羅健，王立民，張譯元，郭延華，唐紅，周平，劉守仁*

（1石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832003；2新疆農(nóng)墾科學院/綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖省部共建國家重點實驗室，新疆 石河子 832000）

綿羊母源基因TRIM28克隆、表達及生物信息學分析

羅健1,2，王立民2，張譯元2，郭延華2，唐紅2，周平2，劉守仁2*

（1石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832003；2新疆農(nóng)墾科學院/綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖省部共建國家重點實驗室，新疆 石河子 832000）

為了研究TRIM28基因在綿羊早期克隆胚胎發(fā)育過程中基因組去甲基化與重新甲基化及其維持的機制，探索母源關鍵基因在體細胞克隆效率中的作用，本研究通過提取中國美利奴細毛羊卵巢組織RNA，經(jīng)反轉錄獲得cDNA，利用特異性引物擴增TRIM28基因編碼區(qū)序列，測序后采用生物信息學軟件對編碼區(qū)序列及氨基酸序列進行相關生物信息學分析和結構預測，進一步采用RT-PCR對綿羊不同組織中TRIM28表達量進行檢測。結果顯示：克隆獲得了綿羊TRIM28基因編碼區(qū)序列全長2441 bp，編碼811個氨基酸。生物信息學分析結果表明，不同物種TRIM28基因編碼區(qū)核苷酸和氨基酸序列具有較高保守性。組織表達譜結果顯示，TRIM28 mRNA在中國美利奴細毛羊肺臟、脾臟和卵巢中高豐度表達，且與Zfp57表達情況一致。結論：TRIM28基因結構和進化方面高度保守，推測其在不同組織中行使轉錄中介因子這一特定的生物學功能相關，TRIM8與ZFP57復合體在分化組織中對基因組甲基化的維持起著重要作用。

TRIM28；Zfp57；母源基因；DNA甲基化；生物信息學

哺乳動物早期胚胎發(fā)育是由卵母細胞中儲存的特定RNA和蛋白來調(diào)控，這些因子是在卵子發(fā)生、成熟過程中合成并貯存，即母源基因。受精后，這些母源物質(zhì)指導和支持著早期胚胎發(fā)育，直至合子基因激活，部分母源因子甚至作用時間更久，所以母源基因表達模式對于早期胚胎發(fā)育的重要性已引起學者們的關注。母源基因的缺陷可能涉及不孕、流產(chǎn)、胎兒早產(chǎn)以及一些出生缺陷和先天性疾病。因此，闡明母源因子的功能及作用機制，對胚胎工程的發(fā)展具有重要作用。2012年Messerschmidt等[1]首次在小鼠上鑒定TRIM28作為母源因子，在植入前早期胚胎發(fā)育過程中對基因組甲基化印記維持與調(diào)控起著重要作用，母源TRIM28缺失可導致小鼠胚胎死亡，對早期胚胎發(fā)育至關重要。

TRIM28（又稱Tif1 β 或 Kap1）是一種轉錄調(diào)控因子，最早在1996年作為KRAB-ZFPs結構域的互作中介蛋白被發(fā)現(xiàn)[2]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TRIM家族蛋白超過75個，在N末端均擁有1個高度保守的結構域——RBCC（RING，B-boxes，coiled-coil）結構。通過這個特殊結構域，TRIM28與KRAB-ZFPs結合參與轉錄抑制調(diào)控。RING結構域是由40-60個氨基酸殘基結合到鋅原子上形成的特殊鋅指節(jié)構，具有激活E3泛素連接酶活性，與其它一些蛋白互作過程中發(fā)揮重要功能[3]。B-boxes結構域是B1和B2 2個各自由約40個氨基酸殘基構成的CH3H2鋅指結構，兩者同時存在或是只存在B2結構域，其功能未有明確報道。Coiled-coil結構域是由多個α-螺旋復合形成的超二級結構，在同源寡聚過程中起重要作用。與其它TRIM家族蛋白最大的區(qū)別是 TRIM28蛋白 C末端含有 HP1、PHD、BROMO 3個保守結構域，這些結構使得TRIM28能作為骨架蛋白，通過招募異染色質(zhì)蛋白1（HP 1）、組蛋白甲基化轉移酶SETDB1、組蛋白去乙?；窷uRD等染色質(zhì)修飾酶和轉錄抑制因子，共同作用啟動異染色質(zhì)形成，以達到抑制轉錄的作用[4-8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)TRIM28在哺乳動物基因沉默、DNA損傷修復、細胞增殖與分化、凋亡、免疫反應、腫瘤性轉化等多種細胞過程中發(fā)揮重要作用。

目前，TRIM28的研究主要集中在小鼠和人上，而其他動物的研究甚少，且綿羊TRIM28 CDS序列尚未見報?；诖?，本研究對綿羊TRIM28基因 CDS區(qū)序列進行了克隆并進行了組織表達譜分析和相關的生物信息學分析，旨在為TRIM28基因在綿羊卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育過程中的分子機理研究提供前期資料依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

成纖維細胞采自新疆農(nóng)墾科學院試驗羊場1只2歲中國美利奴細毛羊母羊，心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、卵巢取自試驗羊場3只體型一致、健康狀況良好的18-36月齡中國美利奴細毛羊，取出后迅速置于液氮保存，備用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成

參照Trizol Reagent(Invitrogen)說明書，分別提取中國美利奴羊各組織總 RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并利用核酸蛋白分析儀測定 RNA的濃度和純度。采用M-MLV FirstStrandKit（Invitrogen）反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈合成。

1.2.2 綿羊Trim28 cDNA的克隆

根據(jù)牛Trim28 mRNA序列（GenBank登陸號：BC148899.1）設計特異引物，由Invitrogen公司合成，引物序列及相關信息見表1。PCR擴增體系為25 μL， 其 中 5×PrimeSTAR Buffer5 μL、dNTP Mixture 2 μL、上下游引物 （10 μmol/L） 各 0.5 ddH2O 15.75 μL，綿羊卵巢 cDNA 1 μL。PCR 擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、56℃復性 30 s、72℃延伸 150 s，共 35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后將目的片段用Tiangen瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒對目的片段進行回收，回收片段克隆到pGEM-T Easy（Promega）載體，轉化 STBL3 感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒后送Invitrogen公司進行測序。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測綿羊不同組織中Trim28表達量

分別以中國美利奴細毛羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、卵巢組織cDNA為模板，以綿羊GAPDH為內(nèi)參，用Roche羅氏LightCycler 480II儀器進行實時熒光定量PCR檢測。反應體系25 μL，其中：2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，ddH2O 9.5 μL，綿羊各組織cDNA 1 μL。每個組織樣本設3個技術重復和3個生物學重復，并同時設無模板對照組。RT-qPCR條件為：95℃預變性5 min；98℃變性10 s、60℃復性和延伸30 s，共45個循環(huán)。擴增結束后，以 0.1℃/s的速度進行溶解曲線分析。分別讀取目的基因和持家基因的 CT值，利用ΔCt法(Qr=2－ΔΔCt)計算 TRIM28基因在綿羊不同組織中的相對表達量。

1.2.4 生物信息學分析

TRIM28基因序列比對及同源性分析使用DNAMAN及 NCBI網(wǎng)站在線分析工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）；蛋白質(zhì)親水性疏水性預測采用Epasy服務器上的 protscale程序（http://web.expasy.org/protscale/）；信號肽預測采用 SignalP 4.0；蛋白質(zhì)二級結構預測采用SOPMA軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)，并利用SWISS-MODLE軟件(http://swissmodel.expasy.org/)進行三級結構預測；使用MEGA6.0軟件構建系統(tǒng)進化樹。

表1 PCR引物Tab.1 Primers of PCR

2 結果與分析

2.1 不同組織RNA提取

各組織樣品總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，均可清晰見到18S、28S、5S條帶，無蛋白和基因組污染。核酸蛋白分析儀檢測所有樣品A260/A280均介于1.9-2.0。說明RNA質(zhì)量達到反轉錄要求。

2.2 綿羊TRIM28基因CDS區(qū)克隆及生物信息學分析

以中國美利奴細毛羊卵巢組織cDNA為模板，克隆獲得2441 bp目的片段，克隆測序后比對，與UCSC綿羊基因組序列100%一致，與GeneBank公布的牛TRIM28序列同源性達到97.62%，因此，確定其為綿羊TRIM28基因。

2.2.1 綿羊TRIM28蛋白的理化性質(zhì)

運用ExPASy軟件對綿羊TRIM28蛋白的氨基酸序列進行基本理化性質(zhì)分析，其分析結果（圖1）表明：蛋白總共811個氨基酸，分子量為86503.4 u，理論等電點pI=5.47；含有20種氨基酸，其中含量最高的是 Ala（10.1%），含量最低的是 Trp（0.6%）；280 nm的摩爾吸光系數(shù)為44400 M-1·cm-1；蛋白平均親水系數(shù)為–0.387。

圖1 綿羊TRIM28基因CDS堿基和氨基酸序列Fig.1 The nucleotide and amino acid sequence of sheep TRIM28 gene

2.2.2 蛋白親水/疏水性分析

運用ProtScale程序?qū)d羊TRIM28親水性/疏水性進行了分析，如圖2所示。第50位精氨酸（Arg）親水性最強（最低分值為-2.922）；第687位亮氨酸（Leu）疏水性最強(最高分值為1.778)。序列包含1個富含半胱氨酸的基序，可以與2個鋅離子以一種特異的交叉聯(lián)結體系結合。由于鋅離子的螯合作用，此區(qū)域形成了1個公共的疏水核心，而且在保守的連接區(qū)之間變化的序列則提供了蛋白相互識別、相互作用的特異性。

圖2 綿羊TRIM28蛋白疏水性分析Fig.2 Analysis of hydrophobicity of sheep TRIM28 protein

2.2.3 綿羊TRIM28蛋白高級結構預測

經(jīng)SOPMA服務器分析，綿羊的TRIM28蛋白二級結構由α-螺旋、延伸帶、β-折疊及無規(guī)則卷曲4種結構組成，其中各種結構所占比例分別為34.90%、14.67%、7.40%和43.03%。運用SWISS-MO DEL進行同源建模，結果（圖3）顯示：綿羊TRIM28蛋白的三級結構預測也是由α-螺旋、延伸帶、β-折疊及無規(guī)則卷曲構成。

圖3 綿羊TRIM28蛋白預測三級結及結構域Fig.3 Putative Tertiary structure of sheep TRIM28 protein

2.2.4 綿羊TRIM28同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中查找另外10個物種的TRIM28基因編碼蛋白序列，采用MegAlign軟件進行同源性比對分析，結果顯示其與其他物種具有較高同源性。用NJ法構建綿羊、人、狼、兔、牛、黑猩猩、鼠兔、馬、鼠、雞、駱駝、非洲爪蟾12個物種TRIM28基因的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），結果顯示，牛與綿羊在系統(tǒng)發(fā)育樹中關系最近。

圖4 不同物種TRIM28基因進化樹Fig.4 The evolution of TRIM28 bases sequences among different species

2.3 實時熒光定量PCR檢測TRIM28基因及相關互作基因在綿羊各個組織器官中的表達

以3只美利奴細毛羊不同組織的cDNA為模板，對 TRIM28、Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Zfp57、Setdb1和Gapdh基因的表達量進行實時熒光定量PCR檢測，TRIM28 mRNA在綿羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、卵巢組織中均有表達，TRIM28基因在肺臟中表達量最高，在肝臟中最低（圖5）。

圖5 綿羊TRIM28基因mRNA表達譜Fig.5 The TRIM28 gene mRNA expression patterns in different tissues of sheep

另外，對與其互作參與甲基化調(diào)控的基因進行了表達量的檢測，并用HemI 1.0：Heatmap Illustrator軟件繪制出各個基因在不同組織中表達量的熱點圖（圖6），熱點圖形象直觀描述出TRIM28基因和與其相互作用參與DNA甲基化調(diào)控的相關基因在綿羊不同組織中的差異表達情況。根據(jù)軟件的聚類分析結果，發(fā)現(xiàn)TRIM28與Zfp57在不同組織中的表達情況基本一致。

圖6 TRIM28及互作甲基化調(diào)控相關基因在綿羊不同組織中表達的聚類分析Fig.6 Clustering of differentially expressed TRIM28 and methylation-related genes in tissues of sheep

3 討論

（1）本研究克隆得到了綿羊TRIM28基因完整CDS序列，長度為2441 bp。 獲得的該基因核苷酸序列及所編碼的氨基酸序列與人、牛、豬、小鼠等動物核苷酸序列和氨基酸序列具有非常高的一致性，并且其蛋白結構與TRIM家族蛋白的典型保守結構域相符，說明其在不同物種間具有高度保守性，而這種高度保守結構也證明了綿羊TRIM28基因具有特定或是廣泛的生物學功能作用。

（2）本研究表明TRIM28在美利奴細毛羊不同分化組織中均有表達。與TRIM28在小鼠卵巢和早期胚胎中高表達相比較，在正常分化細胞中幾乎檢測不到存在差異，這種現(xiàn)象可能是物種差異造成。TRIM28在癌癥研究中較為熱門的是與肺癌有關，TRIM28在綿羊肺部組織中的表達量最高，這可能與其在肺部具有某些特定功能有關聯(lián)。目前對TRIM28蛋白確切功能及其作用機制尚不清楚，尤其是其作為母源因子涉及卵母細胞發(fā)育成熟和附植前早期胚胎發(fā)育過程中廣泛的生理生化功能。小鼠早期胚胎發(fā)育的研究表明，TRIM28能通過與ZFP57結合，作為中央支持骨架與H3K9組蛋白甲基轉移酶SETDB1，核小體重塑和組蛋白去乙?；瘡秃象wNuRD，異染色質(zhì)蛋白 HP1，DNA甲基轉移酶DNMT1，DNMT3A，DNMT3B組成一個多重功能的阻遏復合結構，在表觀重編程中起到印記基因甲基化維持作用。本研究通過檢測綿羊正常分化組織中上述基因的表達情況，聚類分析結果表明TRIM28與Zfp57表達情況最相似，這可能ZFP57/TRIM28復合結構在正常分化細胞分裂增殖過程中DNA甲基化的維持也同樣起著重要作用。

TRIM28是具有多重結構域的轉錄調(diào)控因子，與一系列基因的激活與抑制密切相關，涉及廣泛的生物學或生理學過程。TRIM28的表達異常直接導致細胞生長、發(fā)育、分化的紊亂[1，10-12]。腫瘤生物學上研究發(fā)現(xiàn)，TRIM28作為P53的輔阻遏物能夠結合到MDM2上，可抑制P53的表達和乙?；饔肹13]。TRIM28在癌細胞和腫瘤中表達量較正常組織升高，Lu Chen等發(fā)現(xiàn)TRIM28能通過HDAC1/E2F作用減緩早期肺癌細胞的增殖，揭示了其在抑制癌癥方面的重要作用[14]。近幾年，TRIM28在干細胞領域研究中成為熱點，研究發(fā)現(xiàn) TRIM28在精子生成，胚胎干細胞（ESCs）和誘導多能干細胞（iPS）的維持中發(fā)揮重要作用[15-18]。此外，除了作為轉錄調(diào)控因子的廣泛重要作用，TRIM28對發(fā)生在異染色質(zhì)區(qū)域的DNA雙鏈斷裂損傷修復也起著重要作用[19]。由于TRIM28在大動物早期胚胎發(fā)育過程方面的研究處于起步階段，其功能尚需進一步研究。

4 結論

采用RT-PCR技術獲得TRIM28基因完整的編碼區(qū)序列，其序列全長2441 bp，編碼811個氨基酸，與其他物種存在較高的相似性。TRIM28結構和進化的高度保守，可能與其在不同組織中行使轉錄中介因子這一特定的生物學功能相關。組織表達譜結果顯示，TRIM28 mRNA在中國美利奴細毛羊肺臟、脾臟和卵巢中高豐度表達，且與Zfp57 mRNA在所有檢測組織中表達情況一致。本實驗擴增的TRIM28基因為進一步研究TRIM28作為母源因子在卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育過程中所起的作用奠定了必要的基礎。

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Cloning and bioinformatics analysis of the CDS of ovis aries TRIM28 gene

Luo Jian1,2,Wang Liming2,Zhang Yiyuan2,Guo Yanhua2,Tang Hong2,Zhou Pin2*,Liu Shouren2*
(1 College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China;2 Key Laboratory for Sheep Improvement and Healthy Production,Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science,Shihezi,Xinjiang 832000,China)

In order to study the mechanisms of TRIM28 in the establishment of methylation and demethylation during somatic cell nuclear transfer (SCNT)early embryonic development，which could help to explain the role of key maternal factor for reprograming of somatic cell.The RNA was extracted from ovary,and cDNA was obtained by reverse transcription.Specific primers were designed to amplify the coding sequence of TRIM28 gene.The sequence of coding region and amino acid of TRIM28 were analyzed and predicted by bioinformatics methods.The expression patterns in different tissues were detected by real-time RT-PCR.The results showed that we obtained the sheep TRIM28 gene 2441 bp cDNA coding sequence,coding 811 amino acids.TRIM28 mRNA expression level showed that the levels were the highest in lung and the lowest in liver，which was in according with the level of Zfp57.The TRIM28 is highly conserved with other species and may act as an essential transcriptional regulator and a multifunctional adaptor protein with the same to model animals.Moreover,the Zfp57/Kap1 complex can play important role in epigenetic regulation system controlling of DNA methylation in the differentiated tissues.

TRIM28； Zfp57； maternal gene； DNA methylation； bioinformatics

S826.2

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.02.002

1007-7383(2017)02-0139-07

2016-03-24

國家轉基因重大專項（2014ZX08008001），國家自然科學基金項目（31160227、3166090049），新疆兵團種質(zhì)資源創(chuàng)新專項（2012BB042）

羅健(1989-)，男，碩士研究生，專業(yè)方向為動物遺傳育種與繁殖，e-mail:luojian_bio@126.com。

*通信作者：劉守仁（1934-），男，中國工程院院士，博士生導師，從事綿羊遺傳育種與繁殖研究，e-mail:nkyysb@163.com。