祝杰+李廷陽+陸明雄+莫勝勇+馮佳佳+陸欽晨+陸萬流

【摘要】 目的 觀察大鼠實驗性腦出血血腫周圍腦組織中C-IAP-1和Caspase-3的表達變化及瑞舒伐他汀的干預作用，探討瑞舒伐他汀在腦出血發(fā)生后可能出現的神經保護作用及其機制。

方法 將60只SD大鼠按照隨機分組的方法分為假手術組（A組，20只），腦出血組（B組，20只），瑞舒伐他汀干預組（C組，20只）。每組分成6 h、24 h、72 h、5 d四個時間點，每個時間點使用5只大鼠進行造模并實驗。采用自體凝固動脈血注入腦組織法建立腦出血模型。通過實時熒光定量PCR技術測定大鼠腦出血術后4個時間點血腫腦組織C-IAP-1及Caspase-3表達狀況。

結果 熒光定量PCR法顯示，假手術組、腦出血組與瑞舒伐他汀組術后各個時間點相比，C-IAP-1及Caspase-3表達降低，除第6小時外，其余時間點之間腦出血組和瑞舒伐他汀干預組相比，C-IAP-1表達降低，Caspase-3表達增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

結論 瑞舒伐他汀可以提高C-IAP-1的水平，抑制Caspase-3的水平，提示瑞舒伐他汀能夠降低由細胞凋亡影響引起的繼發(fā)性腦損傷，對神經功能起到一定的保護作用。

【關鍵詞】 腦出血；C-IAP-1；Caspase-3；瑞舒伐他汀

中圖分類號：R743.34 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2017.03.006

【Abstract】 Objective To observe the change of expression of C-IAP-1 and Caspase-3 in brain tissue around hematoma in rats with experimental intracerebral hemorrhage and the intervention effect of rosuvastatin，and to investigate the neuroprotective effect and possible mechanism of rosuvastatin after intracerebral hemorrhage.

Methods 60 SD rats were randomly divided into sham operation group （group A，20 rats），intracerebral hemorrhage group （group B，20 rats） and rosuvastatin group （group C，20 rats）.Each group was divided into four time points：6 h，24 h，72 h and 5 d，and 5 rats were used for modeling and experiment at each time point.Cerebral hemorrhage model was established by injecting autologous blood into the brain tissue.And the expressions of C-IAP-1 and Caspase-3 in the brain tissue of rats at the 4 time points after intracerebral hemorrhage were measured by RT-qPCR.

Results RT-qPCR showed that expressions of C-IAP-1 and Caspase-3 reduced in the comparison of each time point of the three groups after operation.Expected the 6 h，the expression of C-IAP-1 decreased and the expression of Caspase-3 increased in the cerebral hemorrhage group and the rosuvastatin intervention group at the other time points，so difference was statistically significant（P<0.05）.

Conclusion Rosuvastatin can improve the level of C-IAP-1，and inhibit the effects of Caspase-3，which suggests that rosuvastatin can reduce the secondary brain damage caused by apoptosis，and play a certain role in the protection of nerve function.

【Key words】 intracerbral hemorrhage；C-IAP-1；Caspase-3；rosuvastain

腦出血（Intracerebral Hemorrhage ，ICH）作為神經外科常見疾病，病情一般比較危重，情況較為緊急。目前研究表明在東亞地區(qū)中腦出血占腦卒中的比例為25%～55%，在西方國家中相對較少，也達到了10%～15%。有報道指出腦出血發(fā)病30天內的死亡率高達40%左右[1]，存活下來的大部分患者致殘的概率也達到75%～80%。目前腦出血后繼發(fā)腦損傷的機制尚未完全闡明，有研究表明出血后引起細胞應激，繼而誘導細胞凋亡是重要原因之一。在細胞凋亡過程中Caspase-3被認為起到關鍵作用[2]，正常細胞中Caspase-3沒有活性，其在接收到外界刺激信號后，凋亡程序啟動[3]，凋亡開始。凋亡抑制蛋白（inhibitors of Apoptosisprotein，IAPs）主要抑制Caspase3，-7，其可以結合酶原Caspase，進而抑制細胞凋亡[4]。有研究表明瑞舒伐他汀能夠通過對血管內皮功能改善、免疫功能調節(jié)、抗炎作用等方面阻止興奮性毒性細胞損傷，在一定程度上抑制細胞凋亡。目前針對瑞舒伐他汀干預下C-IAP-1和Caspase-3在腦出血后表達變化的研究較少，本實驗通過對大鼠進行自體凝固血造模，并在瑞舒伐他汀干預下分析大鼠腦出血后C-IAP-1和Caspase-3表達變化，初步探討瑞舒伐他汀對兩種細胞因子的影響，為臨床治療尋找新的可靠方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級雄性Wistar大鼠60只，體重250～300 g，由武漢云克隆科技股份有限公司（許可證號：SCXK 鄂 2015-0018）提供；瑞舒伐他汀鈣片購自阿斯利康藥業(yè)（中國）有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo公司；FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）購自Roche公司；熒光定量PCR儀（ABI，型號：7300）；超微量分光光度計（Thermo，型號：NanoDrop2000）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥

將60只大鼠采用隨機數字表分為假手術組（A組），腦出血組（B組）以及瑞舒伐他汀干預組（C組）三組，每組20只大鼠。其中每組分成4個時間點，6 h、24 h、72 h、5 d，每個時間點各5只大鼠。B組和C組采用自體凝固動脈血注入法，通過立體定位儀向成年SD大鼠右側基底節(jié)區(qū)的尾狀核注入凝固自體血，A組采取相同方法注入等量滅菌生理鹽水[5～6]。術后2小時按照每kg體重10 mg比例對C組進行灌胃治療，每天給藥一次至造模結束。其余兩組同時給予相同量的生理鹽水。

1.2.2 模型的建立

大鼠術前禁食禁水6小時，麻醉方式選用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射。尾部采血50 μL，靜止5分鐘至血液完全凝固。大鼠頭頂部行正中縱向切口，30%過氧化氫腐蝕骨膜暴露前囟及進針點。立體定位儀選定靶點，靶點定位于前囟前1 mm、中線左側旁開3 mm、顱骨外表面下6 mm。進針點處顱骨用顱骨鉆鉆一個直徑1 mm圓孔至硬腦膜表面，微量注射器將凝固血塊快速注入靶點內[7～8]（圖1），注射速度20 μL/min，留針10 min后取針縫合。A組尾部取血，開顱但不注入自體血，采用相同方法注入等量生理鹽水。C組造模后2小時，灌胃給予瑞舒伐他汀（10 mg·kg-1·d-1）1次，A組和B組在相同時間給予等量的生理鹽水。模型制備成功的標準是手術后可見大鼠出現明顯的對側肢體癱瘓，同時沿針道冠狀切面切開腦組織，可發(fā)現顱內血腫形成。

1.2.3 動物的處置、標本采集 采用10%水合氯醛（350 mg/kg），對三組大鼠進行腹腔麻醉，檢查麻醉效果即大鼠沒有痛覺反應，麻醉成功后為防止大鼠窒息采用止血鉗夾住大鼠的下頜及舌防止窒息，取出血腫腦組織，統(tǒng)一放入液氮用于qPCR檢測。

1.2.4 引物的設計與合成 從NCBI網上數據庫檢索基因序列后，由武漢擎科公司設計并合成，C-IAP-1上游引物：5-AGACAGAGTGAAGAGACGGCATC-3，下游引物：5-AGAGAGTTTTTGAAGACGCTGG-3，Caspase-3上游引物：5-GAAAGCCGAAACTCTTCATCAT-3，下游引物：5-ATGCCATATCATCGTCAGTTCC-3。

1.2.5 qPCR實驗方法 ①總RNA抽提與逆轉錄：取腦組織充分碾磨后使用Trizol法提取腦組織中RNA，通過超微量分光光度計檢測RNA濃度及純度，采用FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）對總RNA逆轉錄為cDNA用于C-IAP-1和Caspase-3檢測。②qPCR檢測C-IAP-1和Caspase-3的表達：引物由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司設計并合成，PCR擴增預變性為95℃下10 min，95℃下10 s，60℃ 20 s，74℃ 5 s，循環(huán)40次，實時熒光定量PCR儀型號為ABI 7300。③結果處理：采用ΔΔCT法，使用表達倍數=2-ΔΔCT表達。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數±標準差（±s）表示，采用方差分析進行多組間分析，檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2 結 果

2.1 腦出血中C-IAP-1表達 假設A組6 h時間點為1，A組C-IAP-1相對定量數值變化差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），數值基本相同，B組和C組Caspase-3表達水平遠高于A組（P<0.01）。C組C-IAP-1在72 h至5 d達到頂峰。C組與B組在各個相同時間點比較，除6 h時間點差異無統(tǒng)計學意義外，其余時間點C組C-IAP-1表達均較B組增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表1，圖2。

2.2 腦出血中Caspase-3表達 假設A組6 h時間點為1，各時間點A組Caspase-3表達水平基本不變，B組和C組Caspase-3表達水平遠高于A組（P<0.01）。B組Caspase-3逐漸升高，在24 h至72 h達到頂峰，之后下降。C組與B組在各個相同時間點比較，Caspase-3表達明顯減少（P<0.05或0.01）。見表2，圖3。

3 討 論

ICH血腫占位會導致周圍腦組織損傷、缺血等，引起炎癥反應以及出血產生的血液毒性物質作用下誘導細胞凋亡，從而加重腦損傷程度，腦出血引起的炎癥反應導致的細胞凋亡在繼發(fā)性損傷中的作用日益受到重視[9]。

Caspase即半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，其能夠介導細胞凋亡的級聯反應。Caspases-3是Caspase家族重要的一員，作為終末剪切酶，Caspase-3在細胞凋亡中起到樞紐的作用，可以裂解DNA依賴性蛋白酶，通過改變其結構導致細胞凋亡產生[10]。目前認為Caspase-3具有高度可變性，能夠自發(fā)激活或者通過級聯反應激活，一旦Caspase-3激活后，就會開始對對應的下游底物進行切割，引起細胞凋亡。近年來鈣離子負載引起的內質網受損導致細胞凋亡也越來越受到關注，研究發(fā)現內質網受損會引起胞質內Caspase-7轉移，誘導Caspase-12表達，Caspase-12會激活Caspase-3，也會導致細胞凋亡發(fā)生[11]。

凋亡抑制蛋白是一種能夠通過抑制Caspase活性及對NF-κB進行調節(jié)來抑制細胞凋亡的內源性抗細胞凋亡因子家族，在對凋亡抑制蛋白（IAP）家族的研究中發(fā)現C-IAP-1可以結合并有效地抑制Caspase-3在參與細胞凋亡的部分功能。同樣，在體外實驗表明，C-IAP-1可以特異結合Caspase-3，抑制Csapase-3的活性，總之，這些研究結果表明，C-IAP-1通過抑制Csapase-3，抑制細胞凋亡基因[12～13]。

瑞舒伐他汀是選擇性HMG-CoA還原酶抑制劑的一種，有研究表明瑞舒伐他汀可以起到神經保護作用，通過對血管內皮功能改善、免疫功能調節(jié)、抗炎作用等方面阻止興奮性毒性細胞損傷來降低神經功能缺損[14]。Ridkerbm等人發(fā)現堅持服用他汀類藥物能夠減少缺血性腦卒中致死率[15～16]，他汀類藥物能起到促進血液循環(huán)，活血化瘀，保護腦功能的作用。

本研究通過熒光定量PCR技術對大鼠腦出血后C-IAP-1和Caspase-3進行研究，發(fā)現A組C-IAP-1及Caspase-3表達在四個時間點基本不變，B組和C組C-IAP-1及Caspase-3表達遠高于A組，說明腦出血后引起的炎癥反應、血液毒性等作用會提高Caspase-3表達，引起神經細胞凋亡，加重腦組織損傷。B組Caspase-3逐漸升高，在24 h至72 h達到頂峰，說明腦出血后會導致Caspase-3表達升高，腦損傷與時間有一定關系。C組C-IAP-1在72 h至5 d達到頂峰，說明瑞舒伐他汀能夠促進C-IAP-1的表達，起到保護神經細胞的作用。C組與B組在各個相同時間點比較發(fā)現，C組Caspase-3表達水平比B組減少，除6 h時間點外，C組C-IAP-1表達水平均較B組增多。說明瑞舒伐他汀在腦出血發(fā)生后可以抑制Caspase-3表達，促進C-IAP-1表達，能夠起到抑制細胞凋亡，保護神經細胞，減少腦損傷的作用。

總之，Caspase-3及C-IAP-1在腦出血后引起細胞凋亡中扮演著重要的作用，瑞舒伐他汀能夠提高C-IAP-1水平，降低Caspase-3水平起到神經保護作用。但瑞舒伐他汀對C-IAP-1和Caspase-3表達影響的機制尚未完全闡明，隨著研究的逐漸深入，其影響的機制也將逐漸清晰，最終將為腦出血治療增添一個高效的治療手段。

參 考 文 獻

[1] 官 念，吳碧華，劉黎明，等.腦出血病因及相關機制的研究進展[J].中華老年心腦血管病雜志，2016，18（6）：670-672.

[2] Keiko Takaki，Yoshihiro Higuchi，Minako Hashii，et al.Induction of apoptosis associated with chromosomal DNA fragmentation and caspase-3 activation in leukemia L1210 cells by HO2 nanoparticles[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2014，117（1）：129-133.

[3] 蔡 麗，周煉紅.Caspase與視網膜細胞凋亡的研究進展[J].臨床眼科雜志，2016，24（4）：380-383.

[4] 吳志偉，陳 凱，段衛(wèi)明，等.凋亡抑制蛋白XIAP和Survivin在晚期胃癌中的表達及其與含多西紫杉醇方案化療療效的相關性[J].現代腫瘤醫(yī)學，2015，23（6）：815-820.

[5] 李新明，方顯明.安心顆粒對心衰大鼠血流動力學及STAT3信號傳導通路的影響[J].廣西中醫(yī)藥，2010，33（3）：47-49.

[6] 朱文麗.大鼠實驗性腦出血急性期Notch1與NF-κB的表達變化及他汀的干預作用[D].長沙：中南大學，2014

[7] 阮志芳.大鼠腦內注射凝血酶對小膠質細胞活化及誘導型一氧化氮合酶表達的影響[D].福州：福建醫(yī)科大學，2009.

[8] 呂田明，陸兵勛.大鼠尾狀核注射凝固自體動脈血腦出血模型[J].中風與神經疾病雜志，2006，23（1）：88-90，129.

[9] 王立姝.TLR4對大鼠腦出血后炎癥反應和神經細胞凋亡的作用研究[D].沈陽：中國醫(yī)科大學，2009.

[10] 傅錦華，劉 勇，王清勇，等.舒肝解郁膠囊對抑郁模型大鼠海馬神經元凋亡及腦組織caspase-3蛋白表達的影響[J].中南大學學報（醫(yī)學版），2012，37（12）：1198-1204.

[11] 焦東亮，倪秀石，高 艷，等.丁苯酞對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后caspase-3表達的影響[J].中國臨床神經科學，2007，15（1）：19-23.

[12] HUANG Li Hua，YANG Huan，SU Xin，et al.Neodymium Oxide Induces Cytotoxicity and Activates NF-κB and Caspase-3 in NR8383 Cells[J].Biomedical and Environmental Sciences，2017，30（1）：75-78.

[13] Karine Sá Ferreira，Clemens Kreutz，Sabine MacNelly，et al.Caspase-3 feeds back on caspase-8，Bid and XIAP in type I Fas signaling in primary mouse hepatocytes[J].Apoptosis，2014，17（5）：503-515

[14] 涂征艷，石 碩，李玉梅.化滯柔肝顆粒聯合瑞舒伐他汀鈣治療脂肪肝的療效觀察[J].中國醫(yī)藥科學，2012，2（23）：72-73.

[15] Sinar EJ，Mendelow AD，Graham DI，et al.Experimental intracerebral hemorrhage：effects of a temporary mass lesion[J].J Neurosurg，l987，66（4）：568-576.

[16] Ridker PM，Danielson E，Fonseca FA，et al.Rosuvastatin to prevent vascular events in men and women with elevated C-reactive protein[J].N Engl J Med，2008，359（21）：2195-2207.

（收稿日期：2017-03-17 修回日期：2017-04-13）

（編輯：潘明志）