陳江濤　李健　潘雪峰

[摘要]目的 研究赤道幾內(nèi)亞比奧科島（Bioko Island）惡性瘧原蟲分離株裂殖子表面蛋白1（PfMSP-1）基因和裂殖子表面蛋白2（PfMSP-2）基因分型。方法 從比奧科島采集瘧疾患者血樣181份，用顯微鏡法和熒光定量PCR鑒定蟲種。采用巢式PCR分別擴(kuò)增PfMSP-1和PfMSP-2中具有型特異性的片段，進(jìn)行等位基因分型。結(jié)果 PfMSP-1基因分型：181份惡性瘧患者血樣中有178份擴(kuò)增出PfMSP-1基因片段（98.34%），其中K1、MAD20和RO33基因型片段分別為171份（94.48%）、175份（96.69%）和126份（69.61%）?；旌细腥韭蕿?7.24%；PfMSP-2基因分型：181份血樣中有173份PfMSP-2基因片段（95.58%），其中48份（26.52%）單獨擴(kuò)增到3D7型基因片段，4份（2.21%）單獨擴(kuò)增到FC27 型基因片段，混合感染率為66.85%。結(jié)論 赤道幾內(nèi)亞比奧科島PfMSP-1和PfMSP-2等位基因型分布范圍極廣?；旌细腥臼潜葕W科島瘧疾的主要類型。

[關(guān)鍵詞]惡性瘧原蟲；裂殖子表面蛋白1；裂殖子表面蛋白2；比奧科島

[中圖分類號] R382.3+1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）05（a）-0009-04

[Abstract]Objective To study the type of Plasmodium falciparum MSP-1 （PfMSP-1） and PfMSP-2 gene in Bioko Island of Equatorial Guinea.Methods 181 blood samples were collected from patients with malaria in Bioko Island.Microscopy and fluorescence quantitative PCR were used to identify the insect species.Nested PCR was used to amplify the specific fragment of PfMSP-1 and PfMSP-2 respectively，then the allele typing was conducted.Results PfMSP-1 genotypes：178 （98.34%） PfMSP-1 gene fragments were amplified from the 181 blood samples.MAD20-type，K1-type and RO33-type alleles were obtained from 171 （94.48%），175 （96.69%） and 126 （69.61%） samples respectively.The mixed infection rate was 97.24%.PfMSP-2 genotypes：173 （95.58%） PfMSP-2 gene fragments were amplified from the 181 blood samples of patients.Single 3D7-type and single FC27-type alleles were obtained in 8 （26.52%） and 4 （2.21%） samples respectively.The mixed infection rate was 66.85%.Conclusion PfMSP-1 and PfMSP-2 from Bioko Island are widespread.Mixed infection is the main type of malaria in Bioko Island.

[Key words]Plasmodium falciparum；Merozoite surface protein-1；Merozoite surface protein-2；Bioko Island

瘧疾是嚴(yán)重危害人類健康和影響經(jīng)濟(jì)發(fā)展的蟲媒傳染病，在熱帶、亞熱帶以及溫帶部分地區(qū)廣泛流行。瘧疾主要分布于非洲的撒哈拉沙漠以南地區(qū)、東南亞以及加勒比海地區(qū)[1]。全世界每年約有2億瘧疾新發(fā)病例，導(dǎo)致約50萬人死亡。非州中部的赤道幾內(nèi)亞共和國是全球瘧疾感染最為嚴(yán)重的地區(qū)之一，該國絕大多數(shù)的瘧疾病例是由惡性原蟲感染導(dǎo)致的[2]。近五年來，盡管赤道幾內(nèi)亞的衛(wèi)生部門實施了強(qiáng)有力的瘧疾防控計劃，但該地區(qū)的瘧疾患病率仍然居高不下[3]。瘧原蟲的基因多態(tài)性是造成該地區(qū)防控措施進(jìn)展緩慢的主要障礙之一[3]，因此，迫切需要我們?nèi)チ私鈵盒辕懺x的臨床分離株的基因多樣性。

惡性瘧原蟲裂殖子表面蛋白1（PfMSP-1）和2（PfMSP-2）是瘧原蟲裂殖子表面蛋白家族中的兩個重要成員[4]，同時也是瘧原蟲裂殖子表面的兩個非常重要的抗原，在瘧原蟲裂殖子侵襲紅細(xì)胞時發(fā)揮重要的作用[5]，并能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，并被認(rèn)為是極有希望發(fā)展出無性紅內(nèi)期重要的候選疫苗的組分[5-6]，因此用PfMSP-1和PfMSP-2作為分子標(biāo)記，在瘧疾分子流行病學(xué)研究上具有重要價值。一直以來，世界各地研究人員對PfMSP-1和PfMSP-2的基因多態(tài)性做了許多研究[5，7-8]，但目前未見任何關(guān)于赤道幾內(nèi)亞惡性瘧原蟲種群的MSP1和MSP2基因做了分型研究，為了解該島惡性瘧原蟲蟲株的基因類型和瘧疾的分子流行病學(xué)研究和針對性的疫苗制備提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1血液樣本

2011年1月～2014年12月，從赤道幾內(nèi)亞比奧科島不同地區(qū)就診于馬拉博地區(qū)醫(yī)院和地區(qū)診斷性診所的患者中總共收集了181份惡性瘧原蟲感染血液樣本。該研究得到馬拉博地區(qū)醫(yī)院（Malabo Regional Hospital）倫理委員會同意，同時取得每例患者的知情同意。

1.2 瘧原蟲的鑒別和蟲密度計算

采用WHO推薦的白細(xì)胞瘧原蟲計數(shù)法，在油鏡下對吉姆沙染色后血涂片進(jìn)行鏡檢。按照本實驗室以往建立定量PCR及熔解曲線的方法進(jìn)行蟲種鑒定[9]，同時以四種瘧原蟲（間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、惡性瘧原蟲）的質(zhì)粒為參照物。

1.3基因組DNA（gDNA）的提取

寄生蟲的gDNA由利用Chelex-100提取方法[9]。用打孔器取直徑5 mm干血斑，置于1.5 ml離心管，先加入l ml的無菌水浸泡2 h，然后16 000 r/min，離心5 min，棄上清；再加160 μl的5% 的Chelex-100混懸液，56℃加熱2 h，95℃變性8 min，振蕩30 s，16 000 r/min，離心5 min，吸取上清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PfMSP-1和PfMSP-2基因的分型

按照PlasmoDB（http：//plasmodb.org），基因ID為PF3D7_0930300 and PF3D7_0206800的PfMSP-1和PfMSP-2序列合成各自的巢式PCR引物（表1）[10]。根據(jù)PfMSP-1基因2、3區(qū)重復(fù)序列數(shù)量和毗連序列類型的差異，可分為K1，RO33，MAD20三個基因型；根據(jù)PfMSP-2基因3區(qū)的部分片段，可分為3D7和FC27兩個基因型。首先使用公用外部引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，接下來使用匹配于PfMSP-1三個基因型和PfMSP-2兩個基因型的特異性引物分別進(jìn)行擴(kuò)增。第1次擴(kuò)增反應(yīng)用2 μl上述制備的DNA 作模板，第2次擴(kuò)增反應(yīng)用2 μl 第1次的反應(yīng)產(chǎn)物作模板，其反應(yīng)體系總體積為50 μl，其中含DNA模板2 μl，20 pmol/μl上下游引物各1 μl，1 μl的Taq聚合酶（東盛生物技術(shù)公司，廣州）、10×Buffer（Mg2+Plus）5 μl、dNTP Mixture（各2.5 nm）4 μl、水36 μl；在伯樂Mini MJ PCR儀上進(jìn)行試驗，PCR反應(yīng)條件如下：95℃變性3 min，93℃ 30 s-52℃ 30 s-72 ℃延伸 1 min（35個循環(huán)）；72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取10 μl PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖電泳和EB染色后，用紫外分析儀觀察結(jié)果并拍照。PCR產(chǎn)物的大小根據(jù)25～700 bp的DNA Marker（東盛生物技術(shù)公司，廣州）進(jìn)行估算，PCR產(chǎn)物之間長度≥20 bp劃分為不同基因類別。

2 結(jié)果

2.1 PfMSP-1基因分型結(jié)果

181份惡性瘧疾患者的血樣經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增PfMSP-1基因片段，陽性結(jié)果178份（98.34%）（表2），其中K1等位株171份（94.48%），基因片段在100～320 bp，以120～200 bp的基因片段占優(yōu)勢地位；MAD20等位基因型175份（96.69%），基因片段在100～280 bp，以120～180 bp的等位基因片段占優(yōu)勢地位；RO33等位基因型126份（69.61%），基因片段在140～520 bp，以140～160 bp的基因片段占優(yōu)勢地位。由此可見，K1和MAD20基因型蟲株為比奧科島的優(yōu)勢蟲株。從表可見，大多數(shù)患者為多基因型蟲株混合感染，混合感染率為97.24%。僅有1.10% （2/181）的樣本為單獨MAD20基因型蟲株感染，未發(fā)現(xiàn)單獨感染K1和RO33的等位基因型蟲株的樣本。

2.2 PfMSP-2基因分型結(jié)果

181份的血樣惡性瘧疾患者的血樣中的173份用上述等位基因特異性引物經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增得到PfMSP-2基因片段（表2），屬于單獨3D7等位基因型感染48份（26.52%）， 片段長度在200～330 bp，單獨FC27等位基因型感染4份（2.21%），基因片段長度在330～500 bp?？梢?D7型蟲株為該島優(yōu)勢蟲株。其余121份血樣同時擴(kuò)增出兩種不同等位基因型的基因片段， 混合感染率為66.85 %。

3 討論

某一地區(qū)惡性瘧原蟲種株的基因分型及變異程度與患者的年齡、遺傳特性有一定的關(guān)系，也與瘧疾疫苗的效果評價密切相關(guān)[4]，因此，惡性瘧原蟲的基因分型是近年來國際上的研究熱點。PfMSP-1和PfMSP-2作為瘧原蟲裂殖子表面蛋白家族中的兩個重要成員，參與瘧原蟲裂殖子入侵紅細(xì)胞的過程， 同時能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答效應(yīng)，因此，對其進(jìn)行分型研究具有重要意義。

本研究通過對中非地區(qū)赤道幾內(nèi)亞共和國的比奧科島惡性瘧原蟲的種群進(jìn)行MSP-1和MSP-2基因的分型研究，結(jié)果表明比奧科島惡性瘧原蟲種群分別有26種MSP-1和42種MSP-2的等位基因型存在。這明顯高于其中非鄰國的報道，如Aubouy等[10]報道的加蓬存在25種PfMSP-1等位基因型和19種PfMSP-2等位基因型；Mayengue 等[11]報道剛果存在15種PfMSP-1等位基因型和20種PfMSP-2等位基因型；Dolmazon等[12]報道的中非共和國（CAR）的17種PfMSP-1等位基因型和25種PfMSP-2等位基因型。

比奧科島的惡性瘧原蟲種群的MSP-2基因存在兩種類型，即3D7等位基因型和FC27等位基因型，它們分別擴(kuò)增出22和20種基因片段。與其他中非鄰國相比，3D7等位基因型在加蓬報道了8種[10]，剛果共和國的布拉柴維爾發(fā)現(xiàn)了10種[11]，在中非的班基發(fā)現(xiàn)了11種[12]。FC27等位基因分別在加蓬[10]、剛果共和國的布拉柴維爾[11]、中非的班基[12]發(fā)現(xiàn)了11、10、11種，因此，赤道幾內(nèi)亞的PfMSP-2的多態(tài)性明顯高于其他的中非國家；本研究亦發(fā)現(xiàn)比奧科島惡性瘧原蟲種群的MSP-1的K1、MAD20和RO33基因分別有9、9和8個基因片段，K1和MAD20等位基因家族是主要的基因型，與中非的加蓬[10，13]、尼日利亞[14]、喀麥隆[15]的研究一致。

以往的瘧原蟲遺傳多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，全球許多地區(qū)存在很大比例的多種惡性瘧原蟲株、型流行，而同一地區(qū)的惡性瘧原蟲基因多樣性及多重感染的流行程度與當(dāng)?shù)丿懠驳牧餍兴矫芮邢嚓P(guān)[4]，諸如該地區(qū)的傳播媒介的種群結(jié)構(gòu)、人類宿主、昆蟲接種率以及對抗瘧藥敏感性等的差異，在一定程度上對惡性瘧原蟲種群結(jié)構(gòu)都產(chǎn)生了巨大影響。本研究發(fā)現(xiàn)了，伴隨著當(dāng)?shù)豍fMSP-1和PfMSP-2各等位基因的高度復(fù)雜多樣性，多重感染的比例也相當(dāng)之高，這個發(fā)現(xiàn)與以往在伊朗的報道一致[16]。該島惡性瘧原蟲的PfMSP-1等位基因型的混合感染率高達(dá)97.24%，PfMSP-2等位基因型的混合感染率也高達(dá)66.85 %，提示在當(dāng)?shù)亟⑷姹O(jiān)測耐藥性的基礎(chǔ)上系統(tǒng)地探究瘧原蟲種群的流行病學(xué)特征，對制定該地區(qū)瘧疾預(yù)防和殺滅對策是至關(guān)重要的。同時也提醒了我們，在瘧原蟲分子流行病學(xué)的研究中只用一種分子標(biāo)記得出的結(jié)果并不是很可靠的，研究中同時使用兩種以上的分子標(biāo)記可獲得更加有用和準(zhǔn)確的信息。

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（收稿日期：2017-04-14 本文編輯：許俊琴）