黃 姍，張夢澤（1.河南省口岸食品檢驗檢測所，鄭州 450003；.河南省食品藥品檢驗所，鄭州 450003）

HPLC法測定維格列汀片中的有關(guān)物質(zhì)

黃 姍1＊，張夢澤2（1.河南省口岸食品檢驗檢測所，鄭州 450003；2.河南省食品藥品檢驗所，鄭州 450003）

目的：建立測定維格列汀片中有關(guān)物質(zhì)的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為XterraMSC18，流動相為[磷酸鹽緩沖液-水-乙腈-甲醇（400∶600∶15∶15，V/V/V/V）]-[磷酸鹽緩沖液-乙腈-甲醇（400∶450∶150，V/V/V）]（梯度洗脫），流速為1.2m L/m in，檢測波長為210 nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為10μL。結(jié)果：雜質(zhì)A、B、C、D檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為18.80～188.0μg/m L（r＝0.999 5）、22.64～226.4μg/m L（r＝0.999 6）、21.74～217.4μg/m L（r＝0.999 7）、19.12～191.2μg/m L（r＝0.999 8）；檢測限分別為4.18、2.68、1.12、1.34μg/m L；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜3%；加樣回收率分別為97.9%～103.1%（RSD＝2.01%，n＝9）、98.8%～104.1%（RSD＝1.93%，n＝9）、98.0%～103.6%（RSD＝1.81%，n＝9）、100.8%～104.1%（RSD＝0.98%，n＝9）。結(jié)論：該方法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于維格列汀片中有關(guān)物質(zhì)的測定。

維格列汀片；有關(guān)物質(zhì)；高效液相色譜法

維格列?。╒ildagliptin）化學(xué)名為1-｛[（3-羥基-l-金剛烷基）氨基]乙酰基｝-2-氰基-（S）-四氫吡咯烷，是一種具有選擇性和口服活性的特異性二肽酰肽酶-4（DPP-4）抑制劑[1]，可以刺激胰島素基因表達(dá)和胰島素生物合成，屬于新一代口服降血糖藥物[2-4]。目前，我國關(guān)于維格列汀有關(guān)物質(zhì)的測定尚未見報道[5]。為更好地控制維格列汀片的質(zhì)量，筆者采用高效液相色譜法（HPLC）建立了測定該制劑中有關(guān)物質(zhì)的方法。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括二極管陣列檢測器（DAD）、色譜工作站（美國Agilent公司）；XP-205型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-250DV型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率：250W，頻率：40 kHz）；M illi-QAdvantageA10型超純水儀（美國M illipore公司）。

1.2 藥品與試劑

維格列汀片（上海太昊生物科技醫(yī)藥有限公司，批號：150701、150702、150703，規(guī)格：50mg/片）；維格列汀對照品（上海太昊生物科技醫(yī)藥有限公司，批號：131201，純度：99.8%）；雜質(zhì)A對照品（批號：1448-001A2，純度：97.6%）、雜質(zhì)B對照品（批號：1607-005A3，純度：95.7%）、雜質(zhì)C對照品（批號：1424-093A3，純度：99.6%）、雜質(zhì)D對照品（批號：1497-003A7，純度：98.1%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Xterra MSC18（50mm×4.6mm，3.5μm）；流動相：[磷酸鹽緩沖液-水-乙腈-甲醇（400∶600∶15∶15，V/V/V/V）]（A）-[磷酸鹽緩沖液-乙腈-甲醇（400∶450∶150，V/V/V）]（B），梯度洗脫（0～1 m in，100%A；2～6 m in，100%→90%A；7～11 m in，90%→30%A；12～21 min，30%A；22min，30%→100%A；23～28m in，100% A）；流速：1.2m L/min；檢測波長：210 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μL[6]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取雜質(zhì)A對照品9.40mg、雜質(zhì)B對照品11.32mg、雜質(zhì)C對照品10.87 mg、雜質(zhì)D對照品9.56mg，置于同一10m L量瓶中，加0.2%鹽酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）溶解并定容，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品細(xì)粉適量，精密稱定，置于50m L量瓶中，加0.2%鹽酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）適量，超聲處理5min使溶解，加0.2%鹽酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）定容，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得（常溫避光保存）。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的處方比例和制備工藝，取不含各待測雜質(zhì)和主成分的空白輔料適量，按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.2.4 系統(tǒng)適用性溶液 精密稱取維格列汀對照品504.1 mg，置于50 m L量瓶中，加0.2%鹽酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）定容，搖勻，即得維格列汀對照品貯備液。分別精密稱取雜質(zhì)A、B、C、D對照品適量，置于同一100m L量瓶中，精密加入上述維格列汀對照品貯備液10m L，加0.2%鹽酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）溶解并稀釋制成每1m L含維格列汀1mg和雜質(zhì)A、B、C、D各10μg的系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液和系統(tǒng)適用性溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度均＞1.5；理論板數(shù)以維格列汀峰計為8 700，保留時間為8.96 min。結(jié)果表明，其他成分對測定不干擾。

2.4 破壞性試驗

2.4.1 酸破壞樣品溶液 精密稱取樣品細(xì)粉適量（約相當(dāng)于維格列汀50mg）（批號：150701），置于50m L量瓶中，加2mol/L鹽酸溶液1m L，水?。?7℃）放置1 h，加2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為中性，加0.2%鹽酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）適量，超聲處理5 m in使溶解，再加0.2%鹽酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogramsof system suitability tests

2.4.2 堿破壞樣品溶液 精密稱取樣品細(xì)粉適量（約相當(dāng)于維格列汀50mg）（批號：150701），置于50m L量瓶中，加0.02mol/L氫氧化鈉溶液1m L，室溫避光放置1 h，加0.02mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH為中性，加0.2%鹽酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）適量，超聲處理5m in使溶解，再加0.2%鹽酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 氧化破壞樣品溶液 精密稱取樣品細(xì)粉適量（約相當(dāng)于維格列汀50mg）（批號：150701），置于50m L量瓶中，加30%過氧化氫溶液1m L，水?。?7℃）放置1 h，加0.2%鹽酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）適量，超聲處理5 m in使溶解，再加0.2%鹽酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）定容，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 高溫破壞樣品溶液 精密稱取樣品細(xì)粉適量（約相當(dāng)于維格列汀50mg）（批號：150701），置于50m L量瓶中，于105℃烘箱中避光放置3 h，加0.2%鹽酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）適量，超聲處理5m in使溶解，再加0.2%鹽酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.5 光照破壞樣品溶液 精密稱取樣品細(xì)粉適量（約相當(dāng)于維格列汀50mg）（批號：150701），置于50m L量瓶中，于（12 000±500）lx光照強(qiáng)度下放置24 h，加0.2%鹽酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）適量，超聲處理5m in使溶解，再加0.2%鹽酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）定容，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

取上述各破壞樣品溶液10μL，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖2。由圖2可知，樣品在酸、堿、氧化、高溫、光照破壞條件下均有一定程度的降解，但各降解產(chǎn)物之間及各降解產(chǎn)物與主峰之間均能達(dá)到良好分離（分離度＞1.5）。

圖2 破壞性試驗高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatogramsofdestructive tests

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液1.0、2.5、5.0、7.5、10m L，分別置于50m L量瓶中，加0.2%鹽酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）定容，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得系列混合對照品溶液。取上述系列混合對照品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測有關(guān)物質(zhì)質(zhì)量濃度（x，μg/m L）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

2.6 檢測限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，當(dāng)信噪比為3∶1時，得檢測限。結(jié)果，雜質(zhì)A、B、C、D的檢測限分別為4.18、2.68、 1.12、1.34μg/m L。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equationsand linear ranges

2.7 精密度試驗

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，雜質(zhì)A、B、C、D峰面積的RSD分別為0.98%、0.66%、0.71%、1.02%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：150701）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，雜質(zhì)A、B、C、D峰面積的RSD分別為2.89%、1.90%、1.66%、0.87%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗

取樣品（批號：150701）細(xì)粉適量（約相當(dāng)于維格列汀50mg），共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，雜質(zhì)A、B、C、D峰面積的RSD分別為0.56%、1.26%、0.77%、1.98%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗

取樣品（批號：150701）細(xì)粉適量，共9份，分別置于50m L量瓶中，加入低、中、高質(zhì)量的雜質(zhì)A、B、C、D對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 2 Resultsof recovery test（n＝9）

續(xù)表2Continued tab 2

2.11 樣品有關(guān)物質(zhì)測定

取3批樣品細(xì)粉各適量（約相當(dāng)于維格列汀50 mg），分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算各待測有關(guān)物質(zhì)的含量[7-8]，結(jié)果見表3（注：“-”為未檢出）。

表3 樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果（n＝3，%）Tab 3 Determ ination of related substancesofsamples（n＝3，%）

3 討論

筆者采用DAD檢測器對各待測有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果顯示雜質(zhì)A、B、C、D在200～400波長范圍內(nèi)均僅有末端吸收，輔料在210 nm處基本無吸收，不干擾各待測有關(guān)物質(zhì)范圍內(nèi)的測定，因此最終選擇210 nm作為本試驗的檢測波長。

綜上所述，本方法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于維格列汀片中有關(guān)物質(zhì)的測定。

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（編輯：劉 柳）

Determ ination of Related Substances in Vildagliptin Tabletsby HPLC

HUANG Shan1，ZHANG Mengze2（1.Henan Province Port Institute for Food Inspection and Testing，Zhengzhou 450003，China；2.Henan Provincial Institute for Food and Drug Control，Zhengzhou 450003，China）

OBJECTIVE：To establish amethod for the determination of related substances in Vildagliptin tablets.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Xterra MSC18column w ith mobile phase consisted of[phosphate buffer-water-acetonitrie-methanol（400∶600∶15∶15，V/V/V/V）]-[phosphate buffer-acetonitrile-methanol（400∶450∶150，V/V/V）]（gradient elution）at the flow rate of 1.2m L/min.The detection wavelength was set at 210 nm and column temperature was 35℃. The sample size was 10μL.RESULTS：The linear ranges were 18.80-188.0μg/m L for impurity A（r＝0.999 5），22.64-226.4μg/ m L for impurity B（r＝0.999 6），21.74-217.4μg/m L for impurity C（r＝0.999 7），19.12-191.2μg/m L for impurity D（r＝0.999 8）.The lim its of detection were 4.18，2.68，1.12，1.34μg/m L，respectively；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 3%；the recoveries of impurity A，B，C and D were 97.9%-103.1%（RSD＝2.01%，n＝9），98.8%-104.1%（RSD＝1.93%，n＝9），98.0%-103.6%（RSD＝1.81%，n＝9），100.8%-104.1%（RSD＝0.98%，n＝9），respectively.CONCLUSIONS：Themethod is simple and accurate，and can be used for the determ ination of related substances in Vildagliptin tablets.

Vildagliptin tablets；Related substances；HPLC

R927

A

1001-0408（2017）15-2138-04

2016-06-30

2017-01-12）

＊主管藥師，碩士。研究方向：食品、藥品分析及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電話：0371-66081055。E-mail：hs13695541@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.15.34