孫亞男 - 李文香,2 -,2 胡欣蕾 - 李 銘 于 戈 張 欣

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2. 山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

杏鮑菇多肽提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

孫亞男1SUNYa-nan1李文香1,2LIWen-xiang1,2胡欣蕾1HUXin-lei1李 銘1LIMing1于 戈1YUGe1張 欣1ZHANGXin1

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2. 山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

杏鮑菇；菌絲；多肽；抗氧化

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇菌絲體：山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)；

Sephadex-50葡聚糖凝膠：北京Solarbio公司；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、鄰二氮菲、H2O2溶液、鄰苯三酚、三氯乙酸、鹽酸、無水乙醇、2,2-二苯基-1-苦基苯肼(DPPH)等：均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-2000A型，上海亞榮精華有限公司；

電子天平：EP114C型，上海精科天平有限公司；

離心機(jī)：TD4K-Z型，德國Eppendorf公司；

恒溫水浴鍋：XMTD-8222型，上海精宏有限公司；

分光光度計(jì)：424 UV1101型，日本島津公司；

超凈工作臺(tái)：SW-CJ-2D型，蘇州凈化設(shè)備有限公司；

冷凍干燥機(jī)：LJG-10型，德國Christ公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 單因素試驗(yàn)

(1) pH值對杏鮑菇菌絲體多肽提取率的影響：配置pH分別為7.0，7.5，8.0，8.5，9.0的100 mmol/L磷酸鹽緩沖液，以料液比1∶10 (g/mL)，于4 ℃下浸提4 h，得到的粗提液測定蛋白含量，確定最佳提取pH。

(2) 提取時(shí)間對杏鮑菇菌絲體多肽提取率的影響：配置pH為6.5的100 mmol/L磷酸鹽緩沖液，以料液比1∶10 (g/mL)，于4 ℃下分別浸提2，4，6，8，10 h，得到的粗提液測定蛋白含量，確定最佳提取時(shí)間。

(3) 料液比杏鮑菇菌絲體多肽提取率的影響：配置pH為6.5的100 mmol/L磷酸鹽緩沖液，分別以料液比1∶8，1∶10，1∶12，1∶14，1∶16 (g/mL)，于4 ℃下浸提4 h，得到的粗提液測定蛋白含量，確定最佳提取料液比。

1.3.2 多因素綜合模擬試驗(yàn) 以杏鮑菇菌絲體為原料，pH、提取時(shí)間和液料比為自變量，多肽提取率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)。

1.3.3 杏鮑菇菌絲體多肽的純化 將上述所得杏鮑菇菌絲體提取液，用硫酸銨分級沉淀(30%，75%，100%)，于4 ℃下，3 000 r/min離心20 min，得到蛋白沉淀，用去離子水溶解沉淀，將其于30 kDa透析膜進(jìn)行透析，收集透析液，得到分子質(zhì)量小于30 kDa純凈多肽。

1.3.4 杏鮑菇菌絲體多肽的分離 用Sephadex-50葡聚糖凝膠進(jìn)行純化。洗脫流速：每5 min 4～5 mL。

1.3.5 多肽抗氧化活性研究

(1) 多肽相對還原力的測定：在10 mL試管中加入不同濃度的多肽溶液各1.0 mL，然后加入磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L， pH=6.6)3 mL和K3[Fe(CN)6](1%)溶液3 mL，水浴溫度保持在50 ℃，反應(yīng)20 min。反應(yīng)結(jié)束后冷卻，再加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL混勻，3 000 r/min離心10 min。離心完畢后，試管中依次加入2.5 mL上清液、2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1% FeCl3溶液，反應(yīng)10 min(條件為室溫)，然后測吸光度(波長為700 nm)[7]，以抗壞血酸和BHT作對照。

(1)

式中：

H——清除率，%；

A1——鄰苯三酚自氧化速率；

A2——加多肽液后鄰苯三酚的自氧化速率。

(3) 多肽對·OH的清除能力測定：取不同濃度的多肽溶液1.0 mL，加入濃度9 mmol/L FeSO4溶液和濃度9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液各1.0 mL，混勻后加入1.0 mL 8.8 mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃水浴30 min，于510 nm處測定吸光值?？瞻讓φ諡檎麴s水代替水楊酸[9]，以抗壞血酸和BHT作對照。清除率按式(2)計(jì)算：

(2)

式中：

S——清除率，%；

A0——空白對照液的吸光度；

A1——加入多肽溶液后的吸光度；

A2——無顯色劑時(shí)多肽的自身吸收值。

(4) 多肽對DPPH自由基的清除能力測定：1.0 mL多肽溶液和4.0 mL DPPH混合為反應(yīng)體系，1.0 mL 50%乙醇溶液和4.0 mL多肽溶液混合為空白組，1.0 mL 50%乙醇溶液和4.0 mL DPPH混合為對照組[9]，將各組靜置室溫暗處，反應(yīng)30 min，測吸光值(517 nm)，以抗壞血酸和BHT作對照。清除率按式(3)計(jì)算：

(3)

式中：

F——清除率，%；

A1——多肽溶液吸光值；

A2——空白組吸光值；

A3——對照組吸光值。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 所有試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.0和SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理和差異顯著性分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 pH對多肽提取率的影響 由圖1可知，隨著緩沖液pH值的增大，杏鮑菇菌絲體多肽的提取率先增大后減小，在pH值為8.5時(shí)，提取率最大，pH值大于8.5后提取率逐漸下降，可能是堿性增強(qiáng)會(huì)使蛋白變性。所以，提取pH值為8.5時(shí)較為合適。

圖1 pH值對多肽提取率的影響Figure 1 Effect of pH on extraction yield of polypeptide

2.1.2 提取時(shí)間對多肽提取率的影響 由圖2可知，提取時(shí)間對杏鮑菇菌絲體多肽的提取率有一定的影響。隨著提取時(shí)間的延長，多肽的提取率先增加后減小，提取4 h時(shí)多肽提取率達(dá)到最大值，4 h后多肽提取率逐漸下降，這是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的延長杏鮑菇菌絲體粉末內(nèi)的蛋白質(zhì)充分溶出，在提取4 h后多肽提取率隨時(shí)間延長而減少，可能是長時(shí)間的浸提造成部分多肽鏈斷裂損失，從而影響蛋白提取率，所以提取4 h較為合適。

圖2 提取時(shí)間對多肽提取率的影響Figure 2 Effect of extract time on extraction yield of polypeptide

2.1.3 料液比對多肽提取率的影響 料液比是影響杏鮑菇菌絲體多肽提取率的另一重要因素。由圖3可知，隨著料液比的增加，多肽的提取率先增加后減小，當(dāng)料液比為1∶12 (g/mL)時(shí)多肽提取率達(dá)到最大值，隨后多肽提取率逐漸下降，這是因?yàn)槿軇┹^少時(shí)，蛋白擴(kuò)散阻力較大，溶出率小，隨著溶劑用量的增加，蛋白更容易溶入溶劑中，提取率隨之增加，當(dāng)溶劑用量過大時(shí)，部分溶質(zhì)會(huì)殘留在水相中造成損失，而且不利于后續(xù)的減壓濃縮，增加提取成本，這與羅璇等[10]的研究結(jié)果相一致，綜合考慮，提取料液比為1∶12 (g/mL)較為合適。

圖3 料液比對多肽提取率的影響Figure 3 Effect of liquid-to-material ratio on extraction yield of polypeptide

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

根據(jù)試驗(yàn)因素和水平的要求，設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，將所得的數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0.6軟件分析，以提取時(shí)間、pH值和液料比為自變量，以多肽提取率Y為因變量建立提取杏鮑菇菌絲體多肽工藝的二次回歸方程，方程為：

(4)

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in BBD

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 BBD and corresponding results for response surface

表3 BBD方差分析結(jié)果?Table 3 BBD variance analysis results

2.3 響應(yīng)面交互作用分析

如圖4所示，響應(yīng)面坡度較為陡峭，等高線相對較為密集，表明響應(yīng)值(多肽提取率)對兩兩因素交互作用的改變較為敏感，等高線沿pH值軸變化的趨勢明顯高于浸提時(shí)間軸和料液比軸；等高線沿料液比軸變化的趨勢明顯高于浸提時(shí)間軸。由此推知，各因素對杏鮑菇菌絲體多肽提取率的影響程度從大到小依次為：pH值>料液比>提取時(shí)間。響應(yīng)面曲線越陡，說明所對應(yīng)因素對響應(yīng)值的影響也越顯著，這和方差分析的結(jié)果相一致。各因素在所選取的范圍內(nèi)均能得到最佳響應(yīng)值，說明各因素所選擇的試驗(yàn)范圍合理有效。

2.4 響應(yīng)面模型的驗(yàn)證

利用響應(yīng)面分析得到杏鮑菇菌絲體多肽提取工藝的最佳組合為pH值8.85，料液比1∶11.86 (g/mL)，提取時(shí)間4.17 h，最高多肽提取率預(yù)測值為50.88%。出于對實(shí)際操作可行性考慮，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)需根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)條件稍加修改為：pH值8.9，料液比1∶11.9 (g/mL)，提取時(shí)間4.2 h，多肽提取率實(shí)際值為(50.76 ± 0.05)%，相對誤差0.24%，實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測值之間有很好的一致性，因此，該模型較準(zhǔn)確可靠。

2.5 杏鮑菇菌絲體多肽的鑒定

由圖5可知，杏鮑菇菌絲體提取液在220 nm處有最大吸收峰，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液相一致(肽鍵吸收波長200～230 nm)，所以該提取液為蛋白提取液。

2.6 杏鮑菇菌絲體多肽的純化

由圖6可知，經(jīng)過Sephadex-50葡聚糖凝膠過濾后的杏鮑菇菌絲體多肽溶液經(jīng)蒸餾水洗脫后，洗脫曲線上出現(xiàn)了2個(gè)明顯的波峰，分別在10 min和40 min左右。在10 min出現(xiàn)的波峰可能為相對分子量較大的肽，所以先被洗脫下來，后出現(xiàn)的波峰可能為較小分子的肽。之后的溶液在595 nm下幾乎無吸收值，可知多肽已全被洗脫下來。分別收集2個(gè)多肽組分，進(jìn)行其抗氧化活性的研究。

圖4 各兩因素交互作用對多肽提取率影響的曲面圖和等高線圖Figure 4 Response surface showing the effects of four variables on the extraction yield of polypeptide

圖5 杏鮑菇菌絲體多肽和標(biāo)準(zhǔn)蛋白紫外掃描Figure 5 Pleurotus eryngii mycelium polypeptide and standard sample UV scan

圖6 杏鮑菇菌絲體多肽Sephadex-50葡聚糖 凝膠層析圖(595 nm)Figure 6 The Sephadex-50 chromatography of Pleurotuseryngii mycelium polypeptide

2.7 多肽抗氧化活性分析

2.7.1 杏鮑菇菌絲體多肽相對還原力的測定 杏鮑菇菌絲體多肽的還原能力可以作為其潛在抗氧化活性的重要指標(biāo)[13]。由圖7可知，在0.1～1.0 mg/mL有效質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增大，兩個(gè)菌絲體多肽組分還原能力逐漸增強(qiáng)，雖然其還原能力顯著低于同濃度的VC，但是Fr.1的還原力顯著高于同濃度BHT的還原能力(P<0.05)，F(xiàn)r.2的還原力與同濃度BHT的還原能力差異不顯著(P>0.05)；在1 mg/mL濃度時(shí)，F(xiàn)r.1的還原力約為同濃度VC還原力的50%，因此，從杏鮑菇菌絲體中提取的多肽Fr.1具有較強(qiáng)的還原力。

圖7 杏鮑菇菌絲體多肽還原力(700 nm)Figure 7 Reducing power of Pleurotus eryngiimycelium polypeptide

圖8 杏鮑菇菌絲體多肽對?的清除能力Figure 8 Scavenging effects of Pleurotus eryngiimycelium polypeptide on ? radicals

圖9 杏鮑菇菌絲體多肽對·OH的清除能力Figure 9 Scavenging effects of Pleurotus eryngiimycelium polypeptide on ·OH radicals

2.7.4 多肽對DPPH·的清除能力測定 由圖10可知，隨著多肽濃度的增加，其對DPPH·的清除能力逐漸增強(qiáng)，在濃度達(dá)到0.4 mg/mL以后,清除率基本保持穩(wěn)定。相同濃度下，多肽Fr.1對DPPH·的清除率顯著高于BHT和Fr.2，低于VC；Fr.2對DPPH·的清除率顯著高于BHT(P<0.05)。因此，可以推斷杏鮑菇菌絲體多肽具有清除DPPH·的能力。

圖10 杏鮑菇菌絲體多肽對DPPH·的清除能力

Figure 10 Scavenging effects ofPleurotuseryngiimyceli-um polypeptide on DPPH free radicals

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化杏鮑菇菌絲體提取多肽工藝，建立了多元回歸模型，該模型高度顯著，擬合度好。多肽提取最佳條件為pH值8.85，提取時(shí)間4.17 h，提取料液比1∶11.86 (g/mL)，多肽提取率理論值為50.88%，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證值為(50.76 ± 0.05)%，相對誤差0.24%，說明回歸模型準(zhǔn)確性、可靠性較高。杏鮑菇菌絲體多肽具有還原力并對超氧陰離子自由基、羥基自由基和DPPH自由基有明顯的清除作用，說明杏鮑菇菌絲體多肽具有一定的抗氧化活性，這為杏鮑菇菌絲體多肽功能性食品開發(fā)提供科學(xué)理論依據(jù)。但是，杏鮑菇菌絲體多肽的組成及構(gòu)效關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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Optimization Extraction of polypeptide fromPleurotuseryngiimycelium and Its Antioxidationinvitro

(1.FoodScienceandEngineeringCollege,QingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao,Shandong266109,China;2.ShandongProvincialLaboratoryofAppliedMycology,Qingdao,Shandong266109,China)

The optimal extraction conditions of polypeptide fromPleurotuseryngiimycelium was ivestigated, and activity of the antioxidant was evaluated in this study. Based on the single-factor tests, the extraction conditions of polypeptide fromP.eryngiimycelium were optimized by Response Surface Methodology(RSM) to increase the extraction rate of polypeptide. Moreover, the polypeptide was purified with Sephadex-50, and the antioxidant activity of polypeptide was assessed using several assay model systems in vitro. The optimal extraction conditions of polypeptide were pH 8.85, extraction time 4.17 h, liquid-to-material ratio 1∶11.86 (g/mL). Under the optimal extraction conditions, the maximum extraction rate of polypeptide was 50.88%. Extracted polypeptide showed good antioxidant activity in a dose-dependent manner.

Pleurotuseryngii; mycelium; polypeptide; antioxidant activity

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.04.028

湖南省科技廳2015年重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2015NK3018)

陳偉，男，吉首大學(xué)在讀本科生。

李加興(1969-)，男，吉首大學(xué)教授，博士。 E-mail: jslijiaxing@163.com

2017—02—22