周雨青　謝學(xué)強(qiáng)　季磊　鄭巧萍　潘石瓊

摘要：綜述了國內(nèi)外對金線蓮原球莖、器官、愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)等方面的研究進(jìn)展，分析了金線蓮組培苗的外界影響因子，指出了目前存在的問題并展望未來。

關(guān)鍵詞：金線蓮；組織培養(yǎng)；研究進(jìn)展

金線蓮（Anoeetochilus roxburghii）又稱金石蠶、金線蘭、金線虎頭蕉、金線入骨消等，中文名花葉開唇蘭，為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物。金線蓮全草均可入藥，其味甘、性平，有清熱涼血、除濕解毒、消炎止痛的功效，主治咯血、支氣管炎、腎炎、膀胱炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、高血壓、糖尿病及腫瘤等疑難病癥，素有“藥王”、“金草”、“神藥”、“烏人參”等美稱。分布于海拔300～1200m的溫涼潮濕處，我國主要分布于福建、廣東、廣西、浙江、江西、海南、云南、四川、貴州及西藏南部等省區(qū)，其中以閩、浙、贛為主產(chǎn)地。日本、斯里蘭卡、印度、尼泊爾也有。

1金線蓮原球莖誘導(dǎo)與增殖研究

金線蓮組培中可選用種子、莖尖、莖段或莖片（將莖段切成2～3mm厚、1～2cm長）為外植體誘導(dǎo)原球莖。王建勤等指出，影響誘導(dǎo)原球莖的關(guān)鍵因素包括外植體部位、產(chǎn)地及培養(yǎng)基配方。其中不同部位外植體誘導(dǎo)效果差異顯著，以種子誘導(dǎo)效果最佳，誘導(dǎo)率達(dá)90%，帶節(jié)莖段誘導(dǎo)率達(dá)65%。不同產(chǎn)地外植體誘導(dǎo)效果差異較顯著，廣西野生金線蓮誘導(dǎo)率為42.9%，福建野生金線蓮的誘導(dǎo)率為31.4%，臺灣金線蓮不能誘導(dǎo)出原球莖。誘導(dǎo)原球莖較適宜的培養(yǎng)基配方為MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+ZT 0.5mg/L+KT 1.0mg/L。封應(yīng)麗等以帶節(jié)莖段為外植體，最適培養(yǎng)基是1/2MS+NAA0.2mg/L+ZT 0.8mg/L+瓊脂粉0.6%+蔗糖3%，誘導(dǎo)率達(dá)73%。韓曉紅等將莖段切成2～3mm厚、1～2cm長的莖片作為外植體，最適培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0mg/L+2，4-D 0.2mg/L+ZT 0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，誘導(dǎo)率達(dá)81%。何碧珠等以莖段為外植體，通過誘導(dǎo)潛伏副芽的萌發(fā)來產(chǎn)生芽體，再利用芽體的莖尖來誘導(dǎo)原球莖，得出誘導(dǎo)原球莖的最適培養(yǎng)基為MS+BA 2.0mg/L+NAA 0.3mg/L+Hyponcex I 3.0g/L，誘導(dǎo)率達(dá)90%，原球莖增殖的最適培養(yǎng)基為1/2MS+BA2.0mg/L+NAA 0.3mg/L+AC 0.2%+香蕉汁100g/L。韓曉紅等研究了4種基本培養(yǎng)基（B₅、MS、N₆、1/2MS）、3種基金項(xiàng)目：四川民族學(xué)院四川省省級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目添加物（香蕉汁、蘋果汁、椰汁）以及3種培養(yǎng)方式（液體懸浮培養(yǎng)、液體靜置培養(yǎng)、固體培養(yǎng)）對原球莖增殖的影響，得到B₅基本培養(yǎng)基最適合原球莖增殖，B₅、MS基本培養(yǎng)基的增殖效果比N₆、1/2MS好；3種添加物對原球莖增殖均有明顯促進(jìn)作用，椰汁促進(jìn)作用最明顯；3種培養(yǎng)方式的增殖率均為100%，其中液體懸浮培養(yǎng)增殖效果最好。

2金線蓮器官誘導(dǎo)與增殖研究

2.1不定芽及叢生芽的誘導(dǎo)與增殖

馮亦平等以1～2cm的莖段為外植體，得到誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基是1/2MS+IBA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L+0.5%AC+0.7%瓊脂+3%蔗糖，此培養(yǎng)基條件下每個外植體可形成3～4個不定芽，苗高5.1～6.0cm，平均苗高5.4cm，且不定芽的長勢達(dá)到最佳。羅國慶等以莖段為外植體，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)不定芽較適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0mg/L+KT 1.0mg/L，芽色綠、粗壯；繼代增殖較適宜的培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L，增殖倍數(shù)為2.00，苗的葉色綠、葉脈明顯、莖粗。

金線蓮組培中可選用莖段、頂芽為外植體，研究影響叢生芽誘導(dǎo)與增殖的因素，其主要包括基本培養(yǎng)基的類型、植物激素、添加物的類型和質(zhì)量濃度。何云芳等用莖段作外植體，腋芽能快速萌發(fā)出不定芽體，在基本培養(yǎng)基方面試驗(yàn)得出B₅和MS是誘導(dǎo)叢生芽的適宜培養(yǎng)基，B₅中腋芽個數(shù)由1個增加到11.4個，芽徑為1.8mm，而MS中腋芽個數(shù)增加到10.2個，芽徑為2.2mm；細(xì)胞分裂素方面得出6-BA對不定芽的增殖效果優(yōu)于KT和ZT，增殖的芽數(shù)達(dá)到最多為10.8個，且適宜誘導(dǎo)不定芽的質(zhì)量濃度為4.0mg/L；生長素方面得到NAA 0.3mg/L和GA3 0.3mg/L對誘導(dǎo)叢生芽有較強(qiáng)的促進(jìn)作用；植物添加劑方面得出在培養(yǎng)基中加入2.0mg/L綠寶誘導(dǎo)叢生芽最佳，增殖的芽數(shù)達(dá)到15.5個。江建銘等㈣以莖節(jié)段為外植體，同樣得出：B₅和MS適合作為金線蓮莖段誘導(dǎo)叢生芽的基本培養(yǎng)基，B₅和MS的芽平均增殖率分為5.2倍和5.4倍；6-BA比KT更適合金線蓮莖節(jié)誘導(dǎo)不定芽，且6-BA添加的適宜量為4.0 mg/L；生長素NAA對金線蓮不定芽的誘導(dǎo)與生長具有明顯促進(jìn)作用，芽體色濃綠、粗壯，且NAA適宜添加的量為0.5～1.Omg/L。此外還研究發(fā)現(xiàn)：外植體以不含頂芽和長根的中部莖段為好，平均芽增殖率達(dá)到4.05倍，且芽數(shù)較多，發(fā)育良好?？篆偟纫詭б秆壳o段為外植體，誘導(dǎo)叢生芽的適宜培養(yǎng)基為MS+KT1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+6-BA 2.0mg/L+2，4-D 0.4mg/L。研究證明6-BA和2，4-D均有利于叢生芽的誘導(dǎo)，單獨(dú)加入質(zhì)量濃度為1.0～4.0mg/L 6-BA的培養(yǎng)基能使叢生芽增值倍數(shù)由2.3增加到4.5，同時加入6-BA和2，4-D，增殖倍數(shù)進(jìn)一步加大，且在培養(yǎng)基中加入2.0mg/L 6-BA和0.4mg/L 2，4-D時，增殖倍數(shù)達(dá)到最大，為8.1。魏翠華等以頂芽為外植體，應(yīng)用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計研究得出對不定芽增殖的影響力：6-BA﹥蔗糖﹥NAA﹥基本培養(yǎng)基。何碧珠等還研究得到愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽的適宜培養(yǎng)基為1/2MS+BA2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+香蕉汁100g/L，出芽數(shù)達(dá)到最高為14個，叢生芽增殖適宜培養(yǎng)基為1/2MS+BA3.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT 1.0mg/L+香蕉汁100g/L+AC0.2%，增值倍數(shù)為4.33。endprint

2.2無根苗生根誘導(dǎo)與根量增殖

誘導(dǎo)生根的研究內(nèi)容主要是最佳培養(yǎng)基配方，包括MS培養(yǎng)基的優(yōu)化、添加激素和添加物的類型和濃度。激素多為6-BA、GA3、NAA和IAB，添加物多為香蕉汁、活性炭、蔗糖和瓊脂。趙碉和郭順星研究發(fā)現(xiàn)金線蓮無根苗生根能力隨MS培養(yǎng)基大量元素含量降低而升高，因而要減少M(fèi)S培養(yǎng)基用量誘導(dǎo)生根。封應(yīng)麗等試驗(yàn)得到生根適宜生長物質(zhì)及濃度是IBA 0.5mg/L。羅慶國等在培養(yǎng)基中加入20g/L香蕉泥發(fā)現(xiàn)根生長粗壯。岑秀芬等㈣發(fā)現(xiàn)：4.0mg/L NAA和0.5mg/LMET配合使用誘導(dǎo)生根效果最好，能有效提高根的質(zhì)量，促進(jìn)根的伸長和加粗，使平均根數(shù)達(dá)到10.40條、平均根長為2.88cm。魏翠華等研究得出：對生根培養(yǎng)的影響為：蔗糖﹥6-BA﹥基本培養(yǎng)基﹥NAA。黃敏等研究得到：對生根系數(shù)影響程度大小為：基本培養(yǎng)基﹥6-BA﹥活性炭﹥IAB。

3金線蓮愈傷組織誘導(dǎo)與增殖研究

馮亦平等研究得出誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體是從莖段切成厚約2mm的小片（簡稱莖片），適合的培養(yǎng)基是MS（大量元素減半，微量元素加倍）+6-BA4.0mg/L+ZT 0.2mg/L+NAA 0.5mg/L+0.7%瓊脂+3%蔗糖，且誘導(dǎo)率為70%。王雅英等研究得出：以莖段、莖片和不定芽為外植體，均能成功誘導(dǎo)愈傷組織，且最佳外植體為不定芽，最佳培養(yǎng)基是MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+ZT 0.2mg/L，誘導(dǎo)率達(dá)95%。

4影響金線蓮組培苗的外因研究

4.1消毒殺菌處理

4.1.1培養(yǎng)室滅菌。張望舒等試驗(yàn)得出：除了甲醛高錳酸鉀熏蒸法、過氧乙酸熏蒸法可用于金線蓮組培室空氣滅菌，艾葉與蒼術(shù)聯(lián)合熏蒸法也可降低金線蓮組培苗的污染率，甲醛高錳酸鉀熏蒸法滅菌效果最好。

4.1.2外植體消毒。金線蓮組培中外植體不同，消毒方法也不同。闞世超等以莖段為外植體試驗(yàn)得到：最佳消毒方式為用75%酒精浸泡30s，0.15%升汞消毒4min。楊紅麗等以金線蓮莖尖、莖段為外植體研究得出：相同消毒條件下莖段的污染率高于莖尖，莖尖耐受次氯酸鈉濃度的能力比莖段弱，同時適合2種外植體的消毒方式為70%酒精處理30s+0.1%次氯酸鈉處理20min。

4.1.3組培苗培養(yǎng)過程抑菌。金線蓮組培苗受微生物污染十分嚴(yán)重，在實(shí)驗(yàn)室中污染率可達(dá)50%，影響金線蓮正常生長，許婉芳等將50%多菌靈加入培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)其抑制細(xì)菌和真菌生長效果明顯，抑菌率達(dá)100%，且能促進(jìn)金線蓮生長。

4.2培養(yǎng)基及添加物

培養(yǎng)基能在金線蓮組培苗生長過程中提供所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，因此，培養(yǎng)基配方是組培苗生長的基礎(chǔ)條件。王麗芳研究證明：最利于金線蓮生長量積累的培養(yǎng)基是MS+3%蔗糖，且在相同培養(yǎng)基中添加香蕉泥比添加馬鈴薯泥更有效。楊紅麗等得到：蔗糖是金線蓮離體培養(yǎng)最佳碳源，其培養(yǎng)的葉片顏色深綠，長勢旺盛；在培養(yǎng)基中添加有機(jī)物可顯著促進(jìn)金線蓮生長，椰汁和香蕉能顯著加快金線蓮生長速度，且添加2.0 g/L的活性炭有利于培育壯苗。黃肇宇等在培養(yǎng)基中添加不同濃度稀土硝酸鑭，其低濃度時對金線蓮增殖、生長、生根具有促進(jìn)作用，高濃度時具有一定抑制作用。

4.3光照強(qiáng)度

金線蓮屬喜陰植物，在光照強(qiáng)度為2000～3000Lux時生長較快，過低光照強(qiáng)度不利于金線蓮正常生長。陸祖正等研究得到：維持金線蓮正常生長最低光照強(qiáng)度為400Lux。高于400Lux時光照強(qiáng)度越大，金線蓮生長越健壯；低于400Lux時，金線蓮中有機(jī)物積累大幅減少。

4.4溫度

金線蓮組培苗生長過程中需要適宜的外界環(huán)境，主要包括光照和溫度，因此在一定的光照條件下，溫度的控制也尤為重要。牛蓓等研究得出：金線蓮生長最適溫度為25℃，最不適溫度為35℃。楊紅麗等人同樣發(fā)現(xiàn)金線蓮最適宜生長溫度范圍為20～25℃，當(dāng)培養(yǎng)溫度為25℃時，金線蓮的生長速度最快，長勢最旺盛，高于35℃時，金線蓮會因熱害而死亡。

4.5光質(zhì)

周錦業(yè)等研究發(fā)現(xiàn)：紅光有利于植株莖的伸長生長，但在一定程度上造成植株徒長；綠光對植株生長沒有促進(jìn)作用；藍(lán)光有一定的壯苗效果，但植株縱向生長速度減慢。單純的某種光質(zhì)處理不利于金線蓮組培苗健康生長，因此單色光照不適合作為金線蓮組培苗的人工光源，但可考慮通過紅藍(lán)混合光源或者周期性交替使用單色光照處理來彌補(bǔ)上述缺點(diǎn)。

5金線蓮組織培養(yǎng)研究的問題與展望

5.1問題

目前，我國在金線蓮組織培養(yǎng)上的研究已取得較好的成果。目前主要針對原球莖、不定芽和叢生芽、無根苗根、愈傷組織誘導(dǎo)及增殖，研究其最佳外植體、最優(yōu)配方、影響因素，以進(jìn)行栽培。未見直接以愈傷組織作藥源的研究，以及相關(guān)的增殖研究。另外，共生菌對金線蓮種子萌發(fā)的影響、萌發(fā)條件研究和組培研究較少。

不同產(chǎn)地金線蓮的研究較局限，不同產(chǎn)地野生金線蓮生存環(huán)境不同，需要的培養(yǎng)條件也可能不同。國內(nèi)學(xué)者主要研究福建和臺灣金線蓮，對其他產(chǎn)地野生金線蓮研究較少。

有關(guān)影響金線蓮組培苗生長的因素研究也已較完善，主要針對消毒殺菌處理、培養(yǎng)基及添加物、光照強(qiáng)度、溫度和光質(zhì)幾方面進(jìn)行，但關(guān)于培養(yǎng)室和外植體新殺菌方法和新殺菌材料研究較少；多用固體培養(yǎng)基，對液體及其他培養(yǎng)基研究較少；培養(yǎng)基添加物多采用椰汁、香蕉泥、馬鈴薯泥、活性炭，未見使用原生境土壤提取液和一般土壤提取液；培養(yǎng)中用單色光如紅光研究表明金線蓮不適宜單色光照射培養(yǎng)，未見使用混合光以及周期性單色光。

5.2展望

金線蓮種子微小，自然萌發(fā)率和繁殖率低，目前市場上貨源主要來自于野生采挖，產(chǎn)品一直處于供不應(yīng)求的狀況。近年來，隨著對金線蓮藥用價值的認(rèn)識進(jìn)一步提高，其市場貨源緊缺的狀況更為嚴(yán)峻，野生資源也不斷遭到破壞性采挖，以致于處于瀕臨滅絕之地。利用組織培養(yǎng)技術(shù)解決金線蓮種苗來源、快速繁殖種苗、加快人工栽培，對金線蓮的開發(fā)利用、野生資源保護(hù)、穩(wěn)定市場供應(yīng)具有現(xiàn)實(shí)意義。目前，開唇蘭屬金線蓮組培育苗已獲成功，但還是存在地域限制，在四川尤其西部干旱河谷地區(qū)涉及極少。在種子組織培養(yǎng)、不同產(chǎn)地金線蓮組培研究、培養(yǎng)基添加物（土壤浸提液）、混合光和周期性單色光方面進(jìn)行研究，以提供充足的藥源，保護(hù)金線蓮。

（收稿：2017-03-14）endprint