張靖彬　申松　羅永康　劉懷高

摘 要：為全面了解酶的種類、酶解時間及pH值對甲魚裙邊蛋白酶解物加工特性及抗氧化性的影響，采用風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶和雙酶（風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶）在各自的最適反應(yīng)條件下對甲魚裙邊蛋白進行酶解，得到酶解產(chǎn)物，并對其感官品質(zhì)、加工特性及抗氧化性進行研究。結(jié)果表明：雙酶酶解產(chǎn)物（HF+HP）在酶解2 h時具有較高的感官評分。3 種甲魚裙邊蛋白酶解產(chǎn)物均具有良好的溶解性，且酶解產(chǎn)物經(jīng)63 ℃、30 min熱處理后的溶解度仍保持在80%以上。與風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物（HF）和木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物（HP）相比，HF+HP具有較強的

ABTS+·清除能力和DPPH自由基清除能力，HP表現(xiàn)出較強的亞鐵離子螯合能力和總還原能力。HF的乳化性相對于HP和HF+HP較大，HP和HF+HP的乳化性無顯著差異。酶解時間和酶的種類會對甲魚裙邊蛋白酶解物的加工特性及抗氧化性產(chǎn)生較大影響。

關(guān)鍵詞：甲魚裙邊蛋白；酶解產(chǎn)物；感官品質(zhì)；加工特性；抗氧化性

Abstract： Processing properties and antioxidant activities of soft-shelled turtle calipash protein hydrolysates （SSTCPH） prepared with flavourzyme， papain or both （which were denoted HF， HP and HF + HP， respectively） were investigated. As a result， HF + HP obtained after 2 h of hydrolysis showed better sensory evaluation scores. For the processing properties， all three hydrolysates had good solubility at different pH. The hydrolysates exhibited good heat stability， showing more than 80% solubility at different pH after heating at 63 ℃ for 30 min. Compared with HF and HP， HF + HP exhibited higher scavenging activity against ABTS+· and DPPH radicals. On the other hand， HP showed higher ferrous ion chelating activity and reducing power. In addition， HF exhibited higher emulsion activity index （EAI） than HP and HF + HP. The results suggested that processing properties and antioxidant activities of SSTCPH were determined by the degree of hydrolysis （DH） and the enzyme type employed.

Key words： soft-shelled turtle calipash protein； hydrolysates； sensory quality； processing properties； antioxidant activities

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201706001

中圖分類號：TS254.1 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2017）06-0001-06

引文格式：

張靖彬， 申松， 羅永康， 等. 甲魚裙邊蛋白酶解物的加工特性及抗氧化性[J]. 肉類研究， 2017， 31（6）： 1-6. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201706001. http：//www.rlyj.pub

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甲魚（Trionyx sinensis）又稱鱉、團魚、腳魚或水魚，是一種珍貴的水生經(jīng)濟動物，具有補血、強骨、益智、抗疲勞、延年益壽之功效，是我國傳統(tǒng)的食療滋補佳品，也是高級保健食品的良好原料[1]。隨著人工養(yǎng)殖技術(shù)的快速發(fā)展，甲魚市場出現(xiàn)了供大于求的現(xiàn)象，2015年中國甲魚產(chǎn)量為341 588 t[2]，這也為甲魚的深加工和綜合利用帶來了機遇。

蛋白質(zhì)多肽鏈內(nèi)部存在活性功能區(qū)，在酶解過程中，蛋白質(zhì)被切割成較小的多肽，功能活性得以釋放[3]。

國內(nèi)外已對酶解動物蛋白開發(fā)食源活性肽進行了大量研究[4-7]，發(fā)現(xiàn)酶解產(chǎn)物的加工特性（溶解性、熱穩(wěn)定性及乳化性）及抗氧化性等生物活性與原料蛋白相比都得到了一定的改善。甲魚肉及甲魚裙邊富含蛋白質(zhì)[8]，是進行酶解的良好材料。目前對甲魚肉蛋白酶解的研究有很多[8-12]，但有關(guān)甲魚裙邊蛋白酶解及酶解產(chǎn)物加工特性及抗氧化性的報道較少。本研究以甲魚裙邊為原料，采用風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶和雙酶（風(fēng)味蛋白酶+木瓜蛋白酶）進行酶解，研究酶解產(chǎn)物的感官品質(zhì)、加工特性及抗氧化性，以期為甲魚裙邊蛋白的深加工和進一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲魚由浙江金大地農(nóng)業(yè)集團有限公司提供，個體質(zhì)量為（845.5±21.5） g，甲魚運回實驗室后進行宰殺，得到甲魚裙邊。

三硝基苯磺酸（trinitrobenzenesulfonic acid sol，TNBS，純度≥98%）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，純度≤100%）、啡咯嗪（純度≥97%）、2，2-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（2，2-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS，純度≥98%） 美國Sigma公司；木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UNICO-2007分光光度計 美國Unico公司；FE20實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FD-1PF冷凍干燥機 北京德天佑科技發(fā)展

有限公司；TGL-16A高速臺式離心機 上海安亭科技儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 甲魚裙邊蛋白酶解物的制備

甲魚裙邊→滅內(nèi)源性酶（90 ℃、15 min）→-20 ℃凍藏→解凍→粉碎機粉碎→與去離子水混合（1∶3.5，

m/V）→均質(zhì)→調(diào)節(jié)溫度（風(fēng)味蛋白酶組65 ℃，木瓜蛋白酶組55 ℃，雙酶組55 ℃）→加入蛋白酶酶解（酶與甲魚裙邊蛋白質(zhì)量比為1∶50）→分別在0、0.5、1、2、4、6、8 h取出酶解產(chǎn)物，滅酶（90 ℃、10 min）→離心（4 000 r/min、20 min）→取上清液→冷凍干燥→甲魚裙邊蛋白酶解產(chǎn)物。

1.3.2 感官評定

感官評定由10 名經(jīng)培訓(xùn)的專業(yè)人員共同完成，分別對甲魚裙邊蛋白酶解產(chǎn)物（質(zhì)量濃度為10g/100 mL的溶液）的顏色、風(fēng)味和滋味進行評價，每項滿分5 分，以3 項的平均分作為感官評分的最終得分，分數(shù)越高代表酶解產(chǎn)物的品質(zhì)越高，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.3.3 水解度測定

采用TNBS法[13]測定。

1.3.4 加工特性測定

1.3.4.1 溶解性

參照李雪等[14]的方法。稱取0.01 g酶解產(chǎn)物，用去離子水配制成10 mL的溶液，用1 mol/L的HCl或NaOH溶液將酶解產(chǎn)物溶液pH值分別調(diào)至4、7、8，10 000 r/min

條件下離心15 min，上清液中的蛋白質(zhì)含量采用雙縮脲法進行測定；將酶解產(chǎn)物溶解于0.5 mol/L的NaOH溶液中，測定其總蛋白含量。酶解產(chǎn)物的溶解性按照式（1）計算。

1.3.4.2 熱穩(wěn)定性

參考Fujiwara等[15]的測定方法。

1.3.4.3 乳化性

參考Pearce等[16]的測定方法，并作一定改進。吸取質(zhì)量濃度為1g/100 mL的酶解產(chǎn)物溶液3 mL于離心管中，邊攪拌邊加入1 mL花生油；將上述混合液在10 000 r/min條件下高速勻漿1 min，乳化后立即從離心管底部吸取乳濁液0.1 mL，加入9.9 mL質(zhì)量濃度為0.1 g/100 mL的十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），在500 nm波長處測定溶液的吸光度A0。酶解產(chǎn)物的乳化活性指數(shù)（emulsion activity indexes，EAI）按照式（2）計算。

1.3.5 抗氧化性測定

亞鐵離子螯合力的測定參考Tierney等[17]的測定方法；DPPH自由基清除率的測定參考Cai Luyun等[18]的測定方法；ABTS+·清除率的測定參考Re等[19]的測定方法；總還原能力的測定參考Sila等[20]的測定方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel 2010和SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計分析軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲魚裙邊蛋白酶解物的感官評分

由圖1可知，3 種酶解產(chǎn)物的感官評分均在酶解1 h內(nèi)有所增加，此后HF及HP的感官評分隨酶解時間的延長逐漸降低。在酶解時間相同時，HF+HP相比于HF及HP有較高的感官評分，但在酶解時間超過6 h后，3 種酶解產(chǎn)物的感官評分無顯著差異（P>0.05）。不同蛋白酶對蛋白質(zhì)的作用位點不同，導(dǎo)致酶解產(chǎn)物暴露出不同的氨基酸基團，因而產(chǎn)生不同的感官品質(zhì)。而隨著酶解時間的延長，酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量降低，并產(chǎn)生具有風(fēng)味物質(zhì)的游離氨基酸，因而產(chǎn)生不同的感官特性。結(jié)果表明，酶解產(chǎn)物的感官品質(zhì)受水解度及蛋白酶種類的影響，

HF+HP在酶解2 h時具有較高的感官品質(zhì)。

2.2 甲魚裙邊蛋白酶解物的水解度

由圖2可知，在酶解的前2 h，HF+HP和HF的水解度均隨酶解時間的延長顯著增加（P<0.05），而后隨酶解時間的延長，水解度的變化速率逐漸減緩；在酶解的前6 h，HP的水解度隨酶解時間的延長逐漸增加，之后變化相對緩慢，這與徐懷德等[9]有關(guān)甲魚蛋白水解研究中水解度的變化趨勢一致，此外，這一結(jié)果也與鱈魚、鲅魚等的研究結(jié)果類似[21]。Aissaoui等[22]指出，隨著水解時間的延長，水解液中游離氨基酸含量的增加會對水解產(chǎn)生抑制。酶解過程的0～6 h，HF+HP的水解度顯著高于HF和HP（P<0.05）。結(jié)果表明，雙酶酶解甲魚裙邊蛋白的酶解效果較單酶好。

2.3 甲魚裙邊蛋白酶解物的加工特性

2.3.1 溶解性

由圖3可知，甲魚裙邊蛋白酶解物在不同pH值下具有良好的溶解性（溶解度均高于70%）。pH 4及pH 8條件下甲魚裙邊蛋白酶解產(chǎn)物的溶解性總體上小于pH 7時的溶解性，即酶解產(chǎn)物在中性條件下的溶解性最高。李東萍等[23]得到了相似的研究結(jié)果，經(jīng)風(fēng)味蛋白酶及堿性蛋白酶酶解的鳙魚肉蛋白酶解產(chǎn)物的溶解性在pH 7時較pH 4時高。這一結(jié)果也與郭珊珊等[24]對鱈魚的研究結(jié)果類似。此外，酶解時間相同時，HF+HP的溶解性相對較高。酶解初期，產(chǎn)物的溶解性隨酶解度的增大而升高，但隨著酶解度的進一步增加，溶解性逐漸降低。

2.3.2 熱穩(wěn)定性

由圖4可知，各酶解產(chǎn)物經(jīng)63 ℃、30 min熱處理后，雖然溶解度有所下降，但熱穩(wěn)定性良好，溶解度均高于70%，各酶解產(chǎn)物在pH 8條件下的溶解度下降最少，仍在80%以上，其中，HF+HP在各pH值條件下的熱穩(wěn)定性良好，溶解度均在84%以上。甲魚裙邊蛋白酶解物具有良好的熱穩(wěn)定性可能是由于酶解使蛋白肽鏈展開，親水-疏水平衡得到改善，更容易與水分子形成氫鍵，降低了酶解物中蛋白質(zhì)分子之間凝集的可能性[14]。周亞迪等[25]對豬血漿蛋白進行酶解，得到的酶解產(chǎn)物也有較好的熱穩(wěn)定性。

2.3.3 乳化性

由圖5可知，甲魚裙邊蛋白酶解產(chǎn)物具有一定的乳化性，其中HF的乳化性相對HP和HF+HP較大，其乳化性隨酶解時間的延長而逐漸降低，而HP和HF+HP的乳化性在不同的酶解時間無顯著差異（P>0.05），這可能是由于在不同蛋白酶及不同酶解時間的作用下，酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量不同，從而影響了酶解產(chǎn)物在油/水界面的擴散和吸附以及具有適宜厚度和流變性質(zhì)的蛋白膜的形成[26]。

2.4 甲魚裙邊蛋白酶解物的抗氧化性

2.4.1 亞鐵離子螯合能力

由圖6可知，隨著酶解時間的延長，各蛋白酶酶解甲魚蛋白后所得酶解液的亞鐵離子螯合能力整體呈增大趨勢，這與Klompong等[27]對黃條紋鲹魚肉蛋白酶解產(chǎn)物亞鐵離子螯合率的研究結(jié)果相似，水解度越大，亞鐵離子螯合能力越強；此外，豬血漿蛋白酶解物的亞鐵離子螯合能力也隨水解度增加而增大[28]。酶解時間相同時，HP的亞鐵離子螯合能力顯著高于HF和HF+HP

（P<0.05），HF的螯合能力最低。

2.4.2 DPPH自由基清除率

由圖7可知，HP和HF+HP均具有較強的DPPH自由基清除能力，且顯著高于HF（P<0.05）。HP和HF+HP的DPPH自由基清除能力隨酶解時間的延長均無顯著差異，而HF的DPPH自由基清除能力隨酶解時間的延長顯著增強（P<0.05），這可能由甲魚裙邊蛋白所處的酶解體系不同所致。Ovissipour等[29]在對鳀狀棱鯡酶解產(chǎn)物抗氧化性的研究中指出，酶解產(chǎn)物中疏水性氨基酸的含量越高，其DPPH自由基清除能力越強。不同酶解產(chǎn)物間DPPH自由基清除能力的差異可能與酶解產(chǎn)物中疏水性氨基酸含量不同有關(guān)[30]。

2.4.3 ABTS+·清除率

清除能力均有所增加，隨著酶解時間的延長，不同酶解時間酶解產(chǎn)物的ABTS+·清除能力無顯著變化，與水解度的變化趨勢相似。Sai-Ut等[31]指出，ABTS+·清除率會隨水解度的增加而增大。在整個酶解過程中，HF+HP的ABTS+·清除能力顯著高于HF和HP（P<0.05），而HF的ABTS+·清除能力最低。

2.4.4 總還原力

由圖9可知，3 種酶解產(chǎn)物均具有較好的總還原能力，且隨著酶解時間的延長，總還原能力整體均呈增大的趨勢。酶解時間相同時，HP的總還原力高于HF和HF+HP，而HF和HF+HP的總還原力無明顯差異

（P>0.05）。隨著酶解時間的延長，酶解產(chǎn)物的活性肽序列不斷變化，酶解產(chǎn)生的肽段類型不同導(dǎo)致酶解產(chǎn)物的總還原能力不同[32]。

3 結(jié) 論

酶的種類和酶解時間均會對酶解產(chǎn)物的感官品質(zhì)有較大影響，HF+HP具有較高的感官評分。3 種蛋白酶酶解得到的甲魚裙邊蛋白酶解產(chǎn)物均具有良好的溶解性，酶解產(chǎn)物經(jīng)63 ℃、30 min熱處理后的溶解度仍保持在80%以上。酶解時間相同時，HF的乳化性相對HP和

HF+HP較大，而HP和HF+HP的乳化性無明顯差異。不同酶解產(chǎn)物具有不同的抗氧化特性，HF+HP具有較強的ABTS+·清除能力和DPPH自由基清除能力，而HP表現(xiàn)出較強的亞鐵離子螯合能力和總還原能力。

采用雙酶酶解2 h得到的甲魚裙邊蛋白酶解產(chǎn)物具有良好的感官品質(zhì)、加工特性及抗氧化性。

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