劉威+曹敏娟+尚翔+姚樹(shù)永?í?

【摘要】目的：建立同時(shí)測(cè)定人血清中奧氮平、富馬酸喹硫平濃度的高效液相色譜法。方法：血清樣品以乙醚進(jìn)行提取并測(cè)定，Hypersil C18反相柱 （150mm×46mm， 5μm）為色譜柱，流動(dòng)相為25mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH60，內(nèi)含05%三乙胺）-乙腈（65∶35，V/V），流速為10mL/min，柱溫為40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。結(jié)果：奧氮平在100～2500μg、富馬酸喹硫平在500～10000μg范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系；奧氮平、富馬酸喹硫平的低、中、高3種濃度相對(duì)平均回收率分別為1033%、1008%、987% 和975%、982%、1011%，日內(nèi)、日間RSD均低于10% （n=5）。奧氮平和富馬酸喹硫平的檢測(cè)限均為50μg/L。結(jié)論：該方法靈敏、準(zhǔn)確，可用于臨床奧氮平和富馬酸喹硫平的血藥濃度監(jiān)測(cè)。

【關(guān)鍵詞】高效液相色譜法；奧氮平；喹硫平；血藥濃度

【中圖分類(lèi)號(hào)】R9141【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2017）11-0036-03

RP-HPLC Method for the Determination of Human Plasma of Olanzapine and Quetiapine Concentration

LIU WeiCAO MinjuanSHANG XiangYAO Shuyong

Suzhou Psychiatric Hospital， Suzhou 215000，China

Objective To establish a method for determination olanzapine and quetiapine in human serum by RP-HPLC.Methods The analytes were extracted after serum samples had been alkalinized. The HPLC separation of the analytes was performed on a reversed-phase Hypersil C18 column，using 25mmol·L-1 phosphat buffer （pH60，containing 05% triethylamine）-acetonitrile （65∶35， V/V） as mobile phase， with a flow-rate of 10mL·min-1 anda detective wavelength of 254nm.The temperature of the column was 40℃.Results The calibration curves were linear in the ranges of 100～2500μg·L-1 for olanzapine， 500～10000μg·L-1 for quetiapine respectively. The relation of peak area and concentration showed linear in the range of the average recoveries of olanzapine and quetiapine at high，middle and low concentrations were 1033%、1008%、987% and 975%、982%、1011% respectively. The intra-day and inter-day variations RSD were less than 10% （n=5）. The minimum detectable concentration of both olanzapine and quetiapine were 50μg·L-1.Conclusion The method is accurate， sensitive and simple for routine therapeutic drug monitoring （TDM） and for the study of the pharmacokinetics of olanzapine and quetiapine.

RP-HPLC ； Olanzapine ； Quetiapine ； Serum Drug Concentration

奧氮平（Olanzapine）和富馬酸喹硫平（Quetiapine Fumarate）均為新型非典型抗精神病藥[1]。奧氮平屬于5-羥色胺（5-Hydroxy Tryptamine，5-HT）和多巴胺（Dopamine，DA）受體拮抗劑，能改善腦內(nèi)多種神經(jīng)通路功能，對(duì)于改善精神分裂癥的陽(yáng)性和陰性癥狀均有明顯效果[2]。富馬酸喹硫平的化學(xué)結(jié)構(gòu)與奧氮平相似，屬二苯二氮類(lèi)衍生物，為腦內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)受體拮抗劑，主要作用于中樞多巴胺D1、D2和5-HT1、5-HT2等受體[3]。臨床上，奧氮平和富馬酸喹硫平常聯(lián)合用于治療復(fù)雜的精神分裂癥[4-5]。由于精神藥物血藥濃度具有個(gè)體差異性大、安全范圍窄等特點(diǎn)，因此進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)是十分必要的。近年來(lái)，檢測(cè)奧氮平與喹硫平血藥濃度的方法主要有高效液相電化學(xué)法（HPLC-ECD）、高效液相-質(zhì)譜法（HPLC-MS）等[6-8]。但尚未見(jiàn)采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定奧氮平和喹硫平血藥濃度的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，實(shí)驗(yàn)建立一種同時(shí)測(cè)定奧氮平和喹硫平血藥濃度的高效液相色譜法，該方法靈敏、準(zhǔn)確，為臨床用藥提供依據(jù)，節(jié)約分析時(shí)間。

1儀器與試劑

11儀器Agilent 1260高效液相色譜儀（包括G1314F紫外檢測(cè)器、G1316A柱溫箱、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、G1311C多元泵、G1322A真空脫氣機(jī)、Agilent Chem32化學(xué)工作站）；KS-120D型超聲波清洗機(jī)（新芝儀器廠）；XW-80A型旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；電子分析天平（美國(guó)OHAUS）。

12材料奧氮平（批號(hào)：100948-201501）、富馬酸喹硫平（批號(hào)：100815-201202）、阿米替林（批號(hào)100518-201303）對(duì)照品均源于中國(guó)食品藥品檢定研究院。奧氮平（批號(hào)：160204，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司）；喹硫平（批號(hào)：B151133，湖南洞庭藥業(yè)股份有限公司）。

空白血清由蘇州市廣濟(jì)醫(yī)院血站提供。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

21色譜條件色譜柱：Hypersil ODS柱（150mm×46mm，5μm）；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液（pH60，內(nèi)含05%三乙胺）-乙腈（65∶35.V/V），使用045μm微孔濾膜負(fù)壓過(guò)濾；流速：10mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm，柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20μL。

22對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)溶液配制精密稱(chēng)取奧氮平對(duì)照品與喹硫平對(duì)照品各1mg，分別置于10mL量瓶，加甲醇溶解并定容，得到質(zhì)量濃度為 01mg/mL的對(duì)照品溶液置冰箱4℃保存。臨用時(shí)用甲醇稀釋成所需濃度的奧氮平與喹硫平對(duì)照品溶液。精密配制濃度為 2mg/L阿米替林甲醇溶液作為工作內(nèi)標(biāo)液。

23樣品處理方法取含奧氮平和喹硫平的血清樣品1mL，加內(nèi)標(biāo)10μL（2mg/L阿米替林），并加入25%維生素C溶液10μL及10mol/L氫氧化鈉溶液02mL，快速震蕩數(shù)秒。加入乙醚4mL提取，在旋渦混合器上渦旋2min，靜置1h，取出醚層，置尖底試管中，于30℃水浴至干。殘?jiān)?00μL流動(dòng)相復(fù)溶，取20μL進(jìn)樣分析。

24色譜分離情況在本實(shí)驗(yàn)條件下，空白血清、奧氮平與喹硫平對(duì)照品血清，以及精神病患者服藥后的血清樣品，經(jīng)高效液相色譜分析法測(cè)定，得到的色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可知，奧氮平、喹硫平和阿米替林內(nèi)標(biāo)物的色譜峰能夠完全分離。奧氮平、阿米替林和喹硫平的保留時(shí)間為47min、58min、83min。

25標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備在7個(gè)具塞的離心管中分別加入空白血清10mL，再分別加入不同濃度、相同體積的奧氮平和喹硫平對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)物阿米替林，振蕩數(shù)秒，使血清奧氮平濃度分別為10、20、40、80、100、125、250μg/L，喹硫平為50、100、200、400、500、800、1000μg/L。然后按照“23”項(xiàng)處理后，經(jīng)高效液相色譜分析，測(cè)得奧氮平和喹硫平峰面積 （Ai）， 內(nèi)標(biāo)物峰面積As， 以Ai/As比值為橫坐標(biāo)，以血清樣品所對(duì)應(yīng)其各點(diǎn)濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)最小二乘法線性回歸，得到奧氮平10～250μg，喹硫平50～1000μg范圍的血清濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。奧氮平的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為C=03117Ai/As-32145 （r=09972），喹硫平的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為C=02066Ai/As+21861 （r=09995）。當(dāng)信噪比（S/N）=3時(shí)，奧氮平與喹硫平的檢測(cè)定量下限可達(dá)到5μg/L。

26回收率與精密度實(shí)驗(yàn)取奧氮平質(zhì)量濃度為10、80、250μg/L的含藥血清樣品，喹硫平質(zhì)量濃度為50、400、800μg/L的血清樣品，經(jīng)色譜分析，得到的相對(duì)回收率均大于90%。同時(shí)在1d內(nèi)重復(fù)5次和2周內(nèi)重復(fù)5次測(cè)定濃度，計(jì)算日內(nèi)、日間誤差和回收率。結(jié)果表明，該方法符合生物樣品分析要求。見(jiàn)表1。

27[JP+1]穩(wěn)定性試驗(yàn)按“23”項(xiàng)下方法配制奧氮平質(zhì)量濃度為10、80、250μg/L，喹硫平質(zhì)量濃度為 50、400、800μg/L的血清樣品共18份（1式3份），分別考察室溫放置4h、4℃冰箱放置24h、-20℃冰箱凍存1周后的穩(wěn)定性，分別進(jìn)行色譜分析。結(jié)果未見(jiàn)凍存樣品的藥物降解，RSD均<15%。[JP]

28樣品的質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)按照“23”項(xiàng)的方法分別配置奧氮平（10、80、250μg/L）和喹硫平（50、400、800μg/L）血清樣品共36個(gè)血清樣品（1式6份），置于-20℃凍存?zhèn)溆脼橘|(zhì)控樣品。每次檢測(cè)血樣時(shí)同時(shí)檢測(cè)質(zhì)控樣品，如果相對(duì)回收率均落在85%～115%之內(nèi)即可認(rèn)為檢測(cè)正常，否則須檢查整個(gè)操作過(guò)程及儀器原因。

29患者血樣測(cè)定1例男性精神病患者，口服奧氮平15mg/d和喹硫平400mg/d。2周后早晨服藥前空腹采血檢測(cè)其血清藥物濃度。結(jié)果奧氮平為613μg/L，喹硫平為3102μg/L。

3討論

奧氮平和喹硫平結(jié)構(gòu)中都有苯環(huán)，紫外吸收明顯。奧氮平與喹硫平對(duì)照品溶液在190～400nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)喹硫平和奧氮平在254nm處均有強(qiáng)吸收峰，因此本實(shí)驗(yàn)選擇254nm作為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)考察了不同柱溫（25～40℃）、不同流速 （08～15 mL/min）、不同pH磷酸鹽緩沖液（40、60、686）的流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果表明柱溫為40℃、流速為10mL/min、流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖溶液（pH60）-乙腈（65∶35）時(shí)，柱效較高，主藥峰與雜質(zhì)峰能夠有效地分離。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分別使用乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷為提取劑，發(fā)現(xiàn)乙醚的提取率最高，所取血清1mL，進(jìn)樣量20μL可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，提高了靈敏度，避免樣品雜質(zhì)的干擾，可達(dá)到分析目的。奧氮平在儲(chǔ)存和提取中易被空氣氧化，因此加入維生素C作為抗氧劑。

奧氮平和喹硫平血藥濃度具有治療窗窄、個(gè)體差異大等特點(diǎn)，因此進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)是必要的[9]。單獨(dú)檢測(cè)奧氮平和喹硫平藥物血藥濃度已有報(bào)道[6-8]，但還未見(jiàn)使用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定這兩種藥物的報(bào)道。實(shí)驗(yàn)建立了人血清中奧氮平和喹硫平同時(shí)測(cè)定的方法，準(zhǔn)確、靈敏并能滿(mǎn)足臨床需要，可以用于臨床藥物監(jiān)測(cè)。

參考文獻(xiàn)

[1]GOBBI G， COMAI S， DEBONNEL G.Effects of quetiapine and olanzapine in patients with psychosis and violent behavior： a pilot randomized， open-label， comparative study[J].Neuropsychiatr Dis Treat， 2014 （10）：757-765.

[2]袁道瑞，張向榮，陸蓉，等. 精神分裂癥患者血脂水平對(duì)奧氮平血漿藥物濃度的影響[J].四川精神衛(wèi)生，2015（4）：310-313.

[3]PLOSKER GL.Quetiapine： a pharmacoeconomic review of its use in bipolar disorder[J].Pharmacoeconomics， 2012 ， 30（7）：611-631.

[4]張靜，閩國(guó)慶. 奧氮平聯(lián)合富馬酸喹硫平治療精神分裂癥的臨床觀察[J]. 中國(guó)藥房，2016 （9）： 1173-1176.

[5]付永強(qiáng).奧氮平聯(lián)合富馬酸喹硫平治療精神分裂癥的療效觀察[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2017， 30（2）.

[6]ZHENG Q， WANG F， LI H， et al.Quantitative analysis of olanzapine in rat brain microdialysates by HPLC-MS/MS coupled with column-switching technique[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci， 2012（905）：127-132.

[7]李文標(biāo)，王傳躍，翟屹民，等.國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口奧氮平片的人體藥動(dòng)學(xué)及生物等效性[J]. 中國(guó)新藥雜志，2005，14（5）： 599-602.

[8]李坤艷，李煥德. HPLC-MS/ESI～+測(cè)定人血漿中喹硫平及其代謝產(chǎn)物[J]. 中南藥學(xué)，2006， 4 （2）： 88-91.

[9]HIEMKE C， BAUMANN P， BERGEMANN N， et al. AGNP Consensus Guidelines for Therapeutic Drug Monitoring in Psychiatry： Update 2011[J]. Pharmacopsychiatry， 2011， 44（6）： 195.

（收稿日期：2017-04-01編輯：梁志慶）