎、抗纖維化、保護血管內(nèi)皮等作用[7]。研究顯示，在TGF-β/SMAD纖維化信號通路中，柚皮素可以特異性抑制SMAD3表達以及磷酸化，從而削弱因該信號通路所導致的纖維化[8]。目前，尚缺乏柚皮素在骨骼肌損傷中的應用研究。本實驗利用柚皮素治療小鼠急性骨骼肌鈍挫傷，以期減輕骨骼肌纖維化，改善受損骨骼肌的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及造模

7～8周齡雌性C57bl/6小鼠共72只（體重20～24 g），由中國科學院上海實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（滬）2009—0019。按國家標準嚙齒類動物飼料飼養(yǎng)于復旦大學動物實驗部。自由攝食飲水。動物房溫度約22℃。相對濕度約50%。

將72只小鼠隨機分成4組，每組18只，即正常對照組（A組）、普通損傷組（B組）、損傷后DMSO注射組（C組）、損傷后柚皮素注射組（D組）。我們采用成熟的骨骼肌鈍挫傷造模方法對實驗小鼠造成骨骼肌鈍挫傷[9]。用重物高空垂直下落法造成打擊傷，損傷部位為小鼠右脛骨前肌中段。打擊前用1%水合氯醛（3 ml／100g）腹腔注射麻醉小鼠，然后將小鼠后肢于伸膝、踝背屈90°位置上進行固定，致傷物為一裝有一定量水的50 m l離心管。打擊面半徑約為0.2 cm，打擊物質(zhì)量為55.7 g，從33 cm高空垂直下落。B、C、D組小鼠在接受重物打擊傷造模后，自傷后第1天開始，C、D組分別腹腔注射1%二甲基亞砜（DMSO）溶液、柚皮素溶液（將純度95%的柚皮素溶解于1%DMSO溶液中，配置成飽和溶液。柚皮素腹腔注射量為0.2 mg/100 g[10]），柚皮素購于上海古朵生物公司。注射頻率為1次/天，直至傷后第28天[10]。72只小鼠飼養(yǎng)28天內(nèi)，所有小鼠飲食活動未出現(xiàn)明顯異常，無小鼠死亡。

1.2 取材及處理

所有小鼠在傷后第28天頸椎脫臼法處死。每組小鼠隨機挑選6只，然后立即切開小腿皮膚，切取右側(cè)完整的脛骨前肌標本，保存于10%中性福爾馬林中，固定3天后脫水處理并石蠟包埋，進行組織學檢測；隨機挑選6只，取右側(cè)脛骨前肌保存于液氮中，用于West?ern Blot檢測；剩余6只小鼠取雙側(cè)脛骨前肌用于生理學檢測。

1.3 檢測方法

1.3.1 Western n B B l l o o t t檢測

取出液氮中保存的小鼠肌肉組織，使用無菌手術(shù)刀于干冰上切取150 mg大小，置于1.5 ml無菌離心管，加入0.5 ml 4°C預冷的蛋白裂解液。用剪刀剪碎組織后，用電動勻漿器進行組織勻漿，后應用超聲波細胞粉碎器裂解組織中的蛋白。4℃，12000 rpm離心30 min后取上清液測蛋白濃度，加入5 X Loading buffer變性蛋白，100°C煮沸5分鐘。后將蛋白樣品置于SDSPAGE電泳分離，轉(zhuǎn)PVDF膜。用5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉PVDF膜1小時，加入一抗SMAD3（美國San?ta Cruz公司），pSMAD3（美國Santa Cruz公司），Colla?genⅠ（ColⅠ）（美國abcam公司），α-SMA（美國ab?cam公司），以及GAPDH（美國Cell Signaling Technolo?gy），用TBST稀釋。4°C過夜。洗膜后加入二抗（美國Cell Signaling Technology）在常溫下反應1小時后，ECL發(fā)光法檢測各個蛋白表達。Western結(jié)果重復3遍。用Image J軟件對各個條帶灰度值進行半定量分析。將各組間目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值進行比較，最終確定Western Blot結(jié)果是否存在顯著差異。

1.3.2 組織學檢測

取包埋脛骨前肌的蠟塊，于肌肉中間部分垂直于纖維方向切片，切片層厚10μm，每個骨骼肌標本取6張切片，隨后各取3張切片分別按HE染色（南京建成生物工程研究所有限公司）和Masson染色試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）說明書操作進行染色。用光學顯微鏡（IX71SBF2，日本奧林帕斯公司）觀察，用DP72軟件（日本奧林帕斯公司）采集照片。每張切片在200倍鏡下隨機觀察3個視野，記錄并比較各組小鼠纖維化（膠原）面積/總面積的比值差異。

1.3.3 生理學檢測

將雙側(cè)下肢脛骨前肌放入恒溫水浴槽中，并浸泡于Krebs液（NaCI 113、KCl 4.7、CaCl21.25、Mg2S04 1.2、KH2P04 1.2、NaHCO325.0、葡萄糖11.5，單位mmol/L）中，將肌纖維一端固定于水浴槽底部，另外一端固定于張力傳感器上，再將信號傳輸至生物信號采集處理系統(tǒng)儀器。測試前先調(diào)試機器，然后將肌肉調(diào)整至最適初長度，初始張力為20 mN，平衡20 min后，電刺激脛骨前肌。記錄雙側(cè)肌肉的快速顫搐收縮和強直收縮力，取其平均值，然后計算損傷側(cè)肌力與健側(cè)肌力的比值，以減小個體差異及操作誤差對結(jié)果的影響。最終，以對照組肌肉收縮力百分比對各組肌力百分比進行標化，比較各組間比值的差異。

1.4 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。采用單因素方差分析對各組間數(shù)據(jù)進行比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。當出現(xiàn)統(tǒng)計學意義時，應用圖基事后檢驗（post hoc turkey test）對各組進行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 Western n B B l l o o t t結(jié)果

Western Blot結(jié)果（圖1）顯示，與A組相比，B組和C組的SMAD3、pSMAD3水平增高（P＜0.01，P＜0.001），纖維化標志物ColⅠ以及α-SMA也明顯增高（P＜0.05，P＜0.001），而D組的SMAD3、pSMAD、α-SMA以及ColⅠ水平均有所增高但無統(tǒng)計學意義。D組骨骼肌的SMAD3和pSMAD3蛋白表達均低于B、C組兩組小鼠（P＜0.05，P＜0.05）。我們進一步驗證了纖維化標志物ColⅠ以及α-SMA的表達變化并發(fā)現(xiàn)，D組顯著低于B組和C組（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），說明對鈍挫傷小鼠進行柚皮素注射可改善受損骨骼肌的纖維化程度。

圖1 各組W estern Blot結(jié)果比較

2.2 組織學檢測結(jié)果

與對照組相比，HE染色結(jié)果顯示，損傷后小鼠骨骼肌中均出現(xiàn)不同程度的間質(zhì)增多，間質(zhì)中出現(xiàn)細胞核呈梭形的成纖維細胞，并有少量炎癥細胞聚集（圖2，①～④）。Masson染色結(jié)果進一步顯示，經(jīng)過鈍挫傷造模的三組小鼠受損的骨骼肌標本中，骨骼肌纖維間均出現(xiàn)膠原纖維沉積。但與B、C兩組小鼠相比，D組小鼠的骨骼肌膠原纖維沉積更少（圖2，⑤～⑧）。對Mas? son染色結(jié)果進行定量分析顯示（圖2，⑨），與A組（1.44%±1.07%）相比，B、C、D組的骨骼肌標本中纖維化面積顯著增高（B組35.22%±7.81%，P＜0.001；C組36.56%±6.73%，P＜0.001；D組9.11%±2.77%，P＜0.05），但D組小鼠肌肉中纖維化面積顯著低于B組（P＜0.001）和C組（P＜0.001）。

圖2 各組組織學檢測結(jié)果比較（比例尺：100μm）

2.3 生理學檢測結(jié)果

通過比較各組間肌肉的收縮特性（圖3），我們發(fā)現(xiàn)，與A組的快速顫搐收縮（100%±5.43%）和強直收縮能力（100%±4.83%）相比，受損傷各組肌肉的快速顫搐收縮（B組49.25%±10.26%，P＜0.001；C組48.5%±8.38%，P＜0.001；D組73.63%±8.41%，P＜ 0.001）與強直收縮能力（B組60.38%±10.80%，P＜0.001；C組61.13%±9.70%，P＜0.001；D組78.5± 8.72，P＜0.001）均有顯著下降，但D組的骨骼肌收縮特性顯著優(yōu)于B組（快速顫搐，P＜0.001；強直收縮，P＜0.01）和C組（快速顫搐，P＜0.001；強直收縮，P＜0.01）。

圖3 各組生理學檢測結(jié)果比較

3 討論

作為經(jīng)典TGF-β信號通路的一個重要組成部分，SMAD3蛋白是一種受體型SMAD蛋白。在TGF-β受體被激活后，活化的TGF-βI型受體募集SMAD2與SMAD3蛋白結(jié)合，在SMAD4的輔助下入核[11]。體內(nèi)正常生理狀況下，SMAD7與SMAD3競爭性結(jié)合TGF-βI型受體，起到抑制SMAD3活化入核的作用[12]。現(xiàn)已明確，SMAD3在細胞外基質(zhì)的表達中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。與正常小鼠相比，在缺失SMAD3基因的小鼠中，各種致病因素所致的各臟器纖維化均有不同程度的減輕[13-15]。故通過干預SMAD3的表達可起到抑制纖維化的作用。目前對SMAD3的調(diào)控可分為直接抑制SMAD3蛋白表達[16]，或通過上調(diào)SMAD7表達來減少SMAD3的磷酸化[17]，以及通過抑制SMAD4表達來減少SMAD3入核[18，19]，間接減輕SMAD3對細胞外基質(zhì)蛋白的上調(diào)作用。

本課題組曾就TGF-β/Smad信號通路在骨骼肌纖維化中的作用進行了研究，并發(fā)現(xiàn)對Smad4進行干預可在體外及體內(nèi)水平抑制鈍挫傷所致的骨骼肌纖維化[18，19]。由于Smad4參與輔助Smad3入核，但并不調(diào)控細胞外基質(zhì)相關(guān)物質(zhì)的表達，故該研究中我們將干預纖維化的靶點鎖定在了能夠促進纖維化相關(guān)蛋白質(zhì)表達的Smad3上。已有研究證明柚皮素可以通過抑制Smad3改善組織纖維化，我們通過Western Blot發(fā)現(xiàn)柚皮素降低了Smad3以及其活性形式pSmad3的蛋白水平，與前期研究成果一致。

進一步，我們研究了各組間纖維化指標水平的差異。Western Blot結(jié)果顯示，相較于損傷后未接受柚皮素干預的樣本，柚皮素干預后CollagenⅠ以及α-SMA的水平有明顯降低，纖維化程度減輕。作為纖維化的兩個重要標志物，CollagenⅠ是細胞外基質(zhì)的主要成分，而在TGF-β誘導的纖維化進程中，另一個重要的變化就是肌細胞向特異性表達α-SMA的肌成纖維細胞轉(zhuǎn)變[20]。因而分析α-SMA的變化有助于更全面了解柚皮素干預對受損骨骼肌的影響。此外，通過組織學分析，我們證實柚皮素干預后的損傷組織中膠原沉積顯著減輕，說明柚皮素緩解了急性鈍挫傷所致的骨骼肌纖維化。

作為骨骼肌的一個重要生理特性，其收縮能力是評價肌肉質(zhì)量的重要標準。我們發(fā)現(xiàn)，盡管損傷后各組骨骼肌的強直收縮能力與快速顫搐能力均有顯著下降，但柚皮素干預組的骨骼肌收縮能力有一定恢復，顯示柚皮素對骨骼肌的治療作用是確切的。

本研究的主要優(yōu)勢在于應用腹腔注射的方法對小鼠進行干預。盡管柚皮素為一種可以口服吸收的植物提取物，但為保證小鼠每日攝入的柚皮素劑量保持一致，我們并未采用其他研究所報道的將藥物溶于飲用水的方法對小鼠進行干預。此外，骨骼肌纖維化是一個動態(tài)的病理過程，損傷后即每日進行藥物注射可以達到對SMAD3的持續(xù)抑制作用，便于觀察與研究。

本實驗也存在一定缺陷。首先，纖維化進程并不是在骨骼肌損傷后即刻啟動，受損部位會先出現(xiàn)壞死組織吸收以及骨骼肌再生，故本實驗在小鼠骨骼肌受損后立即進行柚皮素干預，盡管保證了藥物可以在整個纖維化過程中均起到抑制作用，但也可能會對骨骼肌的再生產(chǎn)生影響。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，腎臟纖維化的改善程度與柚皮素劑量存在一定的關(guān)系[10]，故未來需進一步探究柚皮素劑量與骨骼肌纖維化程度的關(guān)聯(lián)。

4 結(jié)論

柚皮素治療小鼠骨骼肌急性鈍挫傷，可通過其對SMAD3的抑制作用，削弱TGF-β纖維化信號通路，從而減輕纖維化，改善骨骼肌的生理學特性。柚皮素是一種具有臨床應用價值的骨骼肌損傷纖維化治療藥物。

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Naringenin Inhibits SkeletalM uscle Fibrosisafter Acute Contusion in a M ouseM odel

Guo Shizhe1，Sun Yaying2，Liu Shaohua2，Chen Shiyi2，Chen Jiwu2
1Division ofEndocrinology and Metabolism，InstituteofEndocrinology and Diabetology，F(xiàn)udan University，Shanghai200040，China 2Division ofSportsMedicine，Huashan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai200040，China

Chen Jiwu，Email：jeevechen@gmail.com

Objectives To understand the effect of intraperitoneal injection of naringenin，a SMAD3 in?hibitor，on the skeletal muscle after acute contusion in a mouse model.M ethodsSeventy-two mice of 7-8 weeks old（20-24 g）were randomly divided into a control group，an acute contusion（B）group，an acute contusion+1%DMSO injection（C）group and an acute contusion+naringenin injection（D）group，each of 18.The acute contusion model was created by hitting the right tibialis anterior muscle in mice of all groups except the control group.Intraperitoneal injection of 1%DMSO and naringenin were given to group C and D respectively every day until execution，while the 18 mice in the control group were fed without injury or injection.The time of injury was set as Day 0.After being fed for 28 days，all mice were executed and the right tibialis anterior was harvested.Western blotting was used to de?tect the difference of SMAD3，pSMAD3，CollagenⅠ，andα-SMA expression among the 3 groups.Hema?toxylin-Eosin（HE）staining and Masson staining were used to detect the difference of pathological changes.Moreover，the appearance of fast twitch contraction and tetanic contraction were also document?ed to figure out the quality of the injured skeletal muscle.ResultsCompared with the control group，the SMAD3 and pSMAD3 level in injured skeletal muscle increased，but both were less in group D than group B and C.Similarly，the average level of CollagenⅠandα-SMA in all three injury groups was higher than the control group，but the level of these indexes were lower in group D than that in group B and C.HE staining showed more mesenchyme in injury groups than the control group.Mas?son staining found the upregulation of fibrosis in injured muscles，with the area of fibrosis in group D significantly lower than group B and C.Compared with control，the injured skeletal muscle had signifi?cantly poorer fast twitch and tetanic contraction performance，with the condition of group D significantly better than group B and C.Conculsion The naringenin，a SMAD3 inhibitor，mitigates the phosphoryla?tion of SMAD3 after acute contusion in a mouse model.The fibrosis and scar formation was alleviated，hence improving the healing of the injured skeletal muscles.

skeletal muscle，contusion，naringenin，fibrosis

2016.12.28

國家自然科學基金（81472142）

陳疾忤，Email：jeevechen@gmail.com