張雨笛嚴明俞立虹章思燁諸葛建穎郭健恒丁樑張云

1紹興文理學院醫(yī)學院（浙江紹興312000）2杭州電子科技大學生命信息與儀器工程學院（浙江杭州310018）

PI3K/Akt信號通路在磷酸三鈣磨損顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解中的作用

張雨笛1嚴明2俞立虹1章思燁1諸葛建穎1郭健恒1丁樑1張云1

1紹興文理學院醫(yī)學院（浙江紹興312000）2杭州電子科技大學生命信息與儀器工程學院（浙江杭州310018）

目的：研究PI3K/Akt信號通路在磷酸三鈣（tricalcium phosphate，TCP）磨損顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解中的作用。方法：36只雄性ICR小鼠隨機分為假手術(shù)組（Sham）、模型組（TCP）和LY294002處理組，每組12只。取TCP磨損顆粒30 mg置于顱頂后縫合皮膚構(gòu)建小鼠顱骨溶解模型。LY294002處理組小鼠于術(shù)后第2天顱頂局部注射PI3K抑制劑LY294002（5 mg·kg-1），每周3次；假手術(shù)組小鼠顱骨頂僅注射生理鹽水，注射時間與LY294002一致。2周后處死動物取骨膜和顱骨。通過Micro-CT分析小鼠顱骨溶解情況、骨密度（bone mineral density，BMD）和骨礦含量（bone mineral content，BMC）；HE染色觀察顱骨表面炎癥反應(yīng)及破骨細胞（osteoclasts）形成；Real-time PCR檢測骨組織中破骨細胞生成標志物抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）、組織蛋白酶K（cathepsin K，CstK）、核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB kigand，RANKL）和c-Fos的mRNA水平；ELISA檢測骨膜中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6等水平；Western Blotting檢測顱骨組織Akt、p-AktSer473和p-AktThr308等蛋白表達變化。結(jié)果：Micro-CT和組織形態(tài)學分析結(jié)果顯示，PI3K抑制劑LY294002能明顯抑制TCP磨損顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解和破骨細胞形成（P＜0.05），增加BMD和BMC含量（P＜0.05）；下調(diào)破骨細胞生成標志物TRAP、CstK、RANKL和c-Fos等mRNA水平（P＜0.05），并抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放（P＜0.05）；而且LY294002顯著減弱TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的Akt信號蛋白活化，導(dǎo)致p-AktS?er473和p-AktThr308等蛋白表達明顯下調(diào)（P＜0.05）。結(jié)論：PI3K/Akt信號通路參與調(diào)控TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解，可作為假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動的治療靶標。

磷酸三鈣（TCP）磨損顆粒；骨溶解；破骨細胞；PI3K/Akt信號通路

人工關(guān)節(jié)置換是目前治療嚴重關(guān)節(jié)疾患、重建關(guān)節(jié)功能的重要手段，但是長期使用關(guān)節(jié)假體，尤其是髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)假體晚期容易發(fā)生無菌性松動，導(dǎo)致人工關(guān)節(jié)置換失敗和關(guān)節(jié)翻修。新近假體翻修術(shù)回顧性研究發(fā)現(xiàn)聚乙烯、金屬鈦和陶瓷等關(guān)節(jié)假體經(jīng)過長期磨損產(chǎn)生大量的磨損顆粒，這些顆?？杉せ罴袤w周圍組織細胞釋放TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子[1，2]，誘導(dǎo)破骨細胞分化、活化，最終導(dǎo)致骨溶解和關(guān)節(jié)假體松動[3]。因此，磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解是關(guān)節(jié)假體晚期松動、關(guān)節(jié)置換失敗和二次翻修的主要原因，抑制假體周圍骨溶解是減少關(guān)節(jié)松動和置換失敗的重要手段。雖然對骨溶解已有較多研究，但是對其發(fā)生確切機制尚不明確。本研究采用磷酸三鈣（tricalcium phosphate，TCP）顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解模型，觀察PI3K的特異性抑制劑LY294002對TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解的影響，探討PI3K/Akt信號通路參與調(diào)控機理，為臨床防治骨溶解和關(guān)節(jié)松動提供新的治療靶標和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

6周齡SPF級雄性ICR小鼠36只，體重18～22 g，購于浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心，許可證號：SCXK（浙）2014-0001。所有實驗動物對待和照顧嚴格遵循《實驗動物管理條例》，并經(jīng)過紹興文理學院醫(yī)學院實驗動物倫理委員會許可。實驗前動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，環(huán)境溫度22°C～24°C，濕度50%～70%，動物自由進食進水，自然晝夜節(jié)律光照。

將36只小鼠隨機分為假手術(shù)組（Sham）、模型組（TCP）和LY294002處理組，每組12只。腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，無菌條件下取顱頂正中矢狀切口，長約0.8 cm。分離皮下組織，顯露出1 cm×1 cm顱骨區(qū)域。其中假手術(shù)組進行原位縫合，其余2組取TCP磨損顆粒30 mg置于顱頂后縫合皮膚[4]。LY294002組小鼠于術(shù)后第2天顱頂局部注射LY294002（5 mg·kg-1），每周3次。假手術(shù)組小鼠顱頂注射生理鹽水，注射時間與LY294002一致。2周后處死小鼠取骨膜和顱骨（以正中矢狀縫為中心的方形區(qū)域）。

1.2 主要試劑

TCP磨損顆粒（浙江大學化學系）；鱟試劑（上海吳昊經(jīng)貿(mào)有限公司）；TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒和ECL化學發(fā)光檢測試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）；LY294002、Trizol和RIPA裂解液（碧云天生物試劑有限公司）；TRAP、CstK、RANKL和c-Fos引物（上海生工生物工程公司）；兔源Akt抗體、兔源p-AktSer73抗體、兔源p-AktThr308抗體和小鼠源β-actin抗體（美國Cell Signaling公司）；PVDF膜（美國Millipore公司）。

1.3 T T C C P P磨損顆粒的準備

TCP磨損顆粒經(jīng)電鏡掃描顯示TCP磨損顆粒平均粒徑為1.997μm（90%＜3.2μm），顆粒容易發(fā)生[4]。將TCP磨損顆粒置于70%乙醇溶液，室溫震蕩浸泡48 h后去除乙醇。干燥后用30 mg玻璃紙分裝，將顆粒置于250°C恒溫箱中3 h。采用鱟試劑法檢測TCP磨損顆粒表面內(nèi)毒素含量小于該試劑盒的最低檢測線，即排除內(nèi)毒素污染。

1.4 測試指標與方法

1.4.1 Micr r o o--C C T T掃描與三維重建[[55]]

各組小鼠顱骨經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后，行Mi?cro-CT掃描（條件為電壓59 kV、電流167μA、深度16 bit、曝光時間295 ms，分辨率為9.18μm），選顱骨相同位置的感興趣區(qū)域（region of interest，ROI）進行三維重建。應(yīng)用Micview V2.1.2三維重建和ABA專用骨骼分析軟件定量分析骨溶解面積、骨密度（bone mineral densi?ty，BMD）和骨礦含量（bone mineral content，BMC）。

1.4.2 組織學觀察[[66]]

各組顱骨經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h，流水沖洗0.5 h，然后經(jīng)10%EDTA（pH 7.4）脫鈣2周，每3天更換1次脫鈣液。梯度乙醇脫水，石蠟包埋后，顱骨切片厚度為7μm。在梯度乙醇中脫水，二甲苯脫蠟后行HE染色，置于IX70顯微鏡觀察TCP磨損顆粒周圍破骨細胞生成情況。利用Image Pro-Plus 5.0（美國Media Cybernet?ics公司）計算正中矢狀縫區(qū)域三核及以上破骨細胞數(shù)（osteoclasts number）。

1.4.3 Real-tim m e e P P C C R R[[77]]

檢測骨組織中破骨細胞生成標志物抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）、組織蛋白酶K（cathepsin K，CstK）、核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB kigand，RANKL）和c-Fos的mRNA水平。每組隨機取3只小鼠，取等重量顱骨剪成1mm3碎片；加入液氮研磨成粉末后加Trizol（1 mL）按試劑盒說明書提取總RNA，測定260 nm/280 nm吸光比值在1.8～2.0之間。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以GADPH為內(nèi)參，對目的基因進行PCR擴增（7900HT Fast Real-time PCR，美國應(yīng)用系統(tǒng)公司），檢測模板Ct值進行相對定量，引物序列見表1。

表1 各靶基因及其引物序列

每組隨機選取3只小鼠，取等重量顱骨骨膜、剪碎后加入RIPA裂解液200μL，冰上裂解30 min。于4° C經(jīng)12000r/min離心15 min后收集上清液。每孔加入50μL上清液，按TNF-α、IL-1β和IL-6等ELISA試劑盒的操作說明書檢測骨膜中上述炎癥因子的變化。

1.4.5 骨組織蛋白的提取與Western Blot t t t i i n n g g檢測蛋白表達

每組隨機選取3只小鼠，取等重量顱骨于研缽內(nèi)液氮環(huán)境下研磨成粉末，置于EP管中。加入RIPA裂解液800μL冰上裂解30 min，于4°C經(jīng)12000 r/ming離心15 min后收集取上清液。采用BCA法檢測各組總蛋白濃度。加入上樣緩沖液后煮沸10 min，冷卻后每孔上樣30μg蛋白，進行15%SDS-PAGE電泳，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶常溫封閉2 h，分別加入Akt（1：1000）、p-AktSer473（1：1000）、p-AktThr308（1：1000）及β-actin（1：1000）等抗體后置于4°C孵育過夜。次日用TBST洗滌3次后加入HRP標記的二抗室溫孵育2 h，TBST清洗3次后加入ECL顯色液；通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各蛋白表達的變化。

1.5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，其中多個樣本間比較采用完全隨機設(shè)計的單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Micr r o o--C C T T分析

Micro-CT圖像顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠顱骨正中矢狀縫發(fā)生明顯骨溶解，而LY294002組骨溶解程度明顯減輕（圖1，P＜0.05）。定量分析結(jié)果表明模型組小鼠顱骨BMD和BMC顯著降低，分別減少為假手術(shù)組的46.9%±5.1%和43.4%±3.7%；顱頂局部注射LY294002能明顯增加BMD和BMC，分別為模型組的1.91±0.07倍和1.62±0.04倍（圖2，P＜0.05）。

圖1 M icro-CT掃描圖

圖2 M icro-CT分析小鼠顱骨參數(shù)的變化（n=4）

2.2 H H E E染色結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組破骨細胞數(shù)僅為4.2 ±0.7個，而TCP磨損顆粒植入后可誘導(dǎo)大量破骨細胞生成，其破骨細胞數(shù)增加為37.4±4.7個，是假手術(shù)組的4.78±0.07倍（P＜0.05）。而LY294002處理后顯著抑制破骨細胞生成，其破骨細胞數(shù)減少為13.6±2.0個（P＜0.05）（圖3）。

圖3 LY 294002阻止TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍破骨細胞生成（n=3）

2.3 Real-tim m e e P P C C R R檢測結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠顱骨組織中破骨細胞生成標志物TRAP、CstK、RANKL和c-Fos等mRNA水平顯著增加（表2，P＜0.05）。LY294002處理后骨組織中TRAP、CstK、RANKL和c-Fos等mRNA水平明顯下調(diào)，分別減少為模型組的46.8%±6.3%、48.8%± 4.2%、30.3%±3.6%和29.6%±1.9%（P＜0.05）。

表2 LY 294002下調(diào)假體周圍破骨細胞生成標志物m RNA水平（n=3）

2.4 E E L L I I S S A A檢測結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠顱骨骨膜炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平均明顯升高，分別增加為假手術(shù)組的1.79±0.13倍、2.12±0.24倍和4.92±0.40倍（表3，P＜0.05）。與模型組比較，LY294002組骨膜中TNF-α、IL-6和IL-1β含量水平顯著減少，僅為模型組的58.5%±6.1%、42.6%±2.8%和22.4%±2.0%（P＜0.05）。

表3 LY294002抑制TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6和IL-1β釋放（n=4）

2.5 Western Blot t t t i i n n g g檢測結(jié)果

對小鼠顱骨組織中Akt效應(yīng)分子即其磷酸化形式（p-Akt）水平檢測結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組骨組織中Akt蛋白發(fā)生活化，表現(xiàn)為p-AktThr308和p-AktSer473蛋白表達明顯升高，并呈一定的時間依賴性（圖4，P＜0.05）。與模型組比較，LY294002處理能顯著減弱TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的Akt活化，造成p-AktThr308和p-AktSer473表達明顯降低，分別減少為模型組的23.6%±3.1%和28.9%±1.8%（圖5，P＜0.05）。提示：TCP磨損顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解過程中PI3K/Akt信號通路被激活。

圖4 TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨組織Akt信號蛋白活化（n=4）

圖5 LY294002減弱TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的Akt蛋白活化（n=4）

3 討論

磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解是導(dǎo)致假體松動和關(guān)節(jié)置換失敗的主要原因之一。破骨細胞參與調(diào)控磨損顆粒介導(dǎo)的骨溶解，因此，抑制破骨細胞的活化和骨溶解是減少假體松動的重要手段。目前有關(guān)骨溶解發(fā)生機制研究多集中于NF-κB、MAPK和JAK/STAT等信號通路，而對于PI3K/Akt通路在磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解中的作用研究很少。本研究通過構(gòu)建TCP磨損顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解模型，通過Micro-CT分析和H.E.染色證實TCP磨損顆?？烧T導(dǎo)小鼠顱骨發(fā)生明顯的骨溶解和大量破骨細胞生成以及BMD和BMC顯著降低。而顱頂局部注射PI3K抑制劑LY294002能顯著抑制假體周圍骨溶解、破骨細胞生成及其活性，減少炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放，并減弱TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的Akt活化，表明PI3K/ Akt通路參與調(diào)控CP顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨溶解和破骨細胞生成。

有研究表明磨損顆?？烧T導(dǎo)假體周圍組織細胞生成大量TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子[1，2]，后者能誘導(dǎo)破骨細胞分化、活化及存活，最終造成骨溶解[3]。因此，炎癥是磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解的重要因素之一[2]。本研究應(yīng)用ELISA法檢測到TCP磨損顆?？烧T導(dǎo)TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的釋放，增加骨膜中TNF-α、IL-1β和IL-6水平，上調(diào)RANKL表達[8]，促進破骨細胞生成和骨吸收，與Lange[9，10]研究結(jié)果一致。LY294002處理后能顯著抑制TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的上述炎癥因子釋放，阻斷破骨細胞生成和骨溶解。因此，PI3K/Akt信號通路在TCP磨損顆粒誘導(dǎo)炎癥因子釋放過程中發(fā)揮重要的作用。

有研究認為炎癥因子不僅能直接或間接調(diào)節(jié)破骨細胞活性和骨吸收，而且其所觸發(fā)的下游PI3K/Akt信號通路也參與調(diào)控破骨細胞活化、成熟及遷移[11，12]，是炎癥性骨代謝疾病一個重要的治療靶點。炎癥因子可通過與受體結(jié)合并活化PI3K，后者通過PI3K依賴的激酶1（PDK1）激活其效應(yīng)分子Akt，使之發(fā)生活化（即磷酸化），促進破骨細胞存活與骨吸收[13]。Huang[14]等利用siRNA干擾PI3K的p110β基因，發(fā)現(xiàn)下調(diào)該基因可顯著減少磨損顆粒誘導(dǎo)的TNF-α釋放和骨溶解。Green?field[15]等研究小組也報道敲除PI3Kγ基因能減少金屬鈦和聚乙烯磨損顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨溶解反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示TCP磨損顆粒植入小鼠顱頂后骨組織Akt信號分子發(fā)生活化，導(dǎo)致p-AktSer473和p-AktThr308蛋白表達水平明顯增加；而LY294002干預(yù)能明顯抑制上述Akt的活化，與Huang[14]和Greenfield[15]報道基本一致。

4 結(jié)論

PI3K/Akt信號通路參與調(diào)控TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解，抑制該通路可減少假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動，可作為假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動新的干預(yù)和治療靶點。

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Roleof PI3K/Akt Signaling Pathway in the TCPWear Particles-induced CalvarialOsteolysis in M ice M odel

Zhang Yudi1，Yan Ming2，Yu Lihong1，Zhang Siye1，Zhuge Jianying1，Guo Jianheng1，Ding Liang1，Zhang Yun1
1College ofMedicine，Shaoxing University，Shaoxing 312000，China 2DepartmentofBiomedical Engineering，College ofLife Information Scienceand InstrumentEngineering，Hangzhou 310018，China

Zhang Yun，Email：zhangyunbme.happy@163.com

ObjectiveTo explore the role of the PI3K/Akt signaling pathway in the calvarial osteoly?sis induced by TCP wear particles in mice model.MethodsThirty-six male ICR mice were randomly divided into a sham group（n=12），TCP group（n=12）and a LY294002-treated group（n=12）.A mu?rine calvarial model of osteolysis was established through implanting 30 mg of TCP particles onto the surface of bilateral parietal bones following the removal of the periosteum.On the second postoperative day，LY294002（5 mg·kg-1）was locally injected to the calvarium under the periosteum three times a week；mice in the sham group received local injection of normal saline（N.S.）in the calvarium，and theinjection time was consistent with that of LY294002.Two weeks later，the calvaria and periostea were obtained after the mice were executed.The calvarial osteolysis，bone mineral density（BMD）and bone mineral content（BMC）were analyzed using Micro-CT，Hematoxylin-Eosin（HE）staining was conducted to observe the inflammatrory response and formation of osteoclasts.Real-time PCR was applied to de?tect the mRNA level of tartrate-resistant acid phosphatase（TRAP），the marker of osteoclasts forma?tion，cathepsin K（CstK），receptor activator for nuclear factor-κB kigand（RANKL）and c-Fos.The re?lease of tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-6（IL-6）and IL-1βwere measured using en?zyme-linked immumsorbent assay（ELISA）.ResultsMicro-CT and histological analysis indicated that LY294002，the specific inhibitor of PI3K，significantly prevented TCP wear particles-induced osteolysis and osteoclastogenesis，and increased BMD and BMC in the calvaria of mice.Real-time PCR data re?vealed LY294002 significantly suppressed the increase in mRNA level of osteoclastogenic genes such as TRAP，CstK，RANKL and c-Fos in the calvaria of TCP wear particles-implanted group.ELISA as?say showed that TCP wear particles-induced release of TNF-α，IL-1βand IL-6 was significantly inhib?ited by LY294002 treatment.Furthermore，LY294002 significantly attenuated TCP wear particles-trig?gered activation of Akt，and down-regulated the level of p-AktSer473 and p-AktThr308.Conclusion PI3K/Akt signaling pathway contributes to TCP wear particle-induced osteolysis，and can be developed as a new therapeutic target for the prevention and treatment of bone destruction diseases caused by wear debris.

TCP wear particles，osteolysis，osteoclasts，PI3K/Akt signaling pathway

2016.07.08

浙江省自然科學基金（No.LY17H060007；No.LY15H180012）

張云，Email：zhangyunbme.happy@163.com