唐健新+區(qū)桂姍+蘇章軒+徐萬(wàn)幫+梁生旺

【摘要】目的：對(duì)沉香中黃曲霉毒素進(jìn)行測(cè)定。方法：采用柱后衍生-HPLC聯(lián)用技術(shù)，測(cè)定沉香中黃曲霉毒素的含量，了解所獲沉香中黃曲霉毒素污染情況。結(jié)果：按照《中國(guó)藥典》2015版的要求與指導(dǎo)原則， 69批次沉香樣品均未檢出黃曲霉毒素。結(jié)論：柱后衍生-HPLC聯(lián)用技術(shù)測(cè)定沉香中黃曲霉毒素方法可行，我國(guó)沉香黃曲霉毒素未受到黃曲霉毒素污染。

【關(guān)鍵詞】沉香；黃曲霉；柱后衍生-HPLC

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.1【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2017）11-0031-05

黃曲霉毒素是真菌毒素中毒性最強(qiáng)的一種真菌毒素，具有極強(qiáng)的毒性和致癌性。在自然界中，無(wú)論是土壤、腐爛有機(jī)質(zhì)物品與植物纖維、農(nóng)產(chǎn)品或者其他食品上都有黃曲霉毒素存在。黃曲霉最適宜生存在相對(duì)濕度 85%左右的熱帶、亞熱帶地區(qū)并產(chǎn)生黃曲霉毒素。我國(guó)地域十分遼闊以及氣候的多樣性和復(fù)雜性導(dǎo)致我國(guó)中藥材和中藥飲片在加工、貯藏、運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中，很容易發(fā)生霉變而導(dǎo)致被黃曲霉毒素污染。因此，檢測(cè)中藥材中黃曲霉毒素具有極其重要的意義[1-4]。

目前2015版《中國(guó)藥典》僅僅對(duì)少數(shù)幾種中藥材規(guī)定有關(guān)黃曲霉毒素含量的限度標(biāo)準(zhǔn)，如陳皮，胖大海等。沉香是我國(guó)的名貴中藥材之一，2016年廣東省通過(guò)立法保護(hù)廣東八種道地中藥材，沉香為其中之一。由于沉香主產(chǎn)越南、海南和廣東等熱帶和亞熱帶地區(qū)，該地區(qū)的環(huán)境條件極易被黃曲霉等真菌類(lèi)污染而產(chǎn)生黃曲霉毒素。因此，筆者擬采用柱后衍生與高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)[5-8]，通過(guò)對(duì)沉香進(jìn)行黃曲霉毒素測(cè)定，建立沉香中黃曲霉毒素含量測(cè)定的方法，為監(jiān)管部門(mén)提供技術(shù)支持。

1儀器與材料

11儀器Waters 2695/2475高效液相色譜儀及柱后衍生系統(tǒng)；色譜柱：Shim-pack CLC-ODS C18（150mm×6mm，5μm）、phenomenex gemini C18（250mm×46mm，5μm）、Thermo ODS-2 HYERSIL（200mm×46mm，5μm）、Agilent Zorbax SB-C18（250mm×46mm，5μm）； 離心機(jī)：Thermo Scientific Multifuge X1R

12材料黃曲霉素混合對(duì)照品（批號(hào)：46304-U LB8422，B1、B2、G1、G2純度分別為990%、990%、997%、995% ，Supelco Analitical）。甲醇、乙腈均為色譜純；水為試驗(yàn)室自制去離子水。005%碘溶液：取05g碘，溶解在100mL甲醇中，用水稀釋至1000mL（現(xiàn)配現(xiàn)用）。樣品：69批沉香樣品，來(lái)源于國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)，所有樣品均經(jīng)過(guò)本單位教授鑒定。

2方法與結(jié)果

21色譜條件以甲醇-乙腈-水（22∶18∶60）為流動(dòng)相，流速為10mL/min；衍生溶液為005%的碘溶液，衍生化泵流速03mL/min，衍生化溫度70℃。熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm。供試品溶液進(jìn)樣量50μL。

22樣品的制備

221對(duì)照品溶液的制備精密量取黃曲霉素混合對(duì)照品（B1、B2、G1、G2濃度分別為10μg/mL、03μg/mL、10μg/mL、03μg/mL）05mL，用甲醇定容至10mL，作為儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液1mL，用70%甲醇定容至25mL，搖勻，即得。

222供試品溶液的制備取沉香藥材粉末2份，每份10g，于錐形瓶中，精密稱(chēng)定，加入氯化鈉3g，精密加入70%甲醇75mL，超聲20min，離心5min（10000rpm），精密量取上清液15mL，于50mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。離心5min（10000rpm），用045μm孔徑的濾膜過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液20mL，通過(guò)免疫親和層析柱，流速2d/s，用20mL水分2次洗脫，棄去洗脫液，并通過(guò)約2mL空氣。用15mL甲醇分次洗脫，收集洗脫液，置2mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

223回收溶液的制備取沉香藥材粉末6份（批號(hào)：120921YF03），每份10g，于錐形瓶中，精密稱(chēng)定，加入02mL黃曲霉素混合對(duì)照品儲(chǔ)備液（B1、B2、G1、G2濃度分別為00495μg/mL、001485μg/mL、004985μg/mL、0014925μg/mL）外，其余同試驗(yàn)供試品溶液的制備方法。

224空白溶液的制備精密量取2份經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)黃曲霉毒素的沉香樣品，每份10g，于錐形瓶中，其余同試驗(yàn)供試品溶液的制備方法，制備空白溶液。

225測(cè)定按2015版《中國(guó)藥典》四部中，黃曲霉毒素測(cè)定法項(xiàng)下所述內(nèi)容進(jìn)行操作和檢測(cè)。

23方法學(xué)驗(yàn)證

231加樣回收率試驗(yàn)根據(jù)《中國(guó)藥典》四部有關(guān)要求可知：

y回收率=測(cè)得量-樣品中本底含量對(duì)照品加入量×100%

試驗(yàn)將133中所獲得的回收溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法獲得沉香中黃曲霉毒素加樣回收率。如圖1所示。

從表1可知，黃曲霉毒素B1、G1回收率在70%～110%之間，黃曲霉毒素B2、G2回收率在75%～110%之間，符合2015版《中國(guó)藥典》四部中黃曲霉毒素測(cè)定法項(xiàng)下規(guī)定的要求。

232精密度以混合對(duì)照黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2溶液為參照指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行精密度考察，精密吸取對(duì)照品溶液25μL，注入液相色譜儀，重復(fù)測(cè)定6次，即得。結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2可知，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2在上述色譜條件下精密度良好，相關(guān)的RSD為分別為101%、087%、109%和092%，符合2015版《中國(guó)藥典》四部中黃曲霉毒素測(cè)定法項(xiàng)下規(guī)定的要求。

233專(zhuān)屬性考察以制備的空白溶液為參照指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行專(zhuān)屬性考察，分別精密吸取空白溶液、對(duì)照品溶液和樣品溶液25μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。如圖2～4所示。

從圖2～4可知，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2在上述色譜條件下空白無(wú)干擾，四種有效成分的分離度良好符合2015版《中國(guó)藥典》四部中黃曲霉毒素測(cè)定法項(xiàng)下規(guī)定的要求。

234線性關(guān)系采用逐步稀釋法，獲取系列不同濃度的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的混合對(duì)照溶液25μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。根據(jù)色譜峰面積和相應(yīng)的稀釋倍數(shù)（濃度），根據(jù)waters高效液相色譜儀自帶的處理程序，獲得相應(yīng)的線性關(guān)系。見(jiàn)表3。

從表3可知，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2在指定的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于099，符合2015版《中國(guó)藥典》四部中黃曲霉毒素測(cè)定法項(xiàng)下規(guī)定的要求。

24耐用性的考察

241不同色譜柱的考察由于在測(cè)定的沉香樣品中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品，故采用對(duì)照溶液對(duì)不同色譜柱進(jìn)行考察。照含量測(cè)定項(xiàng)下方法操作，采用四根不同規(guī)格的色譜柱測(cè)定對(duì)照溶液中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量，為了更好的體現(xiàn)色譜柱的性能比較，本次試驗(yàn)以黃曲霉毒素B1為代表，分別從測(cè)定的含量、理論塔板數(shù)、分離度以及對(duì)稱(chēng)因子四個(gè)方面對(duì)色譜柱進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表4。

可知，四根不同的色譜柱均能有效分離與準(zhǔn)確測(cè)定黃曲霉毒素B1。說(shuō)明該方法的色譜柱要求不高，大部分色譜柱均能滿足對(duì)沉香樣品中黃曲霉毒素的測(cè)定。

242穩(wěn)定性試驗(yàn)取精密吸取黃曲霉毒素B1濃度為00198μg/mL的對(duì)照溶液25μL注入液相色譜儀，分別在0、8、13、18、25、30小時(shí)測(cè)定其含量，結(jié)果表明，樣品在30h內(nèi)穩(wěn)定。

243方法檢出限取對(duì)照品溶液（黃曲霉毒素B1濃度為000198μg/mL），采用逐步稀釋法，并將逐步稀釋后的溶液，精密量取25μL注入色譜儀，記錄色譜圖。如圖5所示。

試驗(yàn)以黃曲霉毒素B1的值為基準(zhǔn)，用儀器自帶的計(jì)算軟件，當(dāng)黃曲霉毒素B1信噪比約33：1，以此計(jì)算方法檢出限，符合儀器分析中儀器檢測(cè)限的相關(guān)要求。此時(shí)，以黃曲霉毒素B1計(jì)，沉香中黃曲霉毒素的檢測(cè)限約為02μg/kg。

25樣品中黃曲霉毒素含量測(cè)定采用上述方法，分別對(duì)所有69批次的沉香樣品進(jìn)行黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量測(cè)定，結(jié)果均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)沉香樣品被黃曲霉毒素污染。

3結(jié)論

建立柱后衍生法測(cè)定沉香中黃曲霉毒素的方法，并對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果該表明方法良好。分別對(duì)所獲得的69批沉香樣品進(jìn)行黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量測(cè)定，均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)沉香樣品被黃曲霉毒素污染，說(shuō)明我國(guó)沉香藥材受到黃曲霉毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)較小。

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（收稿日期：2017-03-24編輯：梁志慶）