李美娜　黎德佳　謝景　李婷婷

摘要[目的]確定鯉魚魚磷蛋白的酶解制備工藝，并分析所得的魚磷抗氧化肽的抗氧化性能。[方法]以鯉魚魚鱗為原料，

選用胰蛋白酶考察其加酶量、反應(yīng)溫度、酶解時間、pH、底物濃度等因素對魚鱗蛋白水解程度的影響，

用單因素及正交試驗的方法優(yōu)選出魚鱗蛋白酶解的最佳條件并測定其抗氧化活性。[結(jié)果]試驗得到鯉魚魚磷抗氧化肽酶法制備的最佳工藝條件為pH 8.4、酶解溫度45 ℃、加酶量4000 U/g、酶解時間3 h、底物濃度15%，此條件下得到的魚磷抗氧化肽水解度較佳（29.97%），抗氧化能力較好。[結(jié)論]胰蛋白酶有溶解鯉魚魚鱗蛋白的能力，并且酶解產(chǎn)物的抗氧化活性與水解度有關(guān)。

關(guān)鍵詞鯉魚魚鱗；酶解；水解度；抗氧化活性

中圖分類號S986；TS254文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2017）19-0086-04

Study on Enzymatic Hydrolysis Preparation and Antioxidant Activity of Protein from Carp Scales

LI Meina，LI Dejia，XIE Jing，LI Tingting*

（College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian，Liaoning 116600）

Abstract[Objective] To determine enzymatic hydrolysis preparation technique of protein from carp scales and study its antioxidant activity.[Method] With carp scale as material，using trypsin to study effects of enzyme dosage，temperature，time，pH，substrate concentration on hydrolysis degree of scale protein.Single factor and orthogonal test were adopted to select the optimum conditions of enzymatic of protein from carp scales and determine its antioxidant，activity.[Result] Under the conditions of pH 8.4，temperature 45 ℃，enzyme dosage 4 000 U/g，time 3 h，substrate concentration 15%，the degree of hydrolysis and antioxidant activity were better.The degree of hydrolysis of trypsin reached 29.97%.[Conclusion] Trypsin had the ability to dissolve carp protein，and the antioxidant activity of hydrolysates was related to the degree of hydrolysis.

Key wordsCarp scales；Enzymatic hydrolysis；Degree of hydrolysis；Antioxidant activity

近十幾年來，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和水產(chǎn)品加工業(yè)蓬勃發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計，2011年我國淡水魚產(chǎn)量為2 343.66萬t，2012年我國淡水魚產(chǎn)量為2 497.71萬t，2013年我國淡水魚產(chǎn)量為2 635.08萬t，其中有鱗魚1 310萬t以上，而我國每年大約可產(chǎn)生魚鱗高達(dá)65萬t，但除了少部分被加工成飼料外，大部分的魚鱗都被拋棄浪費了[1]。這不僅造成了資源了巨大浪費，同時也污染了環(huán)境。魚鱗中含有豐富的蛋白質(zhì)和多種礦物質(zhì)，研究表明，魚鱗具有延緩衰老、降低血清總膽固醇、促進(jìn)血液循環(huán)和預(yù)防心臟病及高血壓等功效[2-3]。美國免疫學(xué)家證實，用魚鱗提取物制成的抗癌藥62硫化鳥嘌呤治療白血病，有效率達(dá)70%以上，其對胃、淋巴癌也有較好的治療效果[4]。魚鱗中的蛋白質(zhì)含量高達(dá)70%，主要是膠原蛋白和魚鱗硬蛋白，魚鱗膠原蛋白中含有豐富的甘氨酸和脯氨酸，其水解產(chǎn)物含有大量的生理活性肽，在保健和美容方面具有很大的應(yīng)用前景。膠原蛋白中含有大量的疏水性氨基酸，經(jīng)酶解后，含疏水氨基酸的肽大量釋放出來，參與到酶解產(chǎn)物的抗氧化過程中，使得其具有較強(qiáng)的抗氧化作用[5-6]。

由于利用胰蛋白酶在此方面的研究較少，所以該研究旨在利用胰蛋白酶對鯉魚魚鱗進(jìn)行酶解，以羥自由基清除率和水解度為指標(biāo)，確定鯉魚魚鱗抗氧化肽酶法的最佳工藝條件，并對在此條件下制備的魚鱗抗氧化肽進(jìn)行分析，為以后魚鱗的酶解和抗氧化性能的研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料。鯉魚魚鱗購于當(dāng)?shù)厮a(chǎn)市場，胰蛋白酶，酶活力250 000 U。

1.1.2主要試劑。去離子水；0.4 mol/L氫氧化鈉溶液；0.2 mol/L鹽酸溶液；甲醛溶液；硫酸銅；硫酸鉀；濃硫酸； 混合指示劑；0.049 mol/L的鹽酸溶液；20 g/L硼酸溶液；羥自由基清除能力測試盒，蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.1.3儀器設(shè)備。電子天平；可見分光光度計；離心機(jī)；pH計；烘箱；攪碎機(jī)；數(shù)顯水浴鍋；磁力攪拌器；電磁爐；凱氏定氮裝置；通風(fēng)櫥；酶標(biāo)儀。

1.2方法

1.2.1鯉魚魚鱗酶解制備工藝流程。

鯉魚魚鱗→清洗、烘干→浸酸（0.2 mol/L，M/V=1∶20、36 h）→清洗至中性→烘干→浸堿（0.4 mol/L、M/V=1∶15、12 h）→清洗至中性→烘干→打碎→魚鱗+水→沸水浴加熱（100 ℃、15 min）→冷卻→調(diào)節(jié)pH（NaOH/HCl） →預(yù)熱30 min →加酶→恒溫水解4～9 h→滅酶（100 ℃、10 min）→冷卻→離心（11 000 r/min、15 min、4 ℃）→取得上清液備用。

1.2.2魚鱗中總氨基態(tài)氮的測定。

總氨基態(tài)氮含量的測定采用點位滴定法。取魚鱗水解液20 mL，定容至100 mL。取定容好的樣品20 mL于250 mL燒杯中，然后再加入60 mL水，放到磁力攪拌器上持續(xù)攪拌，用0.05 mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)液將溶液pH滴定至8.2，再加入10 mL甲醛溶液，待混勻后，再用0.05 mol/L NaOH溶液繼續(xù)滴定至pH 9.2，滴定所用NaOH溶液的量即為V1，可代入公式（1）計算。在滴定之前要用此法做試劑空白試驗，滴定所用NaOH溶液的量即為V2，可代入公式（1）中計算。

X=（V1-V2）×C×141 0005×V3100×1 000×1 000（1）

式中，X為樣品中總氨基氮含量（mg/L）；V1為加入甲醛后樣品稀釋液消耗氫氧化鈉的體積（mL）；

V2為試劑空白試驗加入甲醛后樣品稀釋液消耗氫氧化鈉的體積（mL）；V3為樣品稀釋液的取用量（mL）；

C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（mol/L）。

1.2.3總氮含量的測定。

總氮的含量測定采用GB/T 5009.5—2003蛋白質(zhì)測定中的凱氏定氮法。

1.2.4魚鱗肽水解度（DH）的測定。以水解液中的氨基態(tài)氮與原料中的總氮的分?jǐn)?shù)表示：

DH=水解液中氨基態(tài)氮含量原料中總氮含量×100%

水解度能夠有效地反映出不同的蛋白酶在不同的條件下對鯉魚魚鱗水解程度的差異。

1.2.5改良的羥自由基清除率的測定[7]。

選用羥自由基清除能力測試盒進(jìn)行測定。羥自由基清除率的計算見公式（2）：

D=（A2-A1）（A3-A1）×100%（2）

式中，A1為標(biāo)準(zhǔn)管的吸光值；A2為測定管的吸光值；A3為空白管的吸光值。

1.2.6胰蛋白酶酶解條件的確定。

單因素試驗：每次取10 g魚鱗，在用胰蛋白酶酶解魚鱗的過程中分別考察不同影響因素對魚鱗水解度的影響。影響魚鱗蛋白水解度的條件主要包括水解的pH、酶的添加量、水解溫度、底物濃度和水解時間。通過變量分析的方法，從而確定各個因素對魚鱗蛋白水解程度的影響及其最適范圍，為接下來的正交試驗做準(zhǔn)備。

正交試驗：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選定了pH（A）、水解溫度（B）、酶添加量（C）、酶解時間（D）和底物濃度（E）各因素的3個水平（從單因素最適條件中選擇），分別以水解度和羥自由基清除率為指標(biāo)，設(shè)計了L18 （35）的正交試驗并確定各因素的最佳條件。胰蛋白酶的正交試驗設(shè)計見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1胰蛋白酶水解鯉魚魚鱗各因素對水解度的影響

2.1.1pH對胰蛋白酶水解度的影響。已知胰蛋白酶的最適pH在7.8～8.5，所以便在此范圍內(nèi)對胰蛋白酶進(jìn)行進(jìn)一步研究。在酶添加量5 000 U/g、底物濃度15%、酶解溫度50 ℃、酶解時間5 h，不同pH下水解度的變化曲線見圖1。由圖1可得出，水解度在pH為7.8～8.0的范圍內(nèi)逐漸增大，pH在8.0后逐漸減小，而在pH 8.2后又處于增加的狀態(tài)，在pH為8.4時出現(xiàn)第2個峰。其中pH為8.0、8.1、8.4的水解度較大，所以選擇這3個條件做接下來的正交試驗。

2.1.2酶添加量對胰蛋白酶水解度的影響。

在底物濃度15%、酶解時間5 h、pH 8.0、酶解溫度50 ℃、不同酶添加量下水解度的變化曲線見圖2。由圖2可得出，水解度先隨加酶量的增多而增大，酶添加量在4 000 U/g后處于逐漸減小的趨勢，而在酶添加量為8 000 U/g的時候出現(xiàn)了顯著地增大。其中酶添加量為4 000、5 000、8 000 U/g的水解效果較好，所以選用這3個條件做接下來的正交試驗。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年

2.1.3酶解溫度對胰蛋白酶水解度的影響。

在底物濃度15%、酶解時間5 h、pH 8.0、酶添加量4 000 U/g、不同酶解溫度下水解度的變化曲線見圖3。由圖3可得出，水解度在酶解溫度為35～40 ℃時增加幅度較大，而酶解溫度在40 ℃時，隨溫度的升高水解度逐漸較低。其中酶解溫度為40、45、50 ℃時的水解效果較好，所以選用這3個條件做接下來的正交試驗。

2.1.4底物濃度對胰蛋白酶水解度的影響。

在酶解溫度40 ℃、酶解時間5 h、pH 8.0、加酶量4 000 U/g、不同底物濃度下的水解度變化曲線見圖4。由圖4可得出，不同底物濃度的水解度從大到小依次為15%、10%、5%、20%、25%，并且水解度先隨底物濃度的增大而增大，在底物濃度為15%以后逐漸減小。其中底物濃度為15%、10%、5%的水解度較大，所以選擇這3個條件做接下來的正交試驗。

2.1.5酶解時間對胰蛋白酶水解度的影響。

在酶解溫度40 ℃、底物濃度15%、pH 8.0、加酶量4 000 U/g、不同酶解時間下水解度的變化曲線見圖5。由圖5可得出，水解度在酶解時間為5 h時出現(xiàn)最高峰值，而其他幾個時間段的水解度曲線較為平緩，變化較小。但其中酶解時間為3、4、5 h的水解較好，所以在接下來的正交試驗中選用這3個條件。

2.2酶解條件的優(yōu)化

在初步獲得的單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，從較優(yōu)的水解條件中篩選出最好的水解條件，因此選擇pH、水解溫度、加酶量、水解時間和底物濃度5個因素，設(shè)計3個水平的正交試驗，胰蛋白酶的正交試驗結(jié)果見表2。

由表2數(shù)據(jù)可知，胰蛋白酶酶解鯉魚魚鱗的水解度最高

可達(dá)25.97%，證明胰蛋白酶對鯉魚魚鱗蛋白有著較好的水

解作用。原因可能在于，胰蛋白酶是一種消化酶，也是肽鏈內(nèi)切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷。它不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其他酶的前體，起活化作用[8]。胰蛋白酶還是特異性最強(qiáng)的蛋白酶，在決定蛋白質(zhì)的氨基酸排列中，它也是不可缺少的工具。

表2中胰蛋白酶正交試驗的水解度極差表明，影響胰蛋白酶酶解鯉魚魚鱗的因素大小順序為底物濃度、時間、pH、加酶量、溫度。正交試驗較優(yōu)組合為A3B2C1D3E1；直觀分析得出水解能力較優(yōu)條件是7號試驗組（A3B2C1D3E3），即pH 84、酶解溫度45 ℃、加酶量4 000 U/g、酶解時間3 h、底物濃度15%的條件下胰蛋白酶酶解鯉魚魚鱗的酶解能力較好。

表2中胰蛋白酶正交試驗的羥自由基清除率極差表明，影響胰蛋白酶酶解鯉魚魚鱗的因素大小順序為底物濃度、加酶量、pH、時間>溫度。正交試驗得到的較優(yōu)組合A3B2C1D3E1；直觀分析得出清除能力較優(yōu)條件是7號試驗組（A3B2C1D3E3），即pH 8.4、酶解溫度45 ℃、加酶量4 000 U/g、酶解時間3 h、底物濃度15%的條件下胰蛋白酶酶解鯉魚魚鱗抗氧化能力較好。

綜合考慮，最優(yōu)組合為正交試驗中的7號試驗組。

3結(jié)論

通過參照水解度和羥自由基清除率在鯉魚魚鱗酶解過程中的變化，最后得出了較佳的鯉魚魚鱗酶解工藝條件條件即pH 8.4、酶解溫度45 ℃、加酶量4 000 U/g、酶解時間3 h、底物濃度15%的條件下得到的魚鱗肽抗氧化能力較好。

通過試驗數(shù)據(jù)表明，胰蛋白酶在酶解鯉魚魚鱗的過程中，其水解度與羥自由基清除率是呈正相關(guān)的關(guān)系。

該試驗以胰蛋白酶為例，對魚鱗的水解度進(jìn)行研究。試驗過程中，魚鱗酶解液有較大的腥味，并且酶解液成品為黃色透明的液體。研究表明，胰蛋白酶酶解鯉魚魚鱗后得到的短肽有一定的抗氧化活性。由于胰蛋白酶在酶解鯉魚魚鱗的過程中水解度不是很高，所以可能導(dǎo)致其對魚鱗蛋白的回收率較低，從而影響了胰蛋白酶應(yīng)用的可行性，所以在此方面仍需進(jìn)一步研究。

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